任泓安,孫 樂,王曉群,4,譚 韜

(1.昆明理工大學(xué) 非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,云南 昆明 650500;2.中國科學(xué)院生物物理研究所 腦與認(rèn)知國家重點實驗室,北京 100101;3.首都醫(yī)科大學(xué) 北京腦重大疾病研究院,北京 100069;4.北京師范大學(xué) IDG/麥戈文腦科學(xué)研究院 認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)與學(xué)習(xí)國家重點實驗室,北京 100875)

0 引 言

大腦是一個高度復(fù)雜的系統(tǒng).19世紀(jì)末,Ramon Cajal提出神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本單位.神經(jīng)元種類多樣,數(shù)量巨大,人腦中約有860億個神經(jīng)元[1]通過突觸連接傳遞信息,也正是神經(jīng)元高度復(fù)雜的連接及其特有的信息處理方式造就了非凡的大腦.認(rèn)識神經(jīng)元的連接對于解析腦功能至關(guān)重要.

目前神經(jīng)元的連接主要從宏觀、介觀和微觀三個尺度[2]來進行研究,不同空間尺度的測量對于全面了解連接組是各有優(yōu)勢,且相互補充.宏觀連接組學(xué)(Macro-connectomics),分辨率在毫米級,主要基于磁共振成像技術(shù)來進行連接組的繪制,核磁的一大優(yōu)勢是以非侵入的方式進行成像,可以無創(chuàng)測量人的大腦不同區(qū)域之間的連接[3].磁共振的局限是時間和空間分辨率較低,無法清晰地描繪局部環(huán)路的連接.介觀連接組學(xué)(Meso-connectomics),分辨率在微米級,主要利用病毒或者蛋白標(biāo)記需要示蹤的神經(jīng)元,利用光學(xué)成像技術(shù)追蹤神經(jīng)元的投射.從介觀水平既可以研究跨腦區(qū)的連接,又可以研究局部環(huán)路的連接.雖然利用病毒稀疏跨突觸標(biāo)記或者膜片鉗技術(shù)可以記錄到介觀水平的神經(jīng)元形態(tài)以及連接,但介觀難以發(fā)現(xiàn)微觀水平上存在的連接細(xì)節(jié),如無法記錄到突觸后連接精細(xì)的亞水平結(jié)構(gòu).并且介觀水平的分辨率受到光學(xué)成像的限制,對突觸連接的判斷存在一定程度的干擾.所以,微觀連接組學(xué)(Micro-connectomics)應(yīng)運而生,分辨率在納米級,主要利用電鏡技術(shù)來獲取納米分辨率下的神經(jīng)元,在局部環(huán)路研究上具有非常大的優(yōu)勢.

大腦的連接不僅是腦區(qū)之間的信號傳遞,在腦認(rèn)知研究中最關(guān)鍵的是皮層密集連接,以及如何對不同來源的信號進一步處理.不管是何種尺度的研究,想要進一步理解神經(jīng)元的連接架構(gòu),都需要從結(jié)構(gòu)和功能的角度來全面認(rèn)識神經(jīng)環(huán)路.現(xiàn)有的一些研究未將結(jié)構(gòu)和功能很好地結(jié)合起來,例如從電鏡角度研究神經(jīng)元大多數(shù)都只包含了結(jié)構(gòu)信息,而沒有神經(jīng)元連接的功能信息[4-5].現(xiàn)有的研究也缺乏對皮層細(xì)胞亞類之間的聯(lián)系和突觸連接功能屬性的完整描述[6].本文將從小鼠和靈長類皮層的局部環(huán)路出發(fā),從微觀尺度結(jié)合結(jié)構(gòu)和功能的研究來討論皮層局部神經(jīng)環(huán)路的連接.突觸連接不是一個靜態(tài)的連接,并且連接強度也是不斷變化著的,同時受到突觸前后各類神經(jīng)元活動的精細(xì)調(diào)節(jié).了解神經(jīng)連接的底層框架以及如何實現(xiàn)特定計算,有助于啟發(fā)類腦智能研究.

1 微觀水平上局部環(huán)路的神經(jīng)結(jié)構(gòu)

早在1986年,White等[7]第一次利用電子顯微鏡繪制出線蟲全部的神經(jīng)以及數(shù)千個突觸連接.在2019年,Cook等[8]在線蟲中利用連續(xù)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了比以往更多的突觸連接,神經(jīng)元投射位點,并間接測量出連接強度.但相對于更大體積的腦來說,目前的電鏡技術(shù)重構(gòu)出小鼠和靈長類全腦的連接組還是存在一定的困難.最近美國腦計劃2.0[9]提出未來將繪制出哺乳動物全腦的微觀水平神經(jīng)連接,但目前的研究更多的是利用電鏡重構(gòu)出小鼠以及靈長類皮層的局部環(huán)路[10-11].在微觀水平上,局部環(huán)路的結(jié)構(gòu)可通過電鏡對神經(jīng)元類型進行較為基礎(chǔ)的分類,對微觀結(jié)構(gòu)以及連接結(jié)構(gòu),連接偏好性有較為細(xì)致的研究,并間接推測連接強度.

1.1 基于微觀結(jié)構(gòu)對神經(jīng)元類型的劃分

在局部環(huán)路的研究中,神經(jīng)元的類型區(qū)分是較為基礎(chǔ)的一步,雖然根據(jù)電生理特征、形態(tài)學(xué)、蛋白表達以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息可以對神經(jīng)元進行較為細(xì)致的分類,但單純在電鏡水平還不能夠?qū)γ恳粋€神經(jīng)元進行細(xì)致的劃分.目前大多的電鏡數(shù)據(jù)是在無特異性分子標(biāo)記情況下,根據(jù)電鏡下神經(jīng)元形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)對神經(jīng)元進行分類[12-13],例如錐體神經(jīng)元,軸突始端指向白質(zhì),以及存在樹突棘[14];抑制性神經(jīng)元胞體較大,且含有大量線粒體,軸突起源于樹突;而非神經(jīng)細(xì)胞,細(xì)胞體積小且細(xì)胞核的形態(tài)也不同[15].在分類的基礎(chǔ)上,統(tǒng)計不同物種之間神經(jīng)元類型的占比,發(fā)現(xiàn)存在著較大差異.與嚙齒動物相比,人腦皮層中存在更多的膠質(zhì)細(xì)胞[16],更多比例的抑制性神經(jīng)元,獼猴和人類皮層抑制神經(jīng)元占比與小鼠相比擴大了約2.5倍[15],導(dǎo)致連接組合的復(fù)雜度進一步提升.

1.2 局部環(huán)路中的連接偏好性

有了興奮和抑制神經(jīng)元的劃分,就可以進一步研究環(huán)路連接偏好性.在最近,人的皮層研究中首次發(fā)現(xiàn),在軸突距離胞體不同路徑長度下,存在突觸連接偏好性[15].如錐體神經(jīng)元遠(yuǎn)端軸突投射偏好于興奮性神經(jīng)元的樹突棘,近端軸突投射偏好于抑制性神經(jīng)元的樹突軸.另外,靈長類動物皮層中還存在錐體神經(jīng)元軸突往興奮性神經(jīng)元樹突軸投射,而小鼠中卻不存在這樣的連接偏好[17].神經(jīng)元類型的占比和突觸連接偏好性綜合起來考慮,可進一步整合局部環(huán)路連接架構(gòu).轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18-19]和電鏡數(shù)據(jù)均提示人類皮層中抑制性神經(jīng)元占比相對于小鼠多,電鏡下雙極細(xì)胞比小鼠多了一倍,并且雙極細(xì)胞突觸偏好性主要接受抑制性輸入,進一步提示人類皮層接受更多的抑制到抑制的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入[15],這也是從小鼠皮層到人類皮層的一個關(guān)鍵變化.并且在不同發(fā)育時期的小鼠皮層中發(fā)現(xiàn),連接方式、連接密度還有突觸選擇偏好性上還存在著較大差異[17].對不同時期神經(jīng)元連接形成過程,偏好選擇過程提供了新的見解.通過測量突觸后密度(Postsynaptic Density,PSD)[13]面積來測量突觸大小,與突觸前囊泡的數(shù)量成正比[20],并且可間接推測突觸強度[21-23].

電鏡可以在結(jié)構(gòu)上對神經(jīng)元的形態(tài)和連接提供一個極高的分辨率,使得我們對接連結(jié)構(gòu),連接偏好,連接密度有更加準(zhǔn)確的認(rèn)識,而無法直觀獲得神經(jīng)元連接強度、可塑性變化等相關(guān)信息.

2 電生理對突觸連接功能的研究

電生理的優(yōu)勢,可以非常準(zhǔn)確地記錄到電信號.常用的電生理方法可分為胞外記錄和胞內(nèi)記錄.胞外記錄可以被用來檢測單細(xì)胞電活動以及局部場電位.例如探索局部環(huán)路中一群神經(jīng)元如何編碼處理信息,可利用多電極陣列(Multi-Electrode Array,MEA)來同時記錄多個神經(jīng)元的電活動.多電極陣列記錄到的是局部群體細(xì)胞的電活動,在單細(xì)胞水平上的連接還存在較大的局限.而胞內(nèi)記錄保證了對電信號更高的敏感度和信噪比,從而獲得突觸傳遞機制.

2.1 膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)環(huán)路連接

自從膜片鉗技術(shù)應(yīng)用以來,越來越多的人開始利用這一技術(shù)研究神經(jīng)元突觸的連接,從單個細(xì)胞的全細(xì)胞記錄,到兩個細(xì)胞同時的全細(xì)胞記錄[24-25],到現(xiàn)在更多的8個細(xì)胞的同時記錄[26].從記錄神經(jīng)元的形態(tài)和電生理特性,到突觸電生理特性,到發(fā)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路特定模式.雖然膜片鉗已經(jīng)有幾十年的歷史,但仍然是目前研究神經(jīng)功能強有力的工具.另外光遺傳技術(shù)和膜片鉗技術(shù)的結(jié)合[27],也可以用來研究局部環(huán)路的連接.對于局部環(huán)路微電路的功能研究,多通道膜片鉗(Multiple whole-cell patch-clamp recording)與其他方法相比仍然是金標(biāo)準(zhǔn)[28-29].因為其亞毫秒和亞皮安的分辨率,可記錄神經(jīng)元的形態(tài)和電生理特征,使得研究局部環(huán)路中連接概率、連接強度、可塑性和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成為可能[30-32].

電生理相對于電鏡來說,有其獨特的優(yōu)勢.可以結(jié)合遺傳標(biāo)記或者轉(zhuǎn)錄組學(xué),對神經(jīng)元亞類類型進行進一步劃分,并且把亞類的介觀或者超分辨形態(tài)與電生理相結(jié)合,得到每種神經(jīng)元對應(yīng)的電生理特征與屬性.根據(jù)蛋白表達、形態(tài)和電生理特征,已經(jīng)鑒定出十多種γ-氨基丁酸能(GABA)抑制性神經(jīng)元亞型[33-38].并且經(jīng)過大樣本量的膜片鉗記錄,可以對某種亞類的神經(jīng)元的占比進行統(tǒng)計,例如:成年小鼠視皮層V1的Martinotti cell在L2/3層占其他抑制性神經(jīng)元的11%,在L5層占32%[39-40].

2.2 多通道膜片鉗揭示局部環(huán)路連接模式與功能

多通道膜片鉗技術(shù)的優(yōu)勢在于不但可以獲得細(xì)胞介觀的形態(tài)和電生理特征,而且還能直接獲取神經(jīng)元之間的連接信息和突觸連接可塑性動態(tài)變化的信息.所以,在局部環(huán)路的研究上,多通道膜片鉗技術(shù)具有極大的技術(shù)優(yōu)勢,這是其他電生理技術(shù)無法直接替代的.

在介觀形態(tài)和電生理的記錄中,更多反應(yīng)的是細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)和內(nèi)在的電生理特性,神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)特征決定了它投射的區(qū)域位置,以及下游可能連接某些腦區(qū)的特定細(xì)胞類型.不僅形態(tài)決定神經(jīng)元的投射以及下游可能存在的連接,神經(jīng)元的電生理和形態(tài)特征的進一步結(jié)合可以對神經(jīng)元類型進行初步分類,判斷神經(jīng)元屬于興奮還是抑制類神經(jīng)元,并在后期連接中進一步對神經(jīng)元進行分類,從而有可能進一步考慮興奮與興奮的連接概率,興奮到抑制的概率,抑制到興奮的概率以及抑制到抑制的連接概率.另外,神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)特征也有助于建立起何種形態(tài)的神經(jīng)元傾向于形成哪些特殊類型的連接.例如L2/3的神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞(Neurogliaform Cell,NGC)更傾向于在胞體周圍投射,形成卷曲樣的球形結(jié)構(gòu),這種類型的神經(jīng)元在連接記錄中發(fā)現(xiàn)會存在較長的延遲時間[39].這些介觀形態(tài)和電生理特征都是在多通道膜片鉗中可以記錄到.

除了可以研究神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和內(nèi)在電生理特性,多通道膜片鉗強大的技術(shù)優(yōu)勢是對突觸連接以及突觸連接功能的進一步研究.雖然皮層中每種神經(jīng)元都有特定的連接模式,在不同層以及不同類型的細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)存在一些簡單的連接模式和連接規(guī)則,基于多通道膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)抑制性神經(jīng)元可劃分為三種連接模式[39]:1)非特異性連接.此類細(xì)胞與突觸后各類細(xì)胞的連接概率接近,幾乎沒有連接偏好.2)抑制性連接偏好.這類神經(jīng)元絕大部分投射抑制性神經(jīng)元,幾乎不投射興奮性神經(jīng)元.如: 雙極細(xì)胞(Bipolar Cells,BPC)等,與電鏡下雙極細(xì)胞結(jié)果一致[15].3)最后一類主要往興奮性神經(jīng)元投射.研究發(fā)現(xiàn),淺層的連接概率高于深層,并且隨著蛋白特異性標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)合多通道膜片鉗大規(guī)模的記錄(見圖1),也發(fā)現(xiàn)生長抑素(Somatostatin,Sst)和血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,Vip)表達的抑制性神經(jīng)元會產(chǎn)生與自身的連接,并且與小清蛋白(Parvalbumin,Pvalb)神經(jīng)元一起互相抑制[41],補充了以往突觸連接的模式[42-43].另外,還發(fā)現(xiàn)不同物種皮層的不同層中存在著細(xì)胞類型差異和連接差異.在人類中,隨著皮層深度的增加,細(xì)胞電生理特征的多樣性也隨之增加,而在小鼠中未觀察到,并且L4層的連接性低于小鼠,這是人類L4層特有的屬性[41].不僅如此,還在人皮層中觀察到多突觸連接.對于不同物種皮層微環(huán)路有了進一步的認(rèn)識.

圖1 多通道膜片鉗揭示皮層連接概率[41]Fig.1 Multiple whole-cell patch-clamp recording reveals cortical connection probability[41]

皮層的突觸連接不是一個靜態(tài)的環(huán)路系統(tǒng),大腦的運行是一個連續(xù)且不斷變化的過程,皮層環(huán)路神經(jīng)元反應(yīng)強度會根據(jù)活動的變化隨時改變,所以需要在靜態(tài)環(huán)路的基礎(chǔ)上考慮到突觸連接的可塑性,比如皮層中常見的短時程可塑性(Short-Term Plasticity,STP)(見圖2).并且在配對記錄以及多通道膜片鉗的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),興奮性動力學(xué)由突觸后神經(jīng)元類型決定[44-45],抑制性動力學(xué)取決于突觸前類型[46-47].人類皮層興奮性神經(jīng)元PSP(Postsynaptic Potentials,PSP)較大,且STP刺激后恢復(fù)的速度比小鼠快,也就意味著短時間內(nèi)信息傳遞的內(nèi)容可能會更多[41,48-49].

(a)Common motifs (b)Layer 2/3 (c)Layer 5 (d)Short-term plasticity圖2 多通道膜片鉗揭示皮層連接模式以及突觸可塑性[39-41]Fig.2 Multiple whole-cell patch-clamp recording reveals cortical circuit motif and synaptic plasticity[39-41]

所以,多通道膜片鉗技術(shù)是研究局部神經(jīng)環(huán)路強有力的工具,但仍然受限于技術(shù)操作水平的影響.最近也在不斷催生自動化多通道膜片鉗技術(shù)[29].除此之外,由于目前多通道膜片鉗技術(shù)基本都是在離體腦片中進行的,也會存在著神經(jīng)元連接在制備腦片時被切斷的情況.

3 結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)合對于神經(jīng)環(huán)路的研究

在海馬中發(fā)現(xiàn),突觸的長時程增強會誘導(dǎo)樹突棘的生長,并記錄到突觸后電流的增強[50],這表明突觸連接強度與超微結(jié)構(gòu)之間存在一定關(guān)系,尤其是 PSD 面積和樹突棘體積[51-52].后來在皮層中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[53].所以,連接組學(xué)的研究不僅僅停留在介觀層面或者功能層面,開始進一步轉(zhuǎn)為超微結(jié)構(gòu)和功能同時來研究連接組學(xué).

3.1 鈣成像與電鏡技術(shù)的結(jié)合

可用來研究神經(jīng)環(huán)路如何處理信息.利用鈣成像指示劑在細(xì)胞分辨水平上記錄局部區(qū)域神經(jīng)元電活動,可以與行為學(xué)結(jié)合,研究不同行為下的腦區(qū)電活動,從而觀察到神經(jīng)信號在不同類型細(xì)胞間的連接架構(gòu)與組織方式[54-56]、刺激強度與連接密度關(guān)系[57]、突觸大小分布和多突觸連接[58]等.巨大的優(yōu)勢就是在于在動物活體狀態(tài)下結(jié)合行為學(xué)進行腦區(qū)活動研究,但是局限也非常的明顯.對于電信號的靈敏度低,鈣離子熒光指示劑GCaMP6能夠檢測單個動作電位,但不能解析高頻率動作電位的發(fā)放.鈣成像技術(shù)用于神經(jīng)功能的研究尚存在一定的局限性.

3.2 電生理與電鏡技術(shù)的結(jié)合

可研究突觸大小和連接強度之間的線性關(guān)系,囊泡釋放模型等[59].從微觀的角度重新考慮,突觸在功能連接中所占有的生理權(quán)重.發(fā)現(xiàn)復(fù)雜形態(tài)PSD的突觸擁有更強的突觸峰值電流,并與PSD面積成正相關(guān).通過量子分析提示皮層中可能存在多囊泡釋放[59-61],給現(xiàn)有的釋放模型[62]提出新的挑戰(zhàn).

另外,特定類型神經(jīng)元的下游連接亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和突觸連接有特定的偏好性[63](見圖3),例如表達Pvalb的抑制性神經(jīng)元更偏向于支配下游的下游興奮性神經(jīng)元的胞體[37,64]等.不僅可以測得突觸連接精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息,還可以發(fā)現(xiàn)新的連接方式以及新的信號傳遞方式.發(fā)現(xiàn)抑制性神經(jīng)元Chandelier cell的軸突末端與錐體神經(jīng)元的軸突始端形成突觸連接[65](見圖3),并且在多通道膜片鉗中發(fā)現(xiàn)皮層中Chandelier Cell主要支配調(diào)控Chandelier Cell以及錐體神經(jīng)元這兩類細(xì)胞[39].另外,也通過這兩種技術(shù)的結(jié)合確定存在一種新的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞方式:體積傳輸(Volume transmission)[66],該結(jié)構(gòu)在電鏡下發(fā)現(xiàn)未形成傳統(tǒng)的突觸結(jié)構(gòu),但隨著神經(jīng)遞質(zhì)在組織間隙中釋放,可擴散至周圍的各類神經(jīng)元,并且這些神經(jīng)元在多通道膜片鉗下均可被同時記錄到抑制信號[39,67]. 膜片鉗與電鏡技術(shù)的結(jié)合,及其高分辨率和精細(xì)化的研究突觸連接功能與結(jié)構(gòu),為洞察神經(jīng)元連接方式與計算方式打開了一扇窗.

圖3 GABA 能抑制性中間神經(jīng)元的主要亞型及其突觸多樣性[63]Fig.3 GABAergic inhibitory interneurons and their synaptic diversity[63]

這些技術(shù)的結(jié)合,促進我們發(fā)現(xiàn)和理解皮層局部微環(huán)路的連接架構(gòu)與功能之間的關(guān)系.揭示不同皮層以及不同細(xì)胞類型之間連接的功能偏差,更好地理解認(rèn)知行為的環(huán)路連接.不僅如此,神經(jīng)元之間的連接擁有比想象中更復(fù)雜的計算.并且,已經(jīng)在目前已有的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上,模擬出皮層的架構(gòu)與運算規(guī)則,構(gòu)建出了一系列皮層局部環(huán)路計算模型[68-70].每一種模型都存在著一定的限制,隨著局部神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)與功能進一步的深入研究,模型也將一步優(yōu)化.

4 結(jié)語與展望

在皮層的局部環(huán)路研究中,我們可以發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類型、不同皮層狀態(tài)下,神經(jīng)元之間的連接架構(gòu)也是有差異的,并且受到各類細(xì)胞之間的精細(xì)調(diào)節(jié)以及協(xié)調(diào),在不同場景下,突觸連接的強度也不斷變化著.皮層環(huán)路連接的高度復(fù)雜需要我們進一步去深入了解.在了解過程中也會發(fā)現(xiàn)一些局限,在微觀水平上,毫米級的腦區(qū),就會產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)需要處理與分析,耗費大量人力物力,是微觀連接組學(xué)進展緩慢的重要原因.并且在多通道膜片鉗技術(shù)上,技術(shù)水平對科研工作者也提出了極高的要求.高通量的電鏡成像,以及自動化的數(shù)據(jù)處理,自動化的多通道膜片鉗技術(shù)也有望解決上述局限.

不僅僅是從結(jié)構(gòu)到功能,還需要從分子到細(xì)胞,不同空間尺度,不同組學(xué)的測量,這些對于認(rèn)識細(xì)胞研究大腦的連接組學(xué)都非常重要.目前依靠解剖學(xué)數(shù)據(jù)、電生理學(xué)、基因表達譜的手段在連接組已經(jīng)獲得了豐碩的成果,可進一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對神經(jīng)元亞類進行進一步細(xì)分,為繪制特定神經(jīng)元類型的連接組提供基礎(chǔ).另外,局部環(huán)路的神經(jīng)架構(gòu)的研究同樣啟發(fā)著我們對類腦智能的思考,不斷地刺激和推動類腦智能的發(fā)展.