周春麗, 萬 群, 程金金, 蔣文奇, 劉嘉楠, 陸 順, 張 國, 于居龍, 曹崇江, 余向陽

(1.中國藥科大學工學院,江蘇南京 211198; 2.江蘇省農業(yè)科學院,江蘇南京 210014;3.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所,江蘇句容 212400)

近年來,稻縱卷葉螟呈暴發(fā)性發(fā)生,嚴重危害水稻生產[1]。目前,防治稻縱卷葉螟的方法主要是噴霧[2-4]或施用氯蟲苯甲酰胺顆粒劑[5-6]。此外,于居龍等的研究表明,使用氯蟲苯甲酰胺處理水稻種子可以增強對稻縱卷葉螟的防治效果并且可長效防控稻縱卷葉螟,減少前期稻縱卷葉螟防治用藥次數(shù)[1,7-9]。但是拌種處理水稻種子仍舊存在著一些問題:一方面是農藥容易吸附在土壤中,使得大部分農藥沒有被植物的根系吸收,降低了農藥的利用率[10];另一方面是田間水分對藥劑有淋溶作用,使作物為實際靶標的有效利用率大幅度降低[11]。因此,提高農藥的利用率,降低種子處理過程中農藥使用量的問題亟待解決。

生物刺激素是一種激素類物質,具有促進種子萌發(fā)、提高作物品質、增強植物抵抗鹽堿及病蟲害的能力[12]。赤霉素是一種二萜類化合物和植物激素,可激活細胞分裂以及細胞增大過程,可以促進作物提前發(fā)芽[13],促進根系和莖的伸長[14];脫落酸能調控植物的多種生理活動,使用低濃度的脫落酸浸種水稻種子對秧苗生長有促進作用[15-16];復合氨基酸可以為作物提供多種氨基酸,促進作物合成蛋白質,促進作物的生長;亞精胺屬于脂肪含氮物,楊安中等使用亞精胺浸種發(fā)現(xiàn),亞精胺能提高水稻種子的發(fā)芽率[17];烯效唑浸種可提高稻苗光合效率,使用低濃度的烯效唑可以促進種子發(fā)芽[18-20];海藻酸鈉是一種多糖類物質,張運紅等研究發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉可以緩解鎘對水稻的毒害[21]。

有關生物刺激素與殺蟲劑混配使用的研究較少。楊富軍等研究發(fā)現(xiàn),使用赤霉素與氯蟲苯甲酰胺進行花生種子拌種處理之后,可以增加花生的防治效果[22]。此外生物刺激素與除草劑混配對除草劑也有增效作用,赤霉素可以增強草甘膦、芐嘧·唑草酮的作用,蕓薹素內酯可以增強芐嘧·唑草酮的作用[23-24]。但有關生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺混配拌種處理影響水稻中氯蟲苯甲酰胺含量的研究尚未見報道。因此,本試驗以不添加生物刺激素為對照,研究6種生物刺激素(赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉)分別與氯蟲苯甲酰胺的3個梯度濃度混配進行拌種,旨在研究不同混配組合對水稻吸收農藥的影響,以期提高水稻吸收氯蟲苯甲酰胺的能力,為水稻藥劑拌種減藥增效提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試水稻品種為南粳9108。

1.2 儀器與試劑

儀器:QTRAP 5500+液相色譜-質譜儀、AB 5500+高效液相色譜串聯(lián)質譜儀(美國AB Sciex公司)、Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm,美國Phenomenex公司)、離心機(Centrifuge 5804 R,美國eppendorf公司)、干冰研磨機。

試劑:20%氯蟲苯甲酰胺(CAP)懸浮劑(美國杜邦公司生產);氯蟲苯甲酰胺標準品(純度99.0%,德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司);乙腈(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司);無水MgSO4(西隴科學股份有限公司);C18、PSA分析純(分析純,中國安譜公司);紅色著色劑;赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);6種生物刺激素使用濃度溶液的配制:赤霉素11 g/L、脫落酸1 g/L、氨基酸93.75 g/L、亞精胺14.525 g/L、烯效唑0.2 g/L、海藻酸鈉 10 g/L)。

1.3 種子處理方法

以氯蟲苯甲酰胺100%推薦量、75%推薦量和50%推薦量(最終氯蟲苯甲酰胺藥劑有效用量分別為2.0、1.5、1.0 g/kg種子)3個濃度拌種作為3個處理對照,以不拌藥處理為空白處理,以氯蟲苯甲酰胺(100%推薦量、75%推薦量或50%推薦量)+赤霉素/脫落酸/氨基酸/亞精胺/烯效唑/海藻酸鈉作為試驗處理。種子處理方法采用濕拌法,濕拌法參考于居龍等的拌種方法[1],稱取44 kg的水稻種子,放入網(wǎng)袋在清水中將稻種浸泡48 h,瀝干12 h,平均分成22份種子(每份相當于2 kg干種子)置于一次性自封袋中,其中1份不做任何處理。氯蟲苯甲酰胺100%推薦量/75%推薦量/50%推薦量+赤霉素/脫落酸/氨基酸/亞精胺/烯效唑/海藻酸鈉6個試驗處理:分別量取20、15、10 g的20%氯蟲苯甲酰胺,加入6種生物刺激素各10 mL于自封袋中,再加入紅色著色劑。3個對照處理則以清水代替生物刺激素。各個處理在添加完藥劑和試劑后快速晃動自封袋至整個袋子中種子出現(xiàn)均勻紅色,即種子與藥液、試劑已充分混勻,平鋪于紙上,陰干后播種。

1.4 田間試驗方法

試驗于鎮(zhèn)江市農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新中心基地進行。各處理的稻種播種在12個硬質塑料育秧盤(60 cm×30 cm×3.5 cm)中,2021年6月7日播種,6月20日大田移栽。各處理均設置3個重復小區(qū),每個重復小區(qū)的移栽面積大于75 m2。用單泥埂將重復小區(qū)分開,用雙泥埂將各處理隔開,各處理單獨排灌,避免各處理之間的田水串流。各處理在播種后30、60、80、110 d取樣,測定水稻植株中莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,并計算添加生物刺激素處理與未添加生物刺激素處理在水稻生長全周期中莖和葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化量。莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量變化率公式如下:

式中:C1為(100%、75%、50%推薦量+生物刺激素)氯蟲苯甲酰胺殘留量,mg/kg;C2為(100%/75%/50%推薦量)氯蟲苯甲酰胺殘留量,mg/kg。

1.5 氯蟲苯甲酰胺LC-MS/MS分析檢測方法

1.5.1 儀器方法 液相色譜條件:色譜柱為Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm),進樣體積2 μL,柱溫保持40 ℃;流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B),流速為0.3 mL/min,梯度洗脫程序:0～1.0 min,20% B;1.0～2.0 min,20% B;2.0～3.0 min,85% B;3.0～4.0 min,100% B;4.0～5.0 min,100% B;5.0～6.0 min,20% B;6.0～7.0 min,20% B。

質譜條件:電噴霧離子源ESI,正離子模式,霧化氣(N2)、輔助氣(N2)為55 psi,離子源溫度為 550 ℃,電噴霧電壓為5.50 kV,定量定性離子對為484.0/453.0(m/z)。

1.5.2 試驗方法 樣本預處理:五點取樣法每個處理取一定數(shù)量的水稻,取樣后地上部分莖和葉組織分開處理,干冰研磨機研磨之后每個處理稱取1 g樣品,重復4次,加入乙腈5 mL提取,用移液槍移取1 mL上清液于加有無水MgSO4(0.15 g)、C18(0.025 g)和PSA(0.025 g)的2 mL離心管中,渦旋混勻30 s,8 000 r/min離心2 min,過0.22 μm濾膜,待LC-MS/MS測定。

1.5.3 標準曲線制作 用電子天平準確稱取 0.01 g 的氯蟲苯甲酰胺標準品于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準液。以空白水稻的莖、葉提取液為基質液,用系列稀釋法將1 000 mg/L標準液稀釋至所需的質量濃度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L),以質量濃度對峰面積作圖,即得基質匹配標準溶液。

1.5.4 添加回收率的測定 分別稱取莖空白樣品1 g、葉空白樣品1 g,莖、葉分別配制0.05、0.1、1 mg/L 3個添加水平,重復3次,按照“1.5.2”節(jié)的提取方法處理之后,用LC-MS/MS 進行測定,計算添加回收率。

利用Microsoft Excel 2010與Gradpaph Prism進行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)處理均未經(jīng)轉換。

2 結果與分析

2.1 線性范圍

從表1可以看出,在0.001～1 mg/L范圍內,氯蟲苯甲酰胺的濃度與儀器響應呈良好線性,r2≥0.996。

2.2 準確度和精密度

從表1可以看出,在水稻莖和葉基質中添加不同質量濃度的氯蟲苯甲酰胺,平均回收率范圍為83%～97%,相對標準偏差(RSD)為0.3%～4.4%。實驗回收率和相對標準偏差符合農藥殘留分析的要求。

表1 氯蟲苯甲酰胺在各基質的添加回收率

2.3 各處理水稻莖組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量

播種后30、60、80、110 d,對水稻植株的莖進行取樣,并測定氯蟲苯甲酰胺的殘留量,具體如圖1所示?？梢钥闯?隨著播后時間增加,莖組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量呈現(xiàn)下降趨勢。6種生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸、亞精胺的處理;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸、亞精胺、烯效唑的處理。

2.4 各處理水稻葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量

播種后30、60、80、110 d,對水稻植株的葉進行取樣,并測定氯蟲苯甲酰胺的殘留量(圖2)。可以看出,隨著播后時間增加,水稻植株葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量總體呈下降趨勢。6種生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸、海藻酸鈉的處理;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理。

2.5 各處理水稻莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率

表2為6種生物刺激素分別與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量、75%推薦量、50%推薦量混合拌種后在水稻的生育期110 d內莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率。赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別增加了86%、18%、48%、7%、19%、35%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別增加了58%、9%、12%、-46%、-37%、33%;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別增加了112%、37%、69%、45%、29%、13%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別增加了8%、21%、34%、-36%、-7%、-5%;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別約增加了98%、39%、88%、91%、121%、14%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對照分別增加了52%、17%、23%、-26%、-3%、-7%。

表2 6種生物刺激素對水稻不同生育期氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率

因此,6種生物刺激素分別與100%推薦量、75%推薦量、50%推薦量混合拌種后,赤霉素和氨基酸在水稻大多數(shù)生育期都能夠增加水稻莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,分別添加赤霉素和氨基酸后,100%、75%、50%推薦量下,水稻莖中氯蟲苯甲酰胺的殘留量分別增加了86%、112%、98%和 48%、69%、88%;葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量分別增加了58%、8%、52%和12%、34%、23%。脫落酸、亞精胺、烯效唑和海藻酸鈉多數(shù)在前期(30～60 d)有少量增加莖或葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,但在后期(80～110 d)莖或葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量基本沒有增加或者是比對照少。

3 討論

藥劑處理水稻種子是一種經(jīng)濟、有效、省工省力的方式,可以達到長效、可持續(xù)綠色防控害蟲的效果[25]。近年來,稻縱卷葉螟嚴重危害水稻的生產[1,26-27]。目前,使用氯蟲苯甲酰胺對水稻種子進行處理可有效防控稻縱卷葉螟。但是種子處理還存在農藥利用率低的問題,因此,本試驗研究了6種生物刺激素(赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉)分別與氯蟲苯甲酰100%推薦量、75%推薦量和50%推薦量混合拌種后是否能夠增強氯蟲苯甲酰胺的藥效試驗。

本研究表明,6種生物刺激素中,赤霉素和氨基酸分別與各推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺混合拌種后能夠明顯增加莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量。添加赤霉素后,水稻莖中的氯蟲苯甲酰胺殘留量分別增加了86%、112%、98%,葉中的氯蟲苯甲酰胺殘留量分別增加了58%、8%、52%;添加氨基酸后,氯蟲苯甲酰胺在水稻莖中的殘留量增加了48%、69%、88%,在葉中的殘留量增加了12%、34%、23%。

赤霉素是一種二萜類化合物和植物刺激素。赤霉素除了有促進種子萌發(fā)的作用,還具有刺激莖節(jié)間伸長的作用,其效果比生長素更為顯著,但不改變節(jié)間數(shù),節(jié)間長度增加的原因是赤霉素能夠促進細胞伸長和細胞分裂[28]。楊富軍等使用赤霉素與氯蟲苯甲酰胺混合對花生進行拌種,研究發(fā)現(xiàn),添加赤霉素后可以增強對棉鈴蟲、蠐螬和斜紋夜蛾3種主要花生蟲害的防治效果,還可以提高花生的出苗率以及產量[22]。

另外赤霉素作為激素可以與很多基因的啟動子結合調控基因的表達,Li等研究發(fā)現(xiàn),缺乏AP2/ERF家族基因SHOEBOX的水稻植株根分生組織嚴重變小,這些植物在發(fā)芽后根分生組織中的細胞較短,并且發(fā)現(xiàn)外源赤霉素的應用可以使SHOEBOX的野生型植物的根分生組織細胞的大小恢復正常[29]。Ragni等研究發(fā)現(xiàn),赤霉素可以直接刺激擬南芥下胚軸木質部擴張,從而增加下胚軸的水和溶質運輸能力,推測赤霉素可以促進水稻木質部的擴張,從而促進了水稻轉運的能力,從而增強水稻對氯蟲苯甲酰胺的吸收[30]。Chiba等研究發(fā)現(xiàn),赤霉素的轉運蛋白為NRT1/PTR FAMILY(NPF)蛋白,此蛋白最初被鑒定為硝酸鹽或二/三肽轉運蛋白,推測赤霉素激活了農藥轉運蛋白的表達,從而增強了水稻對氯蟲苯甲酰胺的吸收[31]。

葛明惠等發(fā)現(xiàn),在水稻幼苗期施用5%復合氨基酸增效劑可以顯著增加水稻幼苗的株高、葉綠素含量(SPAD值)、根系生長指標、地上部干質量和氮、磷、鉀累積吸收量[32]。曹小闖等使用氨基酸肥水溶液對水稻浸種,并在水稻的幼苗期、分蘗期、破口前進行葉面噴施,發(fā)現(xiàn)可以增加水稻營養(yǎng)器官氮素積累量以及葉片氮素向穗轉運,有利于提高水稻對氮素的利用率。因此,推測氨基酸通過提高水稻的健康程度及增強植株抗逆境脅迫能力來提高對農藥的吸收[33]。

4 結論

結果表明,生物刺激素赤霉素和氨基酸分別與氯蟲苯甲酰胺混合拌種處理后可以顯著促進水稻對氯蟲苯甲酰胺的吸收,從而達到提高防效的目的。因此在水稻種植中,可以將其與藥劑混合進行種子處理,促進水稻吸收藥劑,增加藥劑的藥效。此外,赤霉素和氨基酸促進水稻對氯蟲苯甲酰胺吸收的機制有待進一步研究。