鄭世仲，周子維，陳曉慧，蔡烈偉，江勝滔，劉盛榮

拮抗炭疽病的茶樹內生菌篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

鄭世仲，周子維，陳曉慧，蔡烈偉，江勝滔，劉盛榮*

寧德師范學院生命科學學院，福建 寧德 352100

為篩選高效拮抗茶樹炭疽病的內生細菌，以茶樹健康葉片為材料，采用平板對峙拮抗法進行篩選，并對篩選到的菌株進行鑒定、抑菌效果評價及培養(yǎng)條件優(yōu)化。從分離的162株內生細菌中篩選到1株對茶樹膠孢炭疽菌有較好抑制效果的拮抗細菌X13。形態(tài)學、生理生化鑒定及16?S rDNA系統(tǒng)進化發(fā)育分析顯示，分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌（）。菌株X13對病原菌菌絲生長抑制率為61.6%。生長曲線表明，菌株X13對數生長期為接種后2～14?h。響應面優(yōu)化的培養(yǎng)條件為4.0%（質量百分濃度）玉米粉，1.0%（質量百分濃度）的硝酸鈉，接種量3.5%（體積分數）。本研究結果可為茶樹炭疽病防治及生防菌劑的開發(fā)提供重要參考。

茶樹；炭疽病；內生細菌；枯草芽孢桿菌；培養(yǎng)條件

茶樹（）屬山茶科山茶屬的常綠雙子葉木本植物，是我國重要的經濟作物。炭疽病是茶樹葉部的主要病害之一[1-2]，且在福建省等濕熱地區(qū)最容易發(fā)生和流行。茶炭疽菌病（Miyake）是由茶刺盤孢等炭疽菌屬真菌引起的。茶炭疽菌屬半知菌亞門、黑盤孢目、盤長孢屬，膠孢炭疽菌（）為茶樹常見的一種炭疽病病原菌[3-4]。茶炭疽菌主要為害茶樹葉片，從葉尖或葉緣開始發(fā)病，開始呈水漬狀淺綠色，逐漸增大，形成形狀不規(guī)則的大病斑，中后期引起大量葉片脫落，影響茶樹生長，造成茶葉產量和質量下降，給茶園造成巨大的經濟損失，危害茶產業(yè)發(fā)展[5-7]。

植物病蟲害的防治主要有物理、化學和生物防治3種方法，但化學防治會引起環(huán)境污染和農殘等問題。微生物制劑等生物防治法具有對人畜無毒、不污染環(huán)境和持效性長等優(yōu)點，已受到廣泛重視和開發(fā)利用，大量研究表明，利用拮抗微生物制備生防菌劑防治茶樹等植物病害具有很大潛力[6,8-10]。

拮抗微生物主要通過土壤或植物體進行分離篩選，土壤篩選的拮抗菌多為產抗生素的放線菌[11-12]。內生細菌是植物內生菌群的重要組成，通過不同方式長期定殖寄生在植物體內，與寄主長期協同進化，促進植物生長，同時對抵御病害又起重要作用，因此，植物內生菌成為開發(fā)微生物農藥防治植物病害的重要途徑。植物內生菌的抑菌機理主要表現為合成水解酶、抗生素和植物生長調節(jié)劑等次生代謝物質，殺死或抑制病原菌生長，增強植物體自身抵抗力，或誘導植物免疫應答等途徑來抑制病原菌生長，降低病原菌的侵染效率和致病性，而內生菌自身又對寄主植物生長沒有危害甚至有生長調節(jié)作用[13]。植物內生細菌在茶樹、油茶和花卉果樹等植物生長過程的生理作用和病害防治中的作用已經被逐步發(fā)掘[14-16]。

茶樹炭疽病病征主要表現在成葉，其危害在很多茶區(qū)沒有引起足夠重視，但茶樹炭疽病的發(fā)生，不但影響茶樹生長，甚至可能誘導茶樹次生代謝物質發(fā)生變化，結果影響茶葉產量與品質。目前，國內外對茶樹炭疽病開展了廣泛研究，但主要針對炭疽病病原，而病害的生物防治研究較少。本研究以茶樹分離到的膠孢炭疽菌為病原指標菌，從茶樹葉片分離篩選對茶炭疽病病原菌具有較強拮抗作用的內生細菌，并對分離到的拮抗菌進行鑒定和抑菌效果評價，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為開發(fā)茶樹炭疽病生防菌劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試炭疽病病原菌膠孢炭疽菌，為發(fā)生炭疽病病害的茶樹葉片分離得到，保存于閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心微生物研究室；健康茶樹葉片從茶樹種植基地（福建寧德）采集，作為內生細菌分離材料；基礎液體培養(yǎng)基，其組成按質量分數為葡萄糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，KH2PO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·H2O 0.01%，FeSO4·7H2O 0.01%，CaCl20.15%配制，調pH值至7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

取茶樹成熟的健康葉片5.0?g，用70%乙醇溶液漂洗2～3次，10%的NaClO浸泡5?min，無菌水漂洗4～5次，晾干，50?mL無菌水研磨。研磨液稀釋至10-4倍，吸取0.1?mL稀釋液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，涂布，37?℃倒置培養(yǎng)，長出菌落后根據菌落形態(tài)特征挑取單菌落，進一步劃線純化、保種。

1.2.2 拮抗菌篩選

初篩，采用平板對峙培養(yǎng)法。PDA平板中心位置接種茶樹膠孢炭疽菌菌餅（直徑7.0?mm），周圍10.0?mm等距離接種分離的細菌，以僅接種茶樹膠孢炭疽菌菌餅為對照，25?℃恒溫箱培養(yǎng)。對照長至培養(yǎng)皿近邊緣時，測量菌落直徑，計算抑制率。抑制率=（對照炭疽菌菌落直徑－處理直徑）/對照炭疽菌菌落直徑×100%。

復篩，采用瓊脂擴散法。膠孢炭疽菌在PDA平板25?℃培養(yǎng)5?d，無菌水洗滌，制備1×105CFU·mL-1孢子懸液，取100?μL孢子懸浮液涂布PDA平板，每平板上放置3個牛津杯，加入150?μL初篩菌株發(fā)酵濾液，以無菌水為對照，培養(yǎng)4?d，觀察抑菌情況和測量抑菌圈大小。

1.2.3 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學與生理生化鑒定，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]。顯微鏡觀察形態(tài)，測試硝酸鹽還原、吲哚試驗、葡萄糖發(fā)酵等生理生化特性，對篩選的拮抗細菌進行初步鑒定。

16?S rDNA序列鑒定。EasyPure Genomic DNA Kit（全式金生物科技公司）基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，微量核酸檢測儀（Thermo Scientific）檢測DNA濃度和純度；引物27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′）擴增16?S rDNA序列，PCR反應體系25?μL，擴增程序為：95?℃預變性5?min；95?℃變性30?s，60?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，35個循環(huán)；72?℃延伸10?min。EasyPure? Quick Gel Extraction Kit（全式金生物科技公司）膠回收試劑盒純化回收后克隆，陽性克隆子送華大基因測序。

測序結果進行NCBI-BLAST同源性序列比對分析，并從中下載相似度較高的序列，用MEGA 7.0軟件（Neighbor-Joining，NJ鄰位相連法）構建分子系統(tǒng)遺傳進化樹。

1.2.4 種子液制備

將活化后的分離菌株X13刮取1環(huán)接入50?mL滅菌的營養(yǎng)肉湯（250?mL三角瓶），37?℃搖床200?r min-1培養(yǎng)20?h，即為液體種子液。

1.2.5 生長曲線測定

種子液按3.0%（體積分數）接種量接入裝有50?mL基礎培養(yǎng)基的250?mL三角瓶，搖床培養(yǎng)條件200?r·min-1和37?℃，每2?h取培養(yǎng)液。以滅菌后的基礎培養(yǎng)基為空白對照，分光光度計測定OD600值，3個平行培養(yǎng)作為重復。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗設計

（1）單因素試驗：碳源篩選，供試碳源為可溶性淀粉、大豆粕、麩皮、甘露醇、蔗糖和玉米粉，按2.0%（質量百分濃度）添加量代替基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖，3.0%（體積分數）接種量接入X13種子液。發(fā)酵培養(yǎng)試驗的裝液量為250?mL三角瓶裝50?mL培養(yǎng)基，37?℃、200?r·min-1搖床培養(yǎng)，14?h后測試發(fā)酵液OD600值，篩選出最適碳源。設置最佳碳源濃度范圍為1.0%～5.0%，采用相同方法確定適宜的濃度。每次試驗3個獨立的平行培養(yǎng)作為重復。

氮源篩選，大豆粕、硫酸銨、硝酸鈉、尿素作為氮源，添加量2.0%（質量百分濃度），代替基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他條件同上，確定最適氮源及合適濃度。

接種量確定，以最適碳源、氮源及濃度配制培養(yǎng)基，按2.0%、3.0%、4.0%、5%和6.0%（體積分數）接種量接種，其他條件同上，確定合適的接種量。

（2）Box-Behnken試驗：單因素試驗基礎上，Box-Behnken試驗設計進行響應面優(yōu)化，試驗設計采用Design-Expert 8.0軟件。玉米粉濃度（A）、硝酸鈉濃度（B）和接種量（C）3個因素為自變量，菌體生長量OD600值為響應值進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計。試驗因素及水平見表1。

以OD600值試驗結果進行多元二次回歸分析，建立自變量與響應值之間定量關系的數學模型，值檢驗評價模型的可靠性，相關系數（2）作為模型擬合程度的指標，值小于0.05視為變量顯著。

1.2.7 數據處理

數據以平均值±標準差或平均值（Box-Behnken試驗）的形式表示。采用Excel 2007和Design-Expert 8.0進行繪圖及統(tǒng)計分析。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌篩選

從茶樹葉片共分離到162株具有不同形態(tài)的茶樹內生細菌菌株，并進一步初篩、復篩。其中，菌株X13對茶樹炭疽病病原菌抑制率和抑菌圈直徑最大，抑制率達到61.6%，抑菌圈直徑17.9?mm。因此，選擇X13菌株用于后續(xù)試驗。圖1為菌株X13與茶樹炭疽病病原菌的拮抗作用圖。

2.2 菌株X13的鑒定

2.2.1 形態(tài)學與生理生化鑒定

菌株X13菌落圓形，呈乳脂色，不透明，前期表面較光滑，后期有明顯褶皺，邊緣不整齊；革蘭氏染色陽性，菌體桿狀，有芽孢，無莢膜，周生鞭毛；好氧生長，能利用葡萄糖、甘露醇和木糖發(fā)酵產酸，可水解明膠，能利用檸檬酸鹽，能分解色氨酸形成吲哚，硝酸鹽反應和V-P檢測陽性。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步確定X13菌株為芽孢桿菌屬。

2.2.2 16?S rDNA鑒定

菌株X13的16?S rDNA序列長度1?449?bp，序列已提交保存于GenBank，NCBI登錄號OP420513.1。基于16?S rDNA序列構建的系統(tǒng)遺傳進化樹見圖2。由圖2可知，X13菌株和枯草芽孢桿菌（）YL1在進化樹的同一分支，且根據NCBI數據庫比對結果，X13菌株與YL1的16?S rDNA序列相似度為99.72%，因此，結合形態(tài)學與生理生化鑒定結果，確定分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌。

注：A為試驗組，B為對照組

圖2 枯草芽孢桿菌X13系統(tǒng)進化樹

2.3 菌株X13的生長曲線

菌株X13在基礎培養(yǎng)基的生長曲線如圖3所示，菌株的延滯期為2?h，2～14?h為對數生長期，14～24?h處于穩(wěn)定期，24?h后開始進入衰亡期。說明菌株X13生長速度快，生長旺盛，對營養(yǎng)要求不嚴格，易培養(yǎng)。發(fā)酵接種時，種子液以培養(yǎng)10～14?h為宜，此時活性高、繁殖能力強，且活菌數高。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 不同碳源和氮源對菌株X13生長的影響

如圖4所示，在供試的6種碳源中，以玉米粉作為碳源時穩(wěn)定期的菌體生長量最大（圖4A）；隨玉米粉添加量不斷增加，菌體生長量呈先增加后降低的趨勢；添加量為4.0%時，菌株X13生長量最高（圖4B）。因此，玉米粉為X13菌株的最適碳源，添加量為4.0%。

圖3 菌株X13生長曲線

由圖4C和圖4D可以看出，硝酸鈉（NaNO3）作為氮源時，穩(wěn)定期X13菌株生長量最高。不同NaNO3添加量對X13菌株生長有明顯的影響，菌體生長量隨NaNO3添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，NaNO3添加量為1.0%時，X13菌株生長量達到最大值。因此，NaNO3為最適氮源，添加量為1.0%。

2.4.2 不同接種量對枯草芽孢桿菌X13菌株生長影響

由圖5可知，接種量對X13菌株生長有一定的影響，接種量為3.0%時，X13菌株生長量達到最大值，進一步增加接種量，生長量呈現降低趨勢，因此，最佳接種量為3.0%。

2.5 響應面優(yōu)化

2.5.1 Box-Behnken試驗結果及回歸模型建立

Box-Behnken試驗共有17組試驗組合，試驗結果見表2。以OD600為響應值（），利用Design-Expert 8.0軟件對獲得的數據進行多變量回歸擬合，建立的回歸方程為：=-14.7+4.47+8.53+3.21-0.22+0.15-0.47-0.592-3.232-0.502

模型回歸方程的方差分析結果見表3，模型的F值為26.45，Prob>F值<0.01，表明模型極顯著，可用于分析和預測不同培養(yǎng)條件下的菌體生長，失擬項值為0.188?6，不顯著，表明模型與純誤差無關，模型可靠。模型的相關系數2=0.971?4，表明回歸方程擬合度高，響應值的97.14%可由模型變量解釋。

注：A，碳源；B，玉米粉添加量；C，氮源；D，硝酸鈉添加量

圖5 接種量對枯草芽孢桿菌X13菌株生長影響

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

注：**表示差異極顯著（<0.01）；*表示差異顯著（<0.05）

Note: ** means highly significant difference (<0.01). * means significant difference (<0.05)

自變量A、B和C 3個因素對OD600值有極顯著影響（<0.001），交互項BC的影響為顯著（<0.05），平方項A2、B2和C2對結果有極顯著影響（<0.001）。各因素對菌體生長影響大小為B（NaNO3添加量）>A（玉米粉添加量）>C（接種量）。

2.5.2 因素交互作用分析

回歸模型的響應面曲面圖和等高線圖如圖6所示。由圖6A和圖6B可以看出，接種量為3.0%時，OD600值隨玉米粉添加量增加呈現先增加后下降趨勢，硝酸鈉添加量對菌體生長的影響同玉米粉相近，因此，兩個因素均在0水平附近有最大的菌體生長量。兩者間的等高線圖呈圓型，表明兩者間無顯著的相互作用。

圖6C和圖6D為玉米粉與接種量對菌體生長影響的響應面和等高線圖，可以看出，變量NaNO3添加量固定為1.0%，OD600值隨接種量的增加呈現先增加后下降趨勢，接種量為3.0%時達到最大；玉米粉添加量約4.0%時菌體生長達到最大，低于或高于該水平時，生長量下降。等高線圖顯示兩因素間無顯著相互作用。

接種量和NaNO3添加量對菌體生長的影響見圖6E和圖6F，自變量玉米粉濃度固定為4.0%。接種量增加可提高菌體生長量，高于3.3%開始下降；OD600值隨NaNO3的添加量增加先增加而后減小。等高線圖呈橢圓型，表明兩者間有顯著的相互作用。

軟件優(yōu)化的各因素最佳組合為玉米粉添加量4.06%，硝酸鈉添加量0.94%，接種量3.35%，模型預測的OD600最大值為3.76。

注：A和B分別表示玉米粉添加量與硝酸鈉添加量交互作用的曲面圖和等高線圖；C、D分別表示玉米粉添加量與接種量交互作用的曲面圖和等高線圖；E、F分別表示硝酸鈉添加量與接種量交互作用的曲面圖和等高線圖

2.6 回歸模型的試驗驗證

為檢驗模型的可靠性，進行驗證試驗?？紤]操作的方便性，將響應面優(yōu)化的條件略作改進，即玉米粉添加量4.0%，硝酸鈉添加量1.0%，接種量3.5%，3個重復。驗證試驗的OD600平均值為3.78，與模型的預測值3.76非常接近，證實所建立的模型可靠，可準確預測不同條件下菌株X13的生長。

3 討論

植物發(fā)生的病害種類很多，引起的原因并不相同。迄今為止，使用化學合成農藥仍是防治植物病害的主要措施，但伴隨引起的農殘超標和環(huán)境污染問題日益凸顯。目前，安全高效的生物防治植物病害已經引起廣泛重視，已開發(fā)出多種生物防治菌劑。已有報道表明，生防菌主要從土壤或植物根際進行分離篩選，大多數屬放線菌和真菌，但土壤來源的微生物很難在植物體或植物表面對習居微生物獲得競爭優(yōu)勢，從而影響防治效果，限制了生防菌劑的推廣應用[18-19]。值得指出的是，由于細菌繁殖速度快，易人工培養(yǎng)，且營養(yǎng)要求低，生產成本低，因此，植物內生細菌可作為防治植物病害的重要天然資源，具有潛在研究價值和開發(fā)前景。

植物內生細菌分布于植物的不同組織，在長期的進化過程中已適應宿主植物體的體內生態(tài)環(huán)境，也能促進植物的生長，作為外源菌劑噴施于宿主植物，能快速適應宿主環(huán)境，易于植物附生和獨立寄生繁殖，占據有利生態(tài)位，容易直接對病原菌發(fā)起攻擊，分泌拮抗物質抑制或殺死病原菌，發(fā)揮生防作用，而植物自身的遺傳特性和生長均不會受到影響[20-22]。已有的研究表明，利用茶樹內生細菌開發(fā)的生防菌劑能最大程度發(fā)揮菌劑的生防作用，不僅能夠高效抑制病原菌對茶樹的病害，還可提高茶樹的抗逆性，促進茶樹生長[23-24]。

植物內生細菌種類繁多，其中芽孢桿菌屬能產芽孢，對外界有害因子抵抗力強，是生防菌的重要來源，能通過分泌抗菌物質或者誘發(fā)植物自身的抗病潛能從而增加植物抗病性[25-26]。本研究從健康葉片中分離到1株對茶樹膠孢炭疽菌有較強拮抗作用的茶樹內生細菌X13，經形態(tài)學、生理生化及16?S rDNA系統(tǒng)進化發(fā)育分析顯示分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌。

本研究所分離到的菌株X13生長繁殖速度快，營養(yǎng)要求低，易培養(yǎng)。采用單因素試驗和響應面試驗對枯草芽孢桿菌X13的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為玉米粉添加量4.0%、硝酸鈉添加量1.0%、接種量3.5%，該工藝發(fā)酵成本較低；從平板拮抗試驗可知，菌株X13對茶樹炭疽病病原菌抑制率達到61.6%，與陳百文等[27]及代亞鋒等[28]分離得到的一些拮抗菌相比，具有更高的抑制率，且發(fā)酵粗提液也具有較好的抑菌作用。因此，菌株X13具有大規(guī)模開發(fā)為低成本生防菌劑的潛力，可用于茶樹炭疽病的安全高效防治。

拮抗菌的生防機制主要表現為與病原菌競爭營養(yǎng)以及生長空間，或合成胞外水解酶以及一些抑菌的次生代謝產物。本研究主要開展了拮抗炭疽病的茶樹內生細菌分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，已有的研究表明，產生各種水解酶是芽孢桿菌起抑菌作用的一種重要方式[29-30]，菌株X13也屬芽孢桿菌，是否與其他芽孢桿菌有相同抑菌機理有待進一步研究，包括真菌細胞壁水解酶產生、抑菌成分分離鑒定及對病原菌的菌絲和孢子生長的影響，以及與宿主茶樹之間的互作關系。

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Screening, Identification and Culture Condition Optimization of Antagonistic Endophytic Bacteria AgainstMiyake

ZHENG Shizhong, ZHOU Ziwei, CHEN Xiaohui, CAI Liewei, JIANG Shengtao, LIU Shengrong*

College of Life Sciences College, Ningde Normal University, Ningde 352100, China

To screen the antagonistic endophytic bacteria againstMiyake, the healthy leaves of tea plants were utilized as materials, and the plate antagonistic method was used. The isolated bacteria were identified and evaluated for antimicrobial efficacy. The culture conditions were optimized using response surface methodology. One antagonistic bacterium X13 was screened from 162 strains of endophytic bacteria isolated, which had a good inhibitory effect on. The strain X13 was identified asthrough morphological observation, physiological and biochemical tests, and 16S rDNA phylogenetic analysis. Theinhibitory rate of strain X13 on the mycelial growth ofreached 61.6%. Thelogarithmic growth was between 2-14?h. The optimal culture conditions were 4.0% (masspercentage concentration) corn flour, 1.0% (mass percentageconcentration) NaNO3, and 3.5% (volume fraction) inoculation. This study laid a key theoretical foundation for the prevention of the tea pathogenand the development of its biocontrol agents.

tea plant,, endophytic bacteria,, culture condition

S517.1；S435.711

A

1000-369X（2023）02-205-11

2022-09-18

2022-12-06

福建省自然科學基金（2020J01425）、寧德師范學院校級中青年項目（2020Q101）、寧德師范學院人才引進項目（2020Y013）

鄭世仲，男，副教授，主要從事微生物生化和園藝生物技術研究。*通信作者：fjhost@163.com