逯錦春,王鐵軍,朱玉菲,吳萌,王金鑫,陳新娜,李彥慧

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院,河北 保定 071000;2 河北省林業(yè)和草原局宣傳中心,河北 石家莊 050000)

河北省自然地理?xiàng)l件優(yōu)越,野生花卉資源豐富,市場(chǎng)潛力巨大。長(zhǎng)毛銀蓮花(Anemonenarcissifloravar.Crinita)與銀蓮花(Anemonecathayensis)同屬于毛茛科、銀蓮花屬,具有較高的觀賞及藥用價(jià)值。自然條件下銀蓮花屬植物主要依靠根莖進(jìn)行繁殖,繁殖速度較慢,難以滿足在園林應(yīng)用及藥用生產(chǎn)上的需求[1-5]。目前,有關(guān)銀蓮花的研究報(bào)道多集中在植物化學(xué)成分與藥理研究方面,涉及2種野生銀蓮花種子萌發(fā)方面的研究尚無(wú)報(bào)道。隨著對(duì)野生資源需求的不斷增加,研究其種子萌發(fā)對(duì)實(shí)現(xiàn)大批量人工栽培具有重要意義。

種子繁殖是目前解決野生植物資源短缺的有效方法,但受自然環(huán)境條件及人為條件限制,野生銀蓮花資源有限,且在自然條件下種子存在休眠現(xiàn)象,大大限制了其植物資源利用。在對(duì)同屬植物野生林蔭銀蓮花(Anemoneflaccida)種苗繁殖技術(shù)研究中,采用了多種措施處理,種子均難以萌發(fā),說(shuō)明該種子存在嚴(yán)重休眠現(xiàn)象[6-7]。種子休眠是制約野生銀蓮花大規(guī)模栽培的瓶頸問(wèn)題,因此尋找適宜的萌發(fā)條件至關(guān)重要。本研究以2種野生銀蓮花種子為試驗(yàn)材料,采用正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法測(cè)定種子活力,通過(guò)研究不同培養(yǎng)溫度、不同濃度赤霉素處理、濃硫酸浸種、不同層積處理方式對(duì)種子萌發(fā)的影響,探討種子休眠原因與休眠類型,篩選適宜的萌發(fā)條件,這對(duì)保護(hù)與開發(fā)河北省野生銀蓮花資源并擴(kuò)大其園林應(yīng)用范圍具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料于2018年9月中旬采摘,長(zhǎng)毛銀蓮花種子采自河北省承德塞罕壩機(jī)械林場(chǎng)(E 116°53′～117°39′,N 41°92′～42°36′),銀蓮花種子采自霧靈山自然保護(hù)區(qū),自然干燥后貯藏于4 ℃冰箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子基本參數(shù)測(cè)定 主要包括外形、千粒重、種子吸水率測(cè)定。參考劉長(zhǎng)江對(duì)植物種子形態(tài)學(xué)的描述方法,觀察并描述2種野生銀蓮花種子形態(tài)特征,隨機(jī)選取50粒顏色相同的飽滿種子,用數(shù)顯式游標(biāo)卡尺測(cè)量種子的長(zhǎng)度和寬度,并計(jì)算長(zhǎng)寬比,取平均值[8]。采用千粒法隨機(jī)數(shù)取1 000粒種子進(jìn)行測(cè)量,重復(fù)3次。選取50粒顏色相同且飽滿的種子進(jìn)行吸水能力的測(cè)試,加入蒸餾水浸沒(méi)種子,每隔12 h撈出種子,用吸水紙吸干表面水分在電子天平上稱重,直至種子重量不再變化為止,計(jì)算其最大吸水率,重復(fù)3次。

1.2.2 種子活力測(cè)定 選擇顏色相同且飽滿一致的種子,去除外種皮,用手術(shù)刀將種子沿中央縱切,取出完整種胚。采用氯化三苯基四氮唑染色法(簡(jiǎn)稱TTC法)進(jìn)行種子活力測(cè)定。通過(guò)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法觀察在不同染色溫度、染色時(shí)間和TTC濃度下2種野生銀蓮花種子的活力,種胚被染上紅色即視為有活力。每個(gè)染色因素下均設(shè)3個(gè)水平,共9個(gè)處理,每處理下種子數(shù)量為36粒,設(shè)3次重復(fù)。具體因素水平設(shè)定見表1。

表1 銀蓮花種子活力測(cè)定正交設(shè)計(jì)處理Table 1 Orthogonal design for determination of seed vigor of A. cathayensis

1.2.3 種子萌發(fā)試驗(yàn) (1)溫度處理：將2種野生銀蓮花種子浸種48 h,10%的H2O2消毒15 min后用蒸餾水沖洗干凈備用,向培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2層定性濾紙,于15、20、25、30 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱下進(jìn)行培養(yǎng),光照強(qiáng)度2 500 lx,光照12 h/黑暗12 h。每天根據(jù)濾紙干燥程度進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)水,保持濕潤(rùn)狀態(tài),觀察記錄發(fā)芽數(shù)。每個(gè)處理25粒種子,3次重復(fù)。

(2)赤霉素處理：采用不同濃度 GA3進(jìn)行處理,GA3設(shè)置5個(gè)處理,濃度分別為0、50、100、200、400 mg/L。每個(gè)處理25粒種子,3次重復(fù)。將2種銀蓮花種子在各濃度GA3溶液中浸泡48 h,于20 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),其他培養(yǎng)條件同1.4.1。

(3)濃硫酸浸種處理：采用98%濃硫酸分別浸泡2種銀蓮花的種子0、2、4、8 min,酸處理后將種子沖洗干凈,于20 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),其他培養(yǎng)條件同1.4.1。每個(gè)處理25粒種子,3次重復(fù)。

(4)恒溫層積處理：將沙子經(jīng)篩子過(guò)篩,去除多余雜質(zhì),加入適量蒸餾水拌勻,沙子的濕度以手握成團(tuán)松開即散為宜。挑選2種野生種子各900粒,將沙子與種子按3∶1的比例混勻,分裝到扎孔的培養(yǎng)袋中,置于4 ℃恒溫冰箱中層積,分別層積30、60、100 d,并于100 d后轉(zhuǎn)至室溫15、30 d,定期觀察并記錄發(fā)芽數(shù)。

(5)地窖層積處理：在裝有種子的扎孔培養(yǎng)袋四周填滿沙子,放于地窖內(nèi)進(jìn)行層積處理,其他同上。將2種種子分別層積60、100 d、并于100 d后轉(zhuǎn)至室溫15、30 d。當(dāng)種子連續(xù)15 d不再萌發(fā)時(shí)試驗(yàn)結(jié)束。觀察統(tǒng)計(jì)不同時(shí)段下的發(fā)芽種子數(shù),計(jì)算發(fā)芽率(種子萌發(fā)以胚根露白為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn))。具體處理見表2。

表2 層積處理設(shè)計(jì)Table 2 Design of stratification treatment

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

最大吸水率(%)=(吸足水后的重量-吸水前的重量)/吸水前的重量 × 100%

(1)

千粒重(g)=(種子重量/種子粒數(shù))× 1 000

(2)

種子生活力(%)=(有生活力的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù))× 100%

(3)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行記錄處理, 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子基本參數(shù)測(cè)定

2種野生銀蓮花種子的基本參數(shù),見表3。

由表3可知,2種野生銀蓮花種子皆為瘦果,呈橢圓形,表面略粗糙,無(wú)毛,兩側(cè)具翅。長(zhǎng)毛銀蓮花種子顏色為淺褐色,種子長(zhǎng)度為8.19 mm,寬度為5.35 mm,長(zhǎng)寬比為1.53,最大吸水率為122.00%;銀蓮花種子顏色為棕黑色,種子長(zhǎng)度為7.37 mm,寬度為4.81 mm,長(zhǎng)寬比為1.55,最大吸水率為123.00%。種子千粒重是衡量種子飽滿程度的一個(gè)重要指標(biāo),千粒重越大表明種子越飽滿。銀蓮花種子的千粒重比長(zhǎng)毛銀蓮花種子高2.74 g。

2.2 種子活力測(cè)定

TTC染色法是國(guó)際上判斷種子活力及發(fā)芽潛力的常用方法。2種野生銀蓮花種子活力測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果,見表4。

表4 野生銀蓮花種子活力測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results for determination of seed vigor of A. cathayensis

由表4可知,2種銀蓮花種子在不同處理下種子活力不同。長(zhǎng)毛銀蓮花種子活力最高的組合為處理5,活力最高為74.97%,染色溫度25 ℃,染色時(shí)間12 h,TTC濃度1.00%,比最低組合處理2高出31.5%,且與其他處理均呈顯著差異;銀蓮花種子活力最高的組合為處理7,種子活力最高為83.33%,染色溫度30 ℃,染色時(shí)間6 h,TTC濃度1.00%,活力最低的組合為處理8,最高處理比最低處理高33.15%。

對(duì)正交處理結(jié)果進(jìn)行方差分析,見表5。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

由表5可知,3個(gè)因素對(duì)2種野生銀蓮花種子染色的影響。對(duì)于長(zhǎng)毛銀蓮花種子,染色溫度的P值為0.001,小于0.05,表明在0.05水平下,染色溫度對(duì)長(zhǎng)毛銀蓮花種子的染色效果影響顯著;而對(duì)于銀蓮花種子,染色溫度與TTC濃度的P值均小于0.05,說(shuō)明這2個(gè)因素對(duì)銀蓮花種子的染色影響顯著。根據(jù)P值與F值可知,影響長(zhǎng)毛銀蓮花種子染色效果大小順序?yàn)椋喝旧珳囟?染色時(shí)間>TTC濃度;而影響銀蓮花種子染色效果大小順序?yàn)椋篢TC濃度>染色溫度>染色時(shí)間。

2.3 種子萌發(fā)特性

2.3.1 不同溫度、赤霉素濃度、濃硫酸浸種處理對(duì)種子萌發(fā)的影響 對(duì)未經(jīng)過(guò)層積的2種銀蓮花種子進(jìn)行不同溫度、赤霉素濃度、濃硫酸浸種處理,見表6。

表6 不同處理方式下2種銀蓮花種子的發(fā)芽率Table 6 Germination rate of two A. cathayensis seeds under different treatments

由表6可知,各處理水平之間均不存在顯著差異,且2種銀蓮花種子發(fā)芽率均較低。在98%濃硫酸浸種8 min處理下,銀蓮花種子表面出現(xiàn)干癟,內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損,不再吸水,種子失活,發(fā)芽率為0。在3種處理方式下,長(zhǎng)毛銀蓮花的種子平均發(fā)芽率總計(jì)為3.79%,銀蓮花種子平均發(fā)芽率總計(jì)為2.77%。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),2種野生銀蓮花種子萌發(fā)時(shí)滯較長(zhǎng),分別為42、45 d。

2.3.2 不同層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響 不同層積處理下2種銀蓮花種子的發(fā)芽率,見表7。

表7 不同層積處理下銀蓮花種子的發(fā)芽率Table 7 Germination rate of A. cathayensis seeds under different stratification treatments

由表7可知,在2種不同層積處理方式下,層積100 d+轉(zhuǎn)室溫30 d后2種銀蓮花種子均不再萌發(fā),發(fā)芽率為0,至此發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束,因此未列入表中。在同一層積方式下,銀蓮花種子的發(fā)芽率隨層積時(shí)間的增加逐漸升高。對(duì)比4 ℃層積與地窖層積處理可知,與層積100 d相比,層積100 d+室溫15 d能夠顯著提高2種銀蓮花種子的發(fā)芽率,長(zhǎng)毛銀蓮花種子發(fā)芽率分別提高了10.00%、18.22%;銀蓮花種子發(fā)芽率提高了6.67%、11.79%,且均顯著高于其他層積時(shí)間段,說(shuō)明室溫變溫處理顯著提高了種子發(fā)芽率。通過(guò)2種層積處理方式可知,長(zhǎng)毛銀蓮花和銀蓮花種子的最適宜萌發(fā)條件為地窖層積100 d+室溫15 d處理,發(fā)芽率分別為34.44%和45.78%。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 野生銀蓮花種子休眠原因及類型 對(duì)種子進(jìn)行生物學(xué)特性研究是初步判斷種子質(zhì)量的關(guān)鍵性工作,通常因外界環(huán)境因子與植物內(nèi)部遺傳因素的不同會(huì)產(chǎn)生不同大小的種子[9]。TTC染色法法是生產(chǎn)實(shí)踐上一種常用來(lái)分析與判斷種子發(fā)芽能力的方法。大量研究表明,TTC法測(cè)定種子活力的結(jié)果一般大于或等于其發(fā)芽率[10]。種子休眠是自然界中一種較為普遍的現(xiàn)象,是指種子具有活力而不萌發(fā)的現(xiàn)象,這是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為抵抗外界不良環(huán)境條件形成的一種應(yīng)激反應(yīng)。通常影響種子休眠的主要因素有溫度、光照、水分、自身原因等,種子休眠可分為物理休眠、形態(tài)休眠、生理休眠、形態(tài)生理休眠與復(fù)合休眠5種類型,休眠類型直接決定種子發(fā)芽難易[11-12]。

本研究測(cè)定2種野生銀蓮花種子活力最高分別為74.97%、83.33%,而種子發(fā)芽率最高可達(dá)34.44%、45.78%,種子活力高于發(fā)芽率。在試驗(yàn)中嘗試用濃硫酸浸種打破其休眠,但其種子可正常吸水及發(fā)芽,說(shuō)明種皮不是造成休眠的主要原因,即不存在物理休眠;在不同溫度與赤霉素處理下,發(fā)現(xiàn)2種野生銀蓮花種子發(fā)芽率都較低,無(wú)顯著差異,而且在萌發(fā)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)萌發(fā)高峰,無(wú)發(fā)芽勢(shì),這與山東銀蓮花(A.chosenicolavar.schantungensis)種子的研究結(jié)果一致[13-14]。在試驗(yàn)前期觀察2種銀蓮花種子發(fā)現(xiàn)種胚皆發(fā)育不成熟,仍處于心形胚時(shí)期。目前根據(jù)2種野生銀蓮花種子萌發(fā)過(guò)程中需要先經(jīng)過(guò)低溫層積促使種胚完成生理后熟,獲得萌發(fā)能力后才能萌發(fā)的特性,將其初步歸類為形態(tài)生理休眠,這是其種子休眠的主要原因[15]。

3.1.2 變溫層積對(duì)休眠種子萌發(fā)的影響 種子在萌發(fā)過(guò)程中大量酶會(huì)發(fā)生活化反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)種子內(nèi)部機(jī)制的物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能量運(yùn)輸,溫度作為影響酶活性的一個(gè)主要因素,在參與種子萌發(fā)過(guò)程中起著重要的作用[16]。變溫層積是打破形態(tài)生理休眠的一種常用方式,適當(dāng)?shù)淖儨靥幚韺?duì)于一些具有活力而存在嚴(yán)重休眠的種子具有一定的促進(jìn)萌發(fā)作用,因此掌握適宜種子萌發(fā)的溫度尤其重要[17]。

本試驗(yàn)中,在2種層積處理方式下,隨層積時(shí)間的增加,種子發(fā)芽率逐漸升高,說(shuō)明在層積過(guò)程中,種子的休眠逐漸解除,但隨著層積時(shí)間超過(guò)115 d時(shí),種子停止萌發(fā)且大量發(fā)霉,也說(shuō)明在層積過(guò)程中要嚴(yán)格控制層積時(shí)間。2種野生花種子在層積100 d后進(jìn)行室溫變溫層積,種子發(fā)芽率顯著提高,說(shuō)明變溫層積可以有效打破種子休眠,促進(jìn)種子發(fā)芽。

3.2 結(jié)論

長(zhǎng)毛銀蓮花種子在染色溫度25 ℃,染色時(shí)間12 h,TTC濃度為1.00%條件下,活力最高為74.97%;而銀蓮花種子活力最高的處理組合為染色溫度30 ℃,染色時(shí)間6 h,TTC濃度1.00%,種子活力最高為83.33%。對(duì)種子活力正交處理結(jié)果進(jìn)行方差分析得出,影響長(zhǎng)毛銀蓮花種子染色效果大小順序?yàn)椋喝旧珳囟?染色時(shí)間>TTC濃度,而影響銀蓮花種子染色效果順序?yàn)椋篢TC濃度>染色溫度>染色時(shí)間。對(duì)2種銀蓮花種子進(jìn)行不同溫度、GA3濃度及濃硫酸浸種處理,發(fā)現(xiàn)2種野生銀蓮花種子發(fā)芽率皆較低。在4 ℃層積與地窖層積2種處理方式下,2種銀蓮花種子發(fā)芽率顯著提高,并得出長(zhǎng)毛銀蓮花和銀蓮花種子的最適宜萌發(fā)條件為地窖層積100 d+室溫15 d處理,發(fā)芽率分別可達(dá)34.44%和45.78%。