楊瀾，周春雷，王藝霖，董賀楠，楊磊，穆紅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年全球約有50 萬(wàn)新發(fā)病例，26 萬(wàn)死亡病例[1]。宮頸癌新發(fā)病例主要集中于發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)發(fā)病率較高，每年發(fā)病率為16.6/100 000[2]，且有向年輕化發(fā)展的趨勢(shì)[3]。目前宮頸癌的治療策略包括手術(shù)切除、常規(guī)化療、放療，但療效有限，多數(shù)患者仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，隨后死亡[4]，亟需尋找新的治療方案。

環(huán)鳥(niǎo)苷酸依賴(lài)性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）是在哺乳動(dòng)物中普遍存在的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被cGMP 激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能[5]。有研究證實(shí)，PKG 的活化在減少腫瘤細(xì)胞自發(fā)凋亡[6]、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞干性和轉(zhuǎn)移[7]、增加腫瘤惡性程度[8]等方面發(fā)揮重要作用。同時(shí)PKG 可作為多種腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)，如卵巢癌[9]、胰腺癌[10]、前列腺癌[11]等，但抑制PKG 對(duì)宮頸癌的作用還未有報(bào)道。KT-5823 是PKG 的特異性抑制劑，本研究擬探討KT-5823 對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞活力、凋亡和自噬的影響，并研究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa 購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。PKG 抑制劑KT-5823，純度≥85%，購(gòu)自Sigma，貨號(hào)：K1388。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 EnSpire Mutilabel Reader 酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer 公 司）；Alpha Innotech FluroChem FC2 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech 公司）；LightCycle96 熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；BD Accuri C6 P1us 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Sciences公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus IX71 公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）;正置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2.2 試劑 MEM-Alpha 培養(yǎng)基（以色列Biological Industries 公司）；胎牛血清（北京鈕因泰克生物技術(shù)有限公司）；PBS、青霉素/鏈霉素復(fù)合液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）酚紅（美國(guó)Invitrogen 公司）；GFP-LC3B質(zhì)粒（湖南科愛(ài)醫(yī)療器械有限公司）；SBI-0206965（美國(guó)默克公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司）；膜再生液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；LipofectamineTM3000 （美國(guó)Thermo Fisher 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green、熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、曝光液（Boster 生物工程有限公司）；甘氨酸、Tris、SDS 粉末、氯化鈉、脫脂牛奶、抗體稀釋液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）、兔抗人PKG1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）Ⅱ/Ⅰ抗體（美國(guó)CST 公司）；Beclin1、B 細(xì)胞淋巴瘤2 家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3）、GAPDH、HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體（美國(guó)Proteintech 公司）。

1.3 方法 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞使用MEM-Alpha 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代種板。

1.3.2 試劑溶解與實(shí)驗(yàn)分組 KT-5823 用DMSO溶解成儲(chǔ)存液，將儲(chǔ)存液分裝到若干EP 管中，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。將HeLa 細(xì)胞分為DMSO 組（對(duì)照組）、KT-5823 組（實(shí)驗(yàn)組），干預(yù)24 h 后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔3 000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，過(guò)夜培養(yǎng)。更換新培養(yǎng)基，將不同濃度的KT-5823 分別加入對(duì)應(yīng)孔中，刺激24 h。每孔加入10 μL CCK8 溶液，孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=[（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）]×100%

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HeLa 細(xì)胞（每孔1×105個(gè)）接種到24 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，貼壁后待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80% 加入藥物處理24 h，收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 GFP-LC3B 熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 將HeLa 細(xì)胞（每孔0.8×105個(gè)）接種到24 孔板。待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%，使用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒6 h 后，更換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后再加入藥物刺激24 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS清洗3次。熒光顯微鏡觀察GFP-LC3斑點(diǎn)的形成。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 收集干預(yù)之后的細(xì)胞，使用Trizol 提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用TB Green 進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)PKG1、LC3Ⅱ、Beclin1、β-actin mRNA 的表達(dá)水平，2-ΔΔCt計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)。熒光定量熱循環(huán)條件為：預(yù)變性：95℃，2 min；3 步擴(kuò)增：95℃，10 s；58℃，10 s；72℃，10 s，循環(huán)45 次。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.7 蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平收集KT-5823 干預(yù)之后的HeLa 細(xì)胞，加入含磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品（30 μg/孔）加入不同濃度SDS- PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳，分開(kāi)蛋白條帶。轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h（5%），孵育兔抗人PKG1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPHD（1∶1 000）抗體過(guò)夜（4℃），洗滌后孵育二抗（1∶1 000）1 h，加入ECL 顯影液后在蛋白凝膠成像儀中顯影觀察，Image J 分析蛋白條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3.8 利用自噬抑制劑SBI 觀察誘導(dǎo)的自噬的作用 將HeLa 細(xì)胞（以1×105/孔的密度）接種到24 孔板，細(xì)胞分為3 組：DMSO 組（對(duì)照組）、KT-5823 組（實(shí)驗(yàn)組）、實(shí)驗(yàn)組+自噬抑制劑組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。預(yù)實(shí)驗(yàn)自噬抑制劑選取的劑量分別為10、30、50、70 μmol/L SBI 和100 μmol/L，過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，分別在對(duì)應(yīng)孔加入自噬抑制劑SBI-0206965 刺激2 h，然后加入3 μmol/L 的KT-5823 刺激24 h，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GarphPad Prism9.0、SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖能力的影響 CCK8結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖1A），3～100 μmol/L不同濃度的KT-5823 均可明顯抑制HeLa 細(xì)胞的增殖（3 μmol/L：t=10.23，P=0.000 5；5 μmol/L：t=10.65，P=0.000 4；10 μmol/L：t=14.28，P=0.000 1；30 μmol/L：t=13.22，P=0.000 2；50 μmol/L：t=14.83，P=0.000 1；70 μmol/L：t=12.10，P=0.000 3；100 μmol/L：t=13.56，P=0.000 2），且3 μmol /L KT-5823 接近半數(shù)抑制濃度。顯微鏡圖片顯示（圖1B），KT-5823 刺激HeLa細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞形態(tài)從規(guī)則梭形變成圓形并出現(xiàn)細(xì)胞碎片，這種形態(tài)變化隨濃度的增加而逐漸加劇。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖1C），隨KT-5823 的濃度增加，PKG1 蛋白表達(dá)水平逐漸降低（1 μmol/L：t=10.01，P=0.000 6；3 μmol/L：t=13.83，P=0.000 2；5 μmol/L：t=11.86，P=0.000 3；10 μmol/L：t=14.17，P=0.000 1）。綜合考慮，最終選取了濃度梯度中的有效劑量3 μmol/L 用于后續(xù)研究。

圖1 KT-5823 可有效抑制HeLa 細(xì)胞的增殖能力Fig 1 KT-5823 can effectively inhibit the proliferation of HeLa cells

2.2 KT-5823 對(duì)PKG1 的抑制作用 RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖2A），實(shí)驗(yàn)組PKG1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（t=13.56，P=0.000 2）；免疫印跡實(shí)驗(yàn)與RT-qPCR 結(jié)果一致，與對(duì)照組相比（圖2B），實(shí)驗(yàn)組PKG1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=5.461，P=0.005 5），KT-5823 可明顯抑制PKG1 的表達(dá)。

圖2 KT-5823 對(duì)PKG1 表達(dá)的影響Fig 2 Effect of KT-5823 on the expression of PKG1

2.3 KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖3A），KT-5823 可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞凋亡（t=10.78，P=0.004）。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖3B），KT-5823 可上調(diào)HeLa 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3 的表達(dá)（t=9.341，P=0.000 7），降低Bcl2/Bax 的比值（t=13.79，P=0.000 2）。

圖3 KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effects of KT-5823 on apoptosis in HeLa cells

2.4 KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞自噬的影響 轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒后，與對(duì)照組相比（圖4A），KT-5823可促進(jìn)GFP-LC3B 斑點(diǎn)的形成（t=10.12，P=0.000 5），表明KT-5823 可促進(jìn)Hela 細(xì)胞自噬體的形成。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖4B），KT-5823 可上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1 蛋白的表達(dá)（t=6.924，P=0.002 3；t=11.84，P=0.000 3），降低自噬相關(guān)通路蛋白p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的比值（t=5.194，P=0.006 5；t=12.78，P=0.000 2）。與蛋白結(jié)果一致，RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖4C），KT-5823可上調(diào)HeLa 細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA 的表達(dá)（t=8.359，P=0.001 1；t=5.782，P=0.004 4）。

圖4 KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞自噬的影響Fig 4 Effects of KT-5823 on autophagy in HeLa cells

2.5 自噬抑制劑SBI對(duì)KT-5823誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），與實(shí)驗(yàn)組相比，當(dāng)自噬抑制劑劑量超過(guò)10 μmol/L 后，隨自噬抑制劑劑量的增加，細(xì)胞凋亡也逐步增加（實(shí)驗(yàn)組+30 μmol/L SBI：t=7.616，P=0.001 6；實(shí)驗(yàn)組+50 μmol/L SBI：t=15.43，P=0.000 1；實(shí)驗(yàn)組+70 μmol/L SBI：t=11.01，P=0.000 4；實(shí)驗(yàn)組+100 μmol/L SBI：t=15.39，P=0.000 1）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KT-5823 聯(lián)合SBI-0206965 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig 5 Effects of KT-5823 combined with SBI-0206965 on apoptosis detected by flow cytometry assay

3 討論

KT-5823 是一種可穿透細(xì)胞膜的PKG 特異性抑制劑，可用于細(xì)胞研究。因PKG 存在組織器官差異，研究多集中于心臟[12]、血管[13]、成纖維細(xì)胞[14]等方面。近年來(lái)，PKG 與腫瘤的研究逐漸豐富，研究表明PKG 對(duì)腫瘤有促進(jìn)作用[6-8]，因此筆者對(duì)抑制PKG是否可用于宮頸癌治療進(jìn)行了探索。本研究首先應(yīng)用CCK-8 檢測(cè)了不同濃度的KT-5823 對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KT-5823 在3 μmol/L以上濃度均可顯著抑制HeLa 細(xì)胞的增殖能力，且隨KT-5823 刺激濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。與CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，分別用3、5、10 μmol/L KT-5823 刺激細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯加劇的毒性變化，表現(xiàn)為變圓變亮的細(xì)胞比例逐漸增加。這與不同劑量KT-5823 對(duì)PKG1 活性的抑制程度有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了KT-5823 具有抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

細(xì)胞凋亡是一種多基因參與調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡形式[15]。Caspase 3 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，執(zhí)行凋亡過(guò)程。Bax 和Bcl-2 同屬于Bcl-2 家族蛋白，Bcl-2 是一種抑制凋亡的基因，主要通過(guò)阻止線粒體釋放凋亡因子來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax 是一種促凋亡基因。正常情況下，Bax 和Bcl-2 以適當(dāng)?shù)谋壤嬖冢艿酵饨绲蛲鲂盘?hào)刺激后，二者的含量或比例會(huì)發(fā)生變化。當(dāng)Bcl-2 表達(dá)增多時(shí)，會(huì)促使Bax/Bax 復(fù)合體解離，進(jìn)而與Bcl-2結(jié)合形成更加牢固的Bcl-2/Bax 異源二聚體，抑制凋亡的發(fā)生；當(dāng)Bax 表達(dá)增多時(shí)，Bax/Bax 同二聚體會(huì)明顯增多，進(jìn)而激活Caspase 家族蛋白[16]。前期的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KT-5823 能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究KT-5823 對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3、Bcl-2、Bax 蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，KT-5823 可提高促凋亡相關(guān)基因Caspase 3、Bax 的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax 比值。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KT-5823 可通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase 3、Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與前人關(guān)于抑制cGMP/PKG 通路可抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[17]。

自噬是一種降解和消除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器的分解代謝過(guò)程[18]。自噬在腫瘤細(xì)胞中具有雙重作用，一方面腫瘤細(xì)胞可利用自噬對(duì)受損細(xì)胞器和陳舊蛋白質(zhì)進(jìn)行機(jī)械化降解，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，且在面對(duì)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)激活自噬免除細(xì)胞死亡[19]；另一方面當(dāng)自噬超過(guò)閾值時(shí)，可能會(huì)引發(fā)自噬性細(xì)胞死亡或激活其他細(xì)胞死亡方式，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。筆者首先通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒探究了抑制PKG1 對(duì)宮頸癌細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，KT-5823 能夠增加宮頸癌細(xì)胞自噬泡的形成。然后通過(guò)RT-qPCR 和免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)自噬基因LC3Ⅱ、Beclin1 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1 表達(dá)水平增加。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是經(jīng)典的自噬通路，mTOR 是調(diào)節(jié)自噬的明星因子[21]。此信號(hào)通路也是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制細(xì)胞凋亡[22]?；诖?，筆者研究了KT-5823 刺激后Akt-mTOR 信號(hào)通路的變化，發(fā)現(xiàn)p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR 比值降低。以上研究結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞在KT-5823 刺激后，可通過(guò)抑制Akt-mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加。為了探究自噬在宮頸癌細(xì)胞PKG1 抑制中的作用，筆者應(yīng)用了自噬特異性抑制劑SBI-0206965，發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑與PKG1抑制劑KT-5823 共處理宮頸癌細(xì)胞后，與單獨(dú)使用KT-5823 處理組相比，細(xì)胞凋亡率增加，且隨自噬抑制劑劑量的增加細(xì)胞凋亡程度加劇。結(jié)果表明，KT-5823 干預(yù)后細(xì)胞上調(diào)的自噬水平并未達(dá)到自噬過(guò)度激活的閾值，而是發(fā)揮降低KT-5823 刺激造成不利影響的保護(hù)作用。這也表明KT-5823 通過(guò)聯(lián)合靶向抑制自噬可提高抗宮頸癌治療的效果。

綜上所述，本文證實(shí)PKG 特異性抑制劑KT-5823可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)調(diào)控Caspase 3/Bax/Bcl2 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，KT-5823 抑制PKG 后，宮頸癌細(xì)胞可通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR 信號(hào)通路發(fā)生保護(hù)性細(xì)胞自噬，而抑制這種自噬可進(jìn)一步加劇宮頸癌細(xì)胞死亡。在未來(lái)筆者準(zhǔn)備進(jìn)一步研究PKG 基因敲除對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用，同時(shí)可加入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持驗(yàn)證。總之，本研究為靶向PKG治療宮頸癌提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，為臨床治療提供了新的靶點(diǎn)。