史鑫成,張 園,何文程,陳明龍

(蘇州科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

0 引 言

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類典型的存在于水、土壤以及沉積物等環(huán)境介質(zhì)中的有機污染物,其能夠通過各種途徑進入人體,產(chǎn)生致癌、致畸和致突變性的“三致效應(yīng)”[1].此外,它分布廣泛且能夠在環(huán)境中持久存在.近年來,在全國各地,尤其是在長江三角洲、珠江三角洲及京津唐等經(jīng)濟較為發(fā)達的地區(qū),越來越多的土壤環(huán)境受到PAHs的污染[2].以位于長江三角洲的江蘇省來講,據(jù)Sun等[3]評估發(fā)現(xiàn),江蘇省農(nóng)田土壤中PAHs的平均濃度達到了 1.06 mg/kg,污染較為嚴重;特別是在經(jīng)濟發(fā)達的蘇州地區(qū):在張家港某鋼鐵廠周邊農(nóng)用地多環(huán)芳烴平均濃度為 6 130 μg/kg[4],吳江、吳中、相城三個市轄區(qū)農(nóng)用地中PAHs的平均濃度達到了 312.5 μg/kg[5].土壤中PAHs 污染的嚴重不單影響到了土壤自身生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與健康,還會通過食物鏈等多種途徑危害到人類的身體健康.因此,治理土壤中的PAHs已迫在眉睫,PAHs污染土壤的修復(fù)技術(shù)的發(fā)展完善始終是土壤環(huán)境技術(shù)領(lǐng)域的研究重點之一.

植物修復(fù)是一種低成本、操作簡便,主要用于清除土壤系統(tǒng)中有毒有害物質(zhì)的綠色修復(fù)技術(shù),這一技術(shù)通過植物根系改善土壤理化性狀;分泌多種酶類將污染物質(zhì)催化降解;植物吸收及遷移轉(zhuǎn)化等多種能力修復(fù)土壤環(huán)境[6].黑麥草因具有較強的耐受力和在污染土壤中較強的生長能力,因而被作為主要修復(fù)植物得到廣泛應(yīng)用.然而,由于土壤中PAHs的生物可利用性較低,黑麥草等植物修復(fù)的效率在短期內(nèi)往往有一定的局限[7].現(xiàn)階段,在強化黑麥草等植物修復(fù)PAHs污染土壤的方法中,主要有調(diào)節(jié)土壤碳氮比、投入PAHs專性降解菌(植物-微生物聯(lián)合修復(fù))、施加化學(xué)表面活性劑等措施[8].在上述強化技術(shù)中,表面活性劑的施加可以有效增溶土壤中的PAHs ,提高PAHs在土壤中的生物有效性.

生物表面活性劑[9]由于能提高難降解有機污染物在土壤中的生物有效性且本身不具有傳統(tǒng)化學(xué)表面活性的毒性[10]而被廣泛關(guān)注:槐糖脂、鼠李糖脂等微生物源生物表面活性劑已在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域取得了較好的修復(fù)成果[11-13],而對于植物源表面活性劑的卻相對涉及不多.皂角苷(又稱皂素,英文:Saponin)則是植物源生物表面活性劑中的典型的代表,在現(xiàn)有皂角苷應(yīng)用土壤修復(fù)研究中,應(yīng)用較多的也僅在重金屬污染領(lǐng)域[14-15],使用皂角苷強化黑麥草修復(fù)PAHs 污染土壤的研究報告同樣較為罕見.因此,本實驗選取菲、芘兩種典型PAHs模擬污染土壤,種植黑麥草,并施入植物源生物表面活性劑皂角苷,通過土壤中PAHs 的去除率、黑麥草生物量、黑麥草體內(nèi)酶活性和PAHs含量以及根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等研究評價其強化效果,為皂角苷等生物表面活性劑應(yīng)用于PAHs污染土壤修復(fù)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

原始土壤取自江蘇省太倉市璜涇鎮(zhèn)一處農(nóng)田荒地;皂角苷(BR,10%～25%,CMC值=50.1 mg/L),購于上海麥克林生化科技有限公司;菲(化學(xué)式C14H10、logKow=4.57、水溶解度 0.89 μg/L)和芘(化學(xué)式C16H20、logKow=5.18、水溶解度 0.14 μg/L),CAS號分別為85-01-8,129-00-0,購于上海麥克林生化科技有限公司.黑麥草種子購于宿遷妃里香花卉有限公司.

丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷均為色譜級,其他化學(xué)藥劑為分析純.

土壤污染步驟如下:將 50 mL 溶有一定菲和芘的丙酮溶液投入 5 kg 土壤中,不停攪拌,再加入 5 kg 土壤攪拌至充分均勻,待丙酮自然揮發(fā)后,按每次 10 kg 土壤投入,加水保持濕潤,充分攪拌,得到約 50 kg 污染土壤.之后置于避光處,老化1個月待用.測得菲和芘的含量分別為 23.03 mg/kg、26.6 mg/kg.

1.2 實驗設(shè)計

本實驗設(shè)置6個處理組,分別為:a.僅種植黑麥草的污染土壤(CK);b.種植黑麥草并添加 20 mg/kg 皂角苷(S20);c.種植黑麥草并添加 50 mg/kg 皂角苷(S50);d.種植黑麥草并添加 100 mg/kg 皂角苷(S100);e.種植黑麥草并添加 200 mg/kg 皂角苷(S200);f.種植黑麥草并添加 500 mg/kg 皂角苷(S500),每個處理組設(shè)置三個平行.

每個試驗盆中裝有供試土壤 1.5 kg,并按上述條件施入相應(yīng)濃度的皂角苷,黑麥草種子經(jīng)純水浸泡 12 h 后,每盆播下約60粒種子,待其出芽后,每盆留40株.盆栽試驗于2021年2月8日—2021年4月8日在溫室大棚中進行.

黑麥草于 60 d 后收獲,用去離子水洗凈后,一部分立即測定生理指標,一部分冷凍干燥后放入 -80 ℃ 冰箱保存;土壤樣品為根際土壤,采集后冷凍干燥,同樣放入 -80 ℃ 冰箱保存.

1.3 指標測定

1.3.1 黑麥草生物量測定方法

每個處理組選取一株黑麥草,整株采集,用去離子水將其洗凈,置于濾紙上待其吸干水分,在烘箱中 80 ℃ 烘至恒重,分別稱量植株地上部及地下部干重.

1.3.2 土壤及植物體內(nèi)PAHs測定方法

土壤中PAHs的提取方法采用二氯甲烷法[11,16]:取 1 g 土壤于 50 mL 離心管中,加入 10 mL 二氯甲烷溶液,超聲萃取 60 min.之后在 3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心 15 min,收集所有上清液(即萃取液).將萃取液氮吹濃縮至 3 mL,并使用填有 2.5 g 硅膠的層析柱將其凈化,用 15 mL 二氯甲烷和正己烷(1∶1)進行洗脫,收集洗脫液,并用氮吹吹至近干.再用 5 mL 甲醇定容,取 1 mL 過 0.22 μm 有機系濾膜,待測.

修復(fù)植物黑麥草中的PAHs的萃取方法[17]則是:取 1 g 植物樣品,剪碎混勻.放置于 50 mL 離心管中,分三次每次 10 mL 加入二氯甲烷和丙酮(1∶1)混合液,每次超聲萃取 30 min.收集萃取液后氮吹至干,之后用 2 mL 正己烷潤洗,取 l mL 過 2.5 g 硅膠柱(200～300目)凈化,加入 15 mL 正己烷和二氯甲烷(1∶1)混合液進行洗脫,收集洗脫液氮吹濃縮至近干,用 2 mL 甲醇定容,取 1 mL 過 0.22 μm 有機系濾膜,待測.

PAHs的測定使用高效液相色譜儀,其測試條件如下:色譜柱為AcclaimTM 120 C18 5 μm 120A(?4.6 mm×250 mm);流動相為色譜純甲醇和水(90/10);流速為 1 mL/min;柱溫為 30 ℃;進樣量為 10 μL,菲和芘的檢測波長分別為 254 nm 和 334 nm.

土壤中的PAHs的去除率η:

η=(C0-C60)/C0

式中:C0為第 0 d 土壤中多環(huán)芳烴的濃度(μg/kg);C60為修復(fù) 60 d 后土壤中多環(huán)芳烴的濃度(μg/kg).

植物對多環(huán)芳烴(菲、芘)的富集和轉(zhuǎn)運能力分別用生物濃縮系數(shù)(BCF)和運系數(shù)(TF)表示,兩者的具體公式如下:

BCF=Cp/Cs

式中:Cp為多環(huán)芳烴在植物體內(nèi)的濃度(μg/kg);Cs為多環(huán)芳烴在土壤中的濃度(μg/kg).

TF=Ca/Cu

式中:Ca為植物地上部分多環(huán)芳烴濃度(μg/kg);Cu為植物地下部分多環(huán)芳烴濃度(μg/kg).

1.3.3 植物抗氧化酶測定方法

植物的抗氧化酶活性參考課題組前人[18]的方法:丙二醇(MDA)采用硫代巴比妥酸法(TBA);超氧化物歧化酶(SOD)采用用氮藍四唑(NBT)法;過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)兩種酶活性的測定方法則采用試劑盒(CAT-2-W、POD-2-Y,蘇州科銘生物技術(shù)有限公司,中國).

1.3.4 土壤微生物群落的檢測

根據(jù)FastDNATMSPIN Kit(116540600,MP Biomedicals,美國)提供的實驗操作步驟,提取樣品的微生物基因組DNA.提取的DNA樣品送至北京諾禾致源科技進行測序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019和IBM SPSS 26對數(shù)據(jù)進行分析,對不同處理數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較,數(shù)據(jù)以(平均值±標準差)表示,顯著性水平設(shè)為0.05,用Origin 2021進行繪圖.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 皂角苷對土壤中PAHs的去除率的影響

注:字母不同代表組別之間有顯著性差異(P<0.05),誤差線代表3個重復(fù)樣品的標準偏差,下同.圖1 土壤中PAHs的去除率Fig.1 Removal rate of PAHs in soil

皂角苷的施入對土壤中PAHs的去除有著良好的去除效果:在不同濃度皂角苷施加下,土壤中多環(huán)芳烴的去除率見圖1.由圖1可見,未添加生物表面活性劑皂角苷的土壤(CK)對于菲、芘兩種多環(huán)芳烴的降解率分別是35.11%及21.65%.而隨著皂角苷濃度的增加,多環(huán)芳烴的降解率也在不斷提高:菲的去除率在皂角苷濃度達到 500 mg/kg 時,達到了74.9%,顯著高于其他處理組,而芘在皂角苷濃度為 500 mg/kg 和 200 mg/kg 時,去除率無顯著差異,分別為60.9%、63.14%.

在各處理組中,菲的去除率都高于芘,這是因為PAHs的環(huán)數(shù)(菲3環(huán),芘4環(huán))越高,它在土壤中的疏水性也越高,故而生物有效性相對更低,越難去除.而芘在皂角苷濃度為 50 mg/kg 時,其去除率相對低環(huán)較上一濃度增加了49.5%,這是因為當(dāng)高環(huán)PAHs的生物有效性一旦提高,其去除效率相對低環(huán)PAHs會迅速上升[19],這與PAHs的膠束-水分配系數(shù)(Km)有關(guān)[20].

2.2 皂角苷對黑麥草生物量的影響

圖2 黑麥草生物量Fig.2 Biomass of ryegrass

整個實驗期間,黑麥草生長良好,表明施入20～500 mg/kg 皂角苷未對黑麥草產(chǎn)生毒害作用,這也為皂角苷表面活性劑應(yīng)用于土壤修復(fù)提供了技術(shù)保障.待培養(yǎng) 60 d 后,其地下部分(根部)及地上部分(葉際)的生物量見圖2.結(jié)果表明,在施加皂角苷表面活性劑后,對于黑麥草葉際而言,只有當(dāng)施加量大于 200 mg/kg 時,葉際生物量相對于CK組顯著增加,其余無顯著差異;而對于根際,黑麥草生物量始終未隨皂角苷濃度升高而表現(xiàn)出顯著性差異.綜上,皂角苷的濃度增加會使得黑麥草地上部分的生物量呈漸進上升趨勢.

(a) (b) (c) (d)圖3 黑麥草體內(nèi)酶活性及MDAFig.3 Enzyme activity and MDA in ryegrass

2.3 皂角苷對植物酶活性及丙二醛的影響

CAT、SOD和 POD是植物體內(nèi)能夠抵御植物細胞內(nèi)活性氧傷害的重要保護性酶[18,21].皂角苷對黑麥草酶活性和丙二醛含量有顯著的影響,黑麥草體內(nèi)CAT活性變化見圖3(a),與未添加皂角苷的對照組(CK)相比,黑麥草根部及葉際CAT活性分別在皂角苷濃度達到20及 50 mg/kg 時,發(fā)生顯著變化,又分別在皂角苷濃度達到500及 200 mg/kg 時,出現(xiàn)最大值,是CK組的1.47和1.53倍;SOD活性變化見圖3(b),與CK相比,20和 50 mg/kg 皂角苷處理對根部及葉際的 SOD活性無顯著影響,之后隨著皂角苷濃度的上升顯著且趨于穩(wěn)定,在皂角苷濃度達到 500 mg/kg 時,SOD 活性出現(xiàn)最大值;觀察圖3(c)發(fā)現(xiàn),POD活性變化與 SOD活性變化趨勢相同;黑麥草MDA變化見圖3(d),MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其含量通常用來代表植物受損傷的程度以及衡量植物對逆境條件反應(yīng)的強弱[22-23],皂角苷的施入能夠逐步緩解PAHs對修復(fù)植物黑麥草的毒害,在濃度達到 100 mg/kg 時,皂角苷的緩解作用開始變得顯著.對比未添加皂角苷的CK組,當(dāng)皂角苷施入濃度達到 500 mg/kg 時,黑麥草根部及葉際中的 MDA值分別從 27.9 μg/g 下降到 17.62 μg/g、24.1 μg/g 下降到 15.38 μg/g.

綜上,當(dāng)皂角苷濃度達到一定濃度時,能夠顯著提高黑麥草體內(nèi)三種抗氧化酶的活性,進而增強了黑麥草抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化能力,減弱了多環(huán)芳烴對其細胞膜的脂過氧化損傷程度,緩解了多環(huán)芳烴對黑麥草的毒害.此外,據(jù)相關(guān)研究表明,植物抗氧化酶雖然能夠?qū)χ参锲鸬奖Ｗo作用,但其本身存在閾值,當(dāng)酶活性達到某一高度時,抗氧化酶系統(tǒng)會受到破壞,酶活性便會隨之下降[22].而本研實驗中,黑麥草酶活性在皂角苷施入的濃度范圍內(nèi),未達到保護閾值,這一結(jié)果也能再次為皂角苷應(yīng)用于植物修復(fù)提供了保障.

2.4 皂角苷對黑麥草吸收土壤中PAHs的影響

實驗分別測定了黑麥草根部及葉際中PAHs的含量,兩部分中菲、芘的含量及生物富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)如表1、表2所示.由表可以看出從根部檢測出的兩種PAHs含量皆高于葉際,當(dāng)皂角苷濃度大于 100 mg/kg 時,能夠顯著提高黑麥草對PAHs的吸收,當(dāng)皂角苷入濃度達到 500 mg/kg 時,菲、芘兩種PAHs的富集系數(shù)是無皂角苷施入(CK)的1.52及1.78倍;而對于轉(zhuǎn)運系數(shù)來講,皂角苷施入對PAHs從根部向葉際的轉(zhuǎn)運無明顯促進作用,這是因為有機化合物的logKow一旦大于4時(菲和芘的logKow分別為4.57和5.18)便極易于滯留在植物根部[24],這也說明了根部將會是植物用來吸收降解PAHs的主要部位[25].另外,從表中發(fā)現(xiàn),菲在根部的含量少于芘,然而葉際中的菲含量卻是芘的數(shù)倍,這是因為菲有著相對較高的水溶解度(菲和芘的水溶解度分別為 0.89 μg/L 及 0.14 μg/L),從而易于從根部到葉際的轉(zhuǎn)運.

表1 不同處理下植物體內(nèi)菲含量、生物富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)

表2 不同處理下植物體內(nèi)芘含量、生物富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)

然而在評價植物吸收積累對土壤PAHs去除的貢獻率時發(fā)現(xiàn):植物吸收對土壤中菲和芘去除率的貢獻率微乎其微,以生物量和積累量最高的 500 mg/kg 皂角苷組別(S500)為例,葉片生物量 1.42 g/株,菲濃度 0.147 mg/kg,根生物量 0.27 g/株,菲濃度 0.663 mg/kg,每盆植物40棵黑麥草,植物帶走的菲的量約 0.054 mg.雖然從理論上講,植物對于吸收的PAHs有一定的降解以及其它原因PAHs的代謝揮發(fā),但總體是有限的[26].由此可見,皂角苷雖然能有效加強黑麥草對PAHs的吸收,然而黑麥草吸收累積土壤PAHs的貢獻不足 0.1 mg/kg(貢獻率不足1%).

在土壤中PAHs的生物有效性提高以后,微生物的降解作用才是去除PAHs及其它有機污染物的主要作用機制[27].此外,生物表面活性劑不僅能夠直接增溶PAHs(提高土壤PAHs的生物有效性),它也能夠促使植物根系分泌更多低分子有機酸(如草酸等)從而進一步提高PAHs的生物有效性[28],加強了土壤中PAHs的微生物降解.

2.5 皂角苷對黑麥草根系土壤群落結(jié)構(gòu)的影響

圖4 土壤中細菌群落在主要屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities at the major genus level

土壤微生物的降解作用是去除PAHs的主要作用機制[27],土壤中天然的PAHs降解菌群主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)等[12].在皂角苷作用下土壤細菌屬水平的變化如圖4所示.由圖4可知,在無皂角苷施入的土壤(CK)中優(yōu)勢菌屬主要有馬賽菌屬(Massilia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微枝形桿菌屬(Microvirga)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)及芽孢桿菌屬(Bacillus)等,而隨著皂角苷施入濃度的增加,群落中原占優(yōu)勢的馬賽菌屬(Massilia)、微枝形桿菌(Microvirga)、苯基桿菌(Phenylobacterium)等開始大幅度減少,而鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)這三類PAHs降解菌的比例則隨著濃度增加逐漸上升:如在皂角苷施入濃度為 500 mg/kg 時,微枝形桿菌(Microvirga)由5.49%降低至0.89%,縮小了83.8%;另外對于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)這三類PAHs降解菌而言,皂角苷對芽孢桿菌屬(Bacillus)的豐度促進尤為突出,由8.34%升至15.33%,提升了82.9%,而芽孢桿菌屬(Bacillus)也是諸多PAHs降解菌中最為典型有效的,它能降解包括菲、芘等16種PAHs[29].此外,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)及假單胞菌屬(Pseudomonas)的豐度分別從11.31%上升至16.75%、4.31%上升至5.88%.PAHs降解菌豐度的增加,使得土壤中的PAHs也因此得到了更高效的降解.

3 結(jié) 論

1) 皂角苷濃度的增加會使得土壤PAHs的降解率不斷提高:皂角苷濃度達到 500 mg/kg 時,菲的去除率最高,為74.9%,顯著高于其他處理組;而芘在皂角苷濃度為200～500 mg/kg 時,去除率達到最優(yōu)且趨于穩(wěn)定,約為63.14%.

2) 皂角苷能夠顯著提高黑麥草體內(nèi)CAT、SOD、POD三種抗氧化酶活性,并減少黑麥草體內(nèi)MDA的含量,顯著提高了修復(fù)植物黑麥草的抗氧化能力.

3) 皂角苷施入能夠顯著提高黑麥草對PAHs的吸收,當(dāng)施入濃度達到 500 mg/kg 時,菲、芘兩種PAHs的富集系數(shù)是CK組的1.52及1.78倍;對于轉(zhuǎn)運系數(shù)來講,皂角苷的施入無明顯促進作用.總體而言,皂角苷能有效加強黑麥草對PAHs的吸收,然而其對PAHs的吸收累積量在整個土壤PAHs修復(fù)過程中所占的貢獻率卻很小.

4) 微生物降解作用是去除土壤PAHs的關(guān)鍵,添加皂角苷能夠優(yōu)化微生物的群落結(jié)構(gòu),提升土壤中PAHs天然降解菌屬芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對豐度,從而促進了土壤中PAHs更為高效的降解.