王仙婷 金彥斌 蔡俊宏 包 珊

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是最常見的婦科腫瘤之一,每年造成全世界約74000位女性死亡[1]。子宮切除術(shù)仍然是治療的主要手段,輔助化療和/或放療可使高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或晚期疾病患者獲益[2]。但癌癥晚期/復(fù)發(fā)性疾病的治療仍然具有挑戰(zhàn)性,且化療、激素治療和靶向治療仍在臨床試驗(yàn)研究之中[2]。

1型子宮內(nèi)膜癌占85%的病例,其中絕大多數(shù)病例表達(dá)雌激素受體α(ERα)。ERα是一種類固醇激素受體[3],ERα陽性患者對孕激素有反應(yīng)[3]。此外,ERα是最好的療效預(yù)測因子,它與臨床療效和存活率顯著相關(guān)[4]。ERα表達(dá)降低與分化差、晚期腫瘤、疾病復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)[5],尋找能穩(wěn)定ERα表達(dá)水平的靶點(diǎn)至關(guān)重要。

RNF43作為一種E3泛素連接酶,已被證明作為抑癌因子抑制結(jié)腸癌發(fā)展[6]。但在肺癌中,RNF43可作為促癌因子促進(jìn)肺癌的惡化[7]。雖然有報(bào)道其在子宮內(nèi)膜癌中頻繁突變,但是具體的作用機(jī)制并不清楚[8]。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析RNF43在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)與良好的生存期有關(guān),RNF43可抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,并能穩(wěn)定ERα的表達(dá),有望作為穩(wěn)定ERα表達(dá)的靶點(diǎn),現(xiàn)將研究內(nèi)容報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 siRNA的合成 3條siRNF43及NC由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。序列如下:

表1 相關(guān)基因序列表

1.1.3 主要試劑 RNF43抗體購自美國Abcam公司,GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國CST公司,CCK-8檢測 試劑盒購自中國Biosharp公司,特異性RNF43 siRNA (特異性SiRNF43-1,SiRNF43-2,SiRNF43-3及其陰性對照(NC)、siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購自中國Biosharp有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Ishikawa細(xì)胞均置于10%含胎牛血清、50 μg/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素的高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),均貼壁生長,每日觀察細(xì)胞生長情況,每天換培養(yǎng)基一次。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 Ishikawa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為siRNF43#1,siRNF43#2,siRNF43#3及NC組,按照siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑的說明書轉(zhuǎn)染。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染24 h的siRNF43和NC子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,于2000個(gè)細(xì)胞/每孔100 μl培養(yǎng)基接種于96 孔板,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),24 h后每孔分別加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,2 h后為第1次所測即第1天,而后第3、5、7天置于酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔吸光度值(OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 將轉(zhuǎn)染24 h的siRNF43和NC子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,于2000個(gè)細(xì)胞/每孔接種于六孔板。細(xì)胞培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)液每2 d更新一次。菌落染上了結(jié)晶紫。針對每種情況,統(tǒng)計(jì)給定區(qū)域中的克隆數(shù)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力的變化 將轉(zhuǎn)染好NC和siRNF43的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,胰酶消化,加入1 ml完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為7×105/ml。每個(gè)小槽的左右小室各加70 μl細(xì)胞懸浮液。待細(xì)胞完全貼滿皿底后拔出小槽PBS輕輕洗滌3次,加入1 ml培養(yǎng)基,同時(shí)拍照記錄為0 h。每隔10 h拍照一次,直至遷移融合。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 提前一個(gè)小時(shí)在Transwell的上室中加入已稀釋好的100 μl MG膠,培養(yǎng)箱孵育1 h。將轉(zhuǎn)染24 h后的NC和siRNF43細(xì)胞,胰酶消化,加入堿血清培養(yǎng)基,重懸為5萬個(gè)細(xì)胞/200 μl,做3個(gè)重復(fù)組。吸掉MG膠,將已重懸的細(xì)胞懸液加入上室中,下室中加入600 μl完全培養(yǎng)基后培養(yǎng)48 h。擦去上室細(xì)胞后固定細(xì)胞染色,光鏡下隨機(jī)選取視野計(jì)數(shù)并取平均值。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組Ishikawa細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液提取蛋白,采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,在蛋白樣品中加入適量加樣緩沖液,沸水浴中加熱5 min致蛋白變性。在上樣孔中加入30 μl的變性蛋白樣品,行SDS-PAGE電泳,分離蛋白后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)模,然后置于含3%的BSA中封閉2 h。加入RNF43 一抗(1∶1000稀釋),ERα一抗(1∶1000稀釋)4 ℃下過夜。再加入按1∶5000稀釋的二抗,室溫下1 h,采用ECL化學(xué)發(fā)光,顯影,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算各條帶的相對灰度值。

1.2.8 PCR實(shí)驗(yàn) 分別收集Ishikawa細(xì)胞用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,微量分光光度計(jì)測定各樣品RNA濃度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件:95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃、15 s,58 ℃、30 s,95 ℃、15 s。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNF43 mRNA表達(dá)。RNF43上游引物:5'-AGT GGA TCT GGA GAA AGC TA-3',RNF43下游引物:5'-ATT CAG CTG TAG TCT CCT CT-3';β-actin 上 游 引物:5'-AAG GAT TCC TAT GTG GGC GAC-3',β-actin 下游引物:5'-CGT ACA GGG ALA GCA CAG CC-3'。

1.2.9 半衰期實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后NC或siRNF43的Ishikawa細(xì)胞加入終濃度為100 μM的放線菌酮,然后在孵育0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后收集細(xì)胞沉淀對RNF43、ERα進(jìn)行Western blot檢測。采用Image J軟件掃描定量分析蛋白表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.3.1 從 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù) GEPIA 數(shù)據(jù)庫包含TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫 中常見惡性腫瘤樣本和正常樣本的RNA測序數(shù)據(jù)。通過使用GEPIA數(shù)據(jù)庫提取RNF43基因在子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況,使用“Survival Plots”欄目分析RNF43基因與子宮內(nèi)膜癌生存預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 RNF43與子宮內(nèi)膜癌的良好預(yù)后有關(guān)

利用 GEPIA 數(shù)據(jù)庫生存分析功能發(fā)現(xiàn),RNF43 高表達(dá)組與低表達(dá)組對子宮內(nèi)膜癌患者的總生存率有意義(P<0.05) (圖1),提示RNF43基因高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的良好預(yù)后有關(guān)。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中 RNF43的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 RNF43特異性siRNA的篩選

通過WB和PCR實(shí)驗(yàn),與NC組對比,siRNF43#1,siRNF43#2,siRNF43#3 mRNA和蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)其中siRNF43#3敲低效果更明顯,所以選擇siRNF43#3進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),簡稱siRNF43(圖2)。

2.3 敲低RNF43促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示與NC組相比,siRNF43組細(xì)胞在第5、7天的時(shí)候增殖能力增強(qiáng) (P<0.05)(圖3)。

注:A為RNF43蛋白表達(dá),B為RNF43 mRNA水平。各組相互對比,**為P<0.01,***為P<0.001。

注:與NC組比較,*為P<0.05,**P<0.01。

2.4 敲低RNF43促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的克隆形成能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示siRNF43組細(xì)胞相對于NC組,克隆形成數(shù)增多(P<0.05),見圖4。

2.5 敲低RNF43促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的侵襲

與NC組相比,siRNF43組細(xì)胞侵襲數(shù)增多(P<0.05),見圖 5。

2.6 敲低RNF43促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的遷移

與NC組相比,siRNF43組34 h后愈合率增高(P<0.05),見圖6。

2.7 敲低RNF43后ERα表達(dá)量減少

與NC組相比,siRNF43組細(xì)胞中ERα表達(dá)量降低(P<0.05),見圖7。

2.8 RNF43增加ERα的穩(wěn)定性

加入放線菌酮后,在同一時(shí)間點(diǎn)檢測NC組和siRNF43組RNF43,ERα的表達(dá)。與NC組相比對,siRNF43組ERα表達(dá)低于NC組,這一結(jié)果說明RNF43可以增加ERα蛋白的穩(wěn)定性,見圖8。

注:與NC組比較,***為P<0.001。

注:與NC組比較,***為P<0.001。

注:與 NC 組相比,***為P<0.001。

注:與 NC 組相比,***為P<0.001。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,85%的病例都是1型子宮內(nèi)膜,而且絕大多數(shù)病例都表達(dá)ERα[9]。雌激素受體的表達(dá)和預(yù)后良好相關(guān),且對激素治療敏感,而雌激素受體的消失和癌癥的復(fù)發(fā)相關(guān)[10]。尋找能穩(wěn)定雌激素受體表達(dá)的靶點(diǎn)對雌激素受體穩(wěn)定至關(guān)重要。越來越多證據(jù)表明泛素化系統(tǒng)和腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[11]。RNF43是一種E3泛素連接酶,RNF43最初是作為致癌蛋白在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)[12]。在HEK293T人類癌細(xì)胞系中,它可作為一個(gè)腫瘤抑制因子阻斷了WNT的功能及在大腸癌細(xì)胞系HCT116中引入RNF43突變,其對外源WNT的作用消失[6]。在卵巢癌,胰腺癌中發(fā)現(xiàn)其頻繁突變,提示其作為腫瘤抑制因子的可能性[13-14]。但在肺癌中,RNF43卻可以通過激活c-Arc,介導(dǎo)磷酸化的E-cadherin泛素化和降解,促進(jìn)肺腺癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。但是它在子宮內(nèi)膜癌中的具體生物學(xué)功能還未知[8]。在本研究中,我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的RNF43和子宮內(nèi)膜癌的良好預(yù)后相關(guān),接著選用了雌激素受體陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa進(jìn)行實(shí)驗(yàn),沉默RNF43后,發(fā)現(xiàn)Ishikawa細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力增強(qiáng),RNF43在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中呈現(xiàn)抑制生長的作用。沉默RNF43可以降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中ERα蛋白的表達(dá)量,且縮短ERα的半衰期,進(jìn)一步說明RNF43可通過穩(wěn)定ERα的表達(dá),抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長。

注:與 NC 組相比,***為P<0.001。

綜上所述,RNF43可抑制雌激素受體陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 的增殖、侵襲和遷移能力,并增加ERα蛋白的表達(dá),有望作為子宮內(nèi)膜癌患者治療的新靶點(diǎn)。另外,本文只用了單一細(xì)胞系,只做了RNF43的沉默,未涉及到過表達(dá)驗(yàn)證,且只研究其對ERα蛋白的表達(dá),沒有涉及到雌激素受體對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探索RNF43穩(wěn)定ERα抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的分子通路。