楊雨濤，王袁，謝嘉欣，付霞霏

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）為一種成體干細(xì)胞，因其自我更新、誘導(dǎo)分化等特點，對神經(jīng)系統(tǒng)等疾病有治療作用［1］。外泌體（exosome，Exo）是一種直徑為30~150 nm 的細(xì)胞外囊泡，可傳遞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，具有靶向細(xì)胞功能，是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮作用的重要途徑［2-3］。研究已證實Exo 在心臟、骨等相關(guān)疾病及再生方面發(fā)揮重要作用［4-6］。顆粒細(xì)胞是卵巢的基礎(chǔ)功能單位，位于卵母細(xì)胞透明帶外側(cè)，支持卵母細(xì)胞生長、發(fā)育和成熟［7］。早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病，4%~30%POI 的發(fā)生有自身免疫失調(diào)參與［8］。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞中Epg5基因表達(dá)失調(diào)可以導(dǎo)致POI發(fā)病，可見顆粒細(xì)胞異常在POI發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［9］。目前研究多集中于干細(xì)胞治療自身免疫性POI，但人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone mesenchymal stem cell，hBMSC）來源Exo治療自身免疫性POI相關(guān)研究甚少。本研究通過提取hBMSC來源Exo，觀察人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN）及自身免疫性POI小鼠卵巢組織攝取Exo的情況，為探索該Exo治療自身免疫性POI的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3 只SPF 級雌性BALB/c 小鼠（7~8 周齡），體質(zhì)量18~22 g，均購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0052。小鼠均在適宜溫度（30±2）℃和光照周期（14 h 光照/10 h 黑暗）下自由攝食飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器 hBMSC 由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所提供；KGN 細(xì)胞購自廣州捷威斯生物公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自上海依科賽生物公司；DiR 染料購自蘇州宇恒生物公司；CD63 兔單克隆抗體購自英國Abcam 公司，CD9、腫瘤易感基因（TSG）101 兔單克隆抗體購自華安生物公司；羊抗兔抗體購自康為世紀(jì)生物公司；ZP3蛋白多肽購自中國捷威生物科技公司；熒光倒置顯微鏡、共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）；納米流式儀（廈門福流公司）；低速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；高速冷凍離心機(jī)、超高速冷凍離心機(jī)、透射電鏡（日本日立公司）；超靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；IVIS Spectrum 小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)（上海PerkinElmer公司）。

1.2 方法

1.2.1 無Exo FBS制備 將普通FBS于1×105r/min，4 ℃超高速離心12 h，得到上清液，用0.22 μm 濾膜過濾后得到無Exo FBS。

1.2.2 hBMSC 及KGN 細(xì) 胞 培 養(yǎng) hBMSC 及KGN 細(xì) 胞 均 于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取P3 至P9 代hBMSC，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)其生長至70%~80%時，更換培養(yǎng)基，PBS 清洗，用無Exo FBS 與DMEM/F12 配制成10%無Exo完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液于-80 ℃冰箱冷凍儲存。取P4代hBMSC，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 超高速離心法提取Exo 將凍存的細(xì)胞上清液于4 ℃過夜融化，在4 ℃下以2 000 r/min離心20 min，去除細(xì)胞碎片等沉淀物，再在4 ℃下以10 000 r/min離心30 min去除亞細(xì)胞成分，然后以1×105r/min 超離心90 min 得到沉淀物，盡可能完全清除上清液，將每管中的沉淀重懸于PBS中，以1×105r/min超離心90 min，得到的最終沉淀物即為Exo。

1.2.4 納米流式儀測Exo粒徑 將分離到的Exo待測樣本用1 mL經(jīng)過濾的PBS混勻，按照納米流式儀說明書緩慢注入機(jī)器進(jìn)行上樣，檢測粒徑。

1.2.5 透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察Exo形態(tài) 將Exo樣本交由廣東省科學(xué)院微生物研究所檢測其形態(tài)。吸取Exo樣品滴于銅網(wǎng)上，2 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體。滴加3%磷鎢酸（pH=7.0）于銅網(wǎng)，2 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液。滴加純水于銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余水，待干后用于TEM觀察。

1.2.6 Western blot 檢測Exo CD63、CD9、TSG101 膜蛋白表達(dá) BCA 法測定Exo 蛋白濃度，將Exo 蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入CD63（1∶1 000）、CD9（1∶500）、TSG101（1∶1 000）單克隆抗體4 ℃過夜孵育，室溫?fù)u床孵育二抗90 min。在膜上滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光液，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)。

1.2.7 Exo 熒光標(biāo)記 按照DiR 說明書的步驟進(jìn)行操作。hBMSC-Exo懸液中加入50μmol/L DiR在37 ℃孵箱中避光孵育30 min。然后加入一定量的PBS液重懸，1×105r/min，4 ℃，超高速離心70 min，棄掉上清液，使已標(biāo)記的Exo與未結(jié)合的DiR染料分離。

1.2.8 共聚焦顯微鏡觀察Exo 內(nèi)化 將KGN 細(xì)胞種板在共聚焦小皿中，加入20 mg/L DiR標(biāo)記的Exo，避光，37 ℃共孵育24 h 或48 h。然后PBS 輕柔清洗2 次，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定5 min，PBS 清洗3 次，每次5 min。加入DAPI 染料，避光孵育5 min，PBS清洗3次，每次5 min。最后加入50μL抗熒光淬滅封片劑，避光，通過共聚焦顯微鏡觀察KGN細(xì)胞能否攝取Exo（KGN 細(xì)胞核周圍有紅色熒光即DiR 標(biāo)記的Exo）及攝取量。

1.2.9 活體成像觀察POI 小鼠攝取Exo 將ZP3 蛋白多肽（NSSSSQFIHGPR）以1 g/L溶解于蒸餾水，再將其乳化成等體積的完全弗氏免疫佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）和不完全弗氏免疫佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）。在所有小鼠后腳和腹部皮下注射0.15 mL 含75μg ZP3 多肽的CFA乳劑。14 d后用0.15 mL含75μg ZP3多肽的IFA乳劑在相同部位進(jìn)行第2次皮下注射。第2次免疫6周后，小鼠出現(xiàn)動情周期不規(guī)則或延長的現(xiàn)象，提示成功建立自身免疫性POI 小鼠模型。建模后第1 天，小鼠腹腔注射150μg DiR 標(biāo)記的Exo；建模后第7 天，再次腹腔注射150 μg DiR 標(biāo)記的Exo。在第2次注射Exo后的第14天，通過活體成像儀觀察小鼠攝取Exo的情況。

2 結(jié)果

2.1 hBMSC細(xì)胞形態(tài) hBMSC在達(dá)到80%~90%匯合后呈紡錘狀，大小均一，貼壁良好，見圖1。

Fig.1 The morphology of hBMSC(×400)圖1 hBMSC的形態(tài)（×400）

2.2 Exo 粒徑及形態(tài)分析 所提取出的Exo 平均直徑為（81.12±17.23）nm，與Exo粒徑范圍（30~150 nm）相符合，見圖2。TEM 下可見Exo 呈典型的雙層膜狀，見圖3。

Fig.2 The particle size of hBMSC-derived Exo圖2 hBMSC來源Exo的粒徑

Fig.3 The morphology of hBMSC-derived Exo(The scale is 100 nm)圖3 hBMSC來源Exo的形態(tài)（比例尺為100 nm）

2.3 Exo中CD63、CD9、TSG101膜蛋白表達(dá) CD63、CD9和TSG101膜蛋白在hBMSC來源Exo中呈陽性，見圖4。

Fig.4 Expression of CD63,CD9 and TSG101 membrane proteins in Exo圖4 Exo中CD63、CD9、TSG101膜蛋白表達(dá)

2.4 KGN 細(xì)胞攝取Exo 情況 與共孵育24 h 相比，共孵育48 h 的細(xì)胞核周圍紅色熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，攝取Exo量更多，見圖5。

2.5 小鼠卵巢組織攝取Exo 活體成像儀觀察到3只小鼠卵巢部位有發(fā)光信號，通過腹腔注射，Exo可被小鼠卵巢組織攝取，見圖6。

3 討論

近年來，隨著更多標(biāo)準(zhǔn)化的純化和分析程序的開發(fā)，BMSC 來源Exo 的提取效率得到提高，在疾病治療中受到廣泛關(guān)注及應(yīng)用［10-11］。POI 嚴(yán)重威脅女性的生殖健康和生活質(zhì)量，免疫因素是其常見病因，目前缺乏有效治療方法，臨床上以激素補充等對癥治療為主，但達(dá)不到滿意的療效。相較于干細(xì)胞而言，MSC 來源的Exo 具有低免疫原性、低惡性潛能、易于儲存和移植等優(yōu)點，在POI治療中受到關(guān)注［12］。本研究通過超高速離心提取hBMSC 來源Exo，觀察到KGN 細(xì)胞及自身免疫性POI 小鼠卵巢組織攝取Exo，提示hBMSC來源Exo有望成為治療自身免疫性POI的新思路。

Rhim 等［13］應(yīng)用ZP3 誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)自身免疫性卵巢炎，類似于人類自身免疫性POI，此后大量學(xué)者均采用該方法構(gòu)建免疫性POI 模型進(jìn)行實驗研究。本課題組經(jīng)多次實驗驗證，建模后的模型動物在卵巢組織結(jié)構(gòu)和功能上均與人類自身免疫性POI表現(xiàn)相似，擬合度及成功率較高，因此選用ZP3多肽構(gòu)建自身免疫性POI動物模型。自1980年Exo在網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中首次被分離出后，越來越多研究證明，大多數(shù)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等均可釋放Exo［6］。本研究通過超速離心法得到純度較高的hBMSC 來源Exo。Exo 的分離和純化方法包括超速離心法、超濾法、尺寸排斥色譜法和基于微孔板的磁免疫捕獲法［14-15］。雖無統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)，但超速離心法在不同的研究中均被證明有效，且其分離Exo 純度和回收率高，同時最大限度減少蛋白質(zhì)聚集體和其他膜粒子的共純化，有利于保護(hù)Exo的功能，是目前分離提純Exo的主要技術(shù)［16］。

Fig.5 The uptake of hBMSC-derived Exo by KGN cells observed by confocal microscopy圖5 共聚焦顯微鏡觀察KGN細(xì)胞攝取hBMSC來源Exo

Fig.6 Exo uptake in ovarian tissue observed by fluorescence imaging in vivo圖6 活體熒光成像觀察卵巢組織攝取Exo

BMSC 作為最經(jīng)典的間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便，易分離培養(yǎng)。BMSC 分泌的Exo 可攜帶多種物質(zhì)如蛋白、miRNA 及脂類等，抑制外周血單個核細(xì)胞分泌干擾素γ，并具有免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)刺激、遷移、增殖、抗炎和抗氧化作用［17］。在體外，鼠源BMSCExo 可被化療損傷的顆粒細(xì)胞內(nèi)吞，抑制顆粒細(xì)胞凋亡；在化療導(dǎo)致的卵巢早衰模型中，小鼠卵巢原位注射Exo 后可促進(jìn)卵巢內(nèi)血管生成，改善小鼠的卵巢結(jié)構(gòu)和功能［18］。本研究中KGN 細(xì)胞成功攝取了hBMSC 來源Exo，且與共孵育24 h 相比，48 h 的攝取量更多，初步說明Exo 能被體外細(xì)胞攝取，且Exo 攝取量與共孵育時間也有一定關(guān)系。在免疫性POI小鼠體內(nèi)觀察到腹腔注射Exo 后其卵巢組織攝取Exo的現(xiàn)象，證明Exo可到達(dá)小鼠卵巢組織，被卵巢組織攝取內(nèi)吞，但還需進(jìn)一步明確hBMSC 來源Exo 在自身免疫性POI的治療作用及其機(jī)制。

在體內(nèi)，不同的注射方式會影響Exo 攝取。動物體內(nèi)注射Exo 常用方法有尾靜脈、腹腔及原位注射，其中尾靜脈注射較為常用。靜脈注射Exo在肝、脾和肺中富集，容易導(dǎo)致靜脈堵塞，被血液中的巨噬細(xì)胞清除掉，影響Exo 到達(dá)靶器官從而減弱治療作用。腹腔注射Exo 可形成更分散的分布模式，且在內(nèi)臟脂肪組織中可觀察到明顯的Exo積累［19］。與靜脈或腹腔注射Exo相比，原位注射Exo雖然可減少脫靶遞送并增加靶組織的暴露并減少Exo 的清除［20］，但其更具有創(chuàng)性，易造成動物的大量失血或感染甚至死亡。在Exo治療化療致POI的研究中，多數(shù)研究者采用尾靜脈注射方式進(jìn)行體內(nèi)動物實驗［18，21］，極少數(shù)會采取原位卵巢注射及腹腔注射方式［22-23］。本研究采取腹腔注射Exo的方式，觀察到Exo在第2次注射后的第14天可以歸巢到小鼠卵巢中，證明腹腔注射的可行性。

綜上所述，本研究順利分離提純出hBMSC來源Exo，并觀察到KGN細(xì)胞及自身免疫性POI小鼠卵巢組織能夠攝取Exo，為相關(guān)研究者提供參考。