劉雪薇, 趙 瑋, 胡文朝, 張小軍

(山西農業(yè)大學園藝學院,山西 晉中 030801)

樹莓(Rubusidaeus.L)為薔薇科懸鉤子屬多年生灌木果樹,其果實口味酸甜,柔嫩多汁,香味濃郁,色澤艷麗,富含酚類物質,與藍莓同屬“第3代水果”[1-2]。酚類物質具有較強的抗氧化活性,可降低膽固醇、調節(jié)血脂、降血糖、抗癌、減肥,對人體健康非常有益,因其在植物的根系、葉片、果實和種子等器官中普遍存在[3-4],又被稱為植物多酚。樹莓葉含有多酚、黃酮、原花青素、水楊酸和鞣花酸等活性成分,且含量明顯高于果實,具有更高的抗氧化能力,可作為天然的抗氧化劑來源[5-7]。

茉莉酸甲酯( methyl jasmonate,MeJA) 是茉莉酸的衍生物,其在植物色澤形成、糖酸代謝、酚類物質合成代謝及抗氧化能力等方面具有重要調控作用[8-10]。目前,有關外源MeJA調控植物酚類物質含量和抗氧化活性的研究已有較多報道。如季悅等研究發(fā)現 MeJA 處理可提高鮮切菠蘿總酚含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力[11]。外源MeJA處理可促進‘黑比諾’葡萄果皮中酚類物質的積累并提高葡萄果皮抗氧化能力[10]。然而有關外源MeJA影響樹莓酚類物質含量及抗氧化活性的研究鮮有報道。本研究擬通過對‘秋金’樹莓葉片噴施不同濃度MeJA,研究外源MeJA對樹莓葉片酚類物質含量及抗氧化活性的影響,為提高樹莓葉利用價值提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料為3年生‘秋金’黃樹莓盆栽苗,管理期間去除結果枝,每株保留1年生枝6根。2022年7月2日,選取無病蟲害、長勢較一致的植株,先進行枝條摘心處理,然后分別用0 mmol/L(對照)、0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L MeJA(均含0.1% Tween80)進行整株迷霧噴施處理。每處理3株,設3次重復,共36株。處理后0 d、3 d、6 d、9 d、15 d每處理隨機采取枝條上部葉片6片,冷凍干燥后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酚類物質的提取

將適量冷凍干燥的樹莓葉片放入研缽中,加液氮研磨成粉末,稱取樣品粉末0.5 g,加入10 ml提取液(70%甲醇內含0.1%乙酸混合液),25 ℃超聲波提取30 min,隨后在離心力10 000 g條件下離心10 min。同等條件下再提取1次,合并2次提取液4 ℃保存待用。

1.2.2 總酚、總黃酮和原花青素含量測定

總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[3],以沒食子酸為標樣做標準曲線,結果以沒食子酸當量表示,單位為mg/g 。

總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[3],以蘆丁為標樣做標準曲線,結果以蘆丁當量表示,單位為 mg/g。

原花青素含量測定采用香草醛-硫酸法[12],以兒茶素為標樣做標準曲線,結果以兒茶素當量表示,單位為 mg/g。

1.2.3 DPPH和ABTS 測定抗氧化性

DPPH自由基清除能力測定參照吳乾等[3]的方法進行。稱取0.019 716 g DPPH用適量無水乙醇溶解,隨后用無水乙醇定容至500 mL,使溶液濃度達到 0.1 mmol/L,配制好的溶液置于棕色燒瓶中并用錫箔紙包裹,4 ℃保存。測定時取100 μL 提取液,加入 4 mL DPPH 溶液,振蕩 30 s使二者充分混勻,暗反應 30 min 之后測定反應液517 nm 波長下的吸光度。結果以清除百分率來表示。

ABTS陽離子自由基清除能力的測定參照吳乾等[3]的方法。分別配制 7 mmol/L ABTS 溶液和2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液,各取5 mL混合之后,于室溫暗反應 12 h 后制成ABTS儲備液,避光保存。測定時用乙醇將 ABTS儲備液稀釋成 734 nm 波長下吸光度0.70±0.02 的工作液。之后將50 μL 提取液與 4 mL ABTS工作液混合,暗反應6 min后測定反應液734 nm 波長下的吸光度。結果以清除百分率來表示。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2018進行數據整理及繪圖,運用SPSS 21軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理樹莓葉片總酚含量的動態(tài)變化

由圖1可知,不同濃度MeJA處理與對照葉片總酚含量隨處理時間的延長均呈先升高后降低趨勢,各處理峰值均在3 d時出現(62.72、78.7、74.71、68.49 mg/g)。3 d時,不同處理間總酚含量呈顯著性差異(P<0.05)。除對照外,其余處理總酚含量較0 d均顯著增加,其中0.5 mmol/L處理增幅最大(34.78%),其次為1 mmol/L處理(23.69%),1.5 mmol/L處理增幅為20.13%。6 d至15 d各處理總酚含量均逐漸降低,15 d時各處理總酚含量分別為：CK(47.44 mg/g)、0.5 mmol/L(66.13 mg/g)、1 mmol/L(44.43 mg/g)、1.5 mmol/L(41.45 mg/g),較3 d時降低了13.43%～40.53%。上述結果表明,適宜濃度的MeJA處理可提高‘秋金’樹莓葉片總酚含量,但高濃度的MeJA亦可加速葉片成熟,促進總酚含量的減少。

圖1 不同處理葉片總酚含量的動態(tài)變化注：圖中的數據為平均值±標準差,小寫字母表示差異顯著(P<0.05),其余圖同。

2.2 不同處理樹莓葉片總黃酮含量的動態(tài)變化

由圖2可知,不同濃度MeJA處理與對照葉片總黃酮含量隨處理時間的延長均呈先增加后降低趨勢。0.5 mmol/L處理總黃酮含量峰值6 d時出現(40.6 mg/g),其余處理總黃酮含量峰值均在3 d 時出現,分別為：CK(33.51 mg/g)、1 mmol/L(35.03 mg/g)、1.5 mmol/L(32.81 mg/g),且差異不顯著。隨后,各處理葉片總黃酮含量開始逐漸降低。6 d至15 d時對照、1 mmol/L和1.5 mmol/L處理總黃酮含量顯著低于0.5 mmol/L處理。6 d至15 d時1.5 mmol/L處理與對照無顯著性差異。

上述結果表明,不同濃度MeJA處理對樹莓葉片總黃酮含量的影響存在差異,0.5 mmol/L MeJA處理可有效提高‘秋金’葉片總黃酮含量。

圖2 不同處理葉片總黃酮含量的動態(tài)變化

2.3 不同處理樹莓葉片原花青素含量的動態(tài)變化

由圖3可知,不同濃度MeJA處理與對照樹莓葉片中酚類物質含量隨著處理時間的延長均呈下降趨勢。0 d至15 d時各處理葉片原花青素含量減少了35.88%～54.54%。3 d時各處理葉片原花青素含量無明顯差異,6 d時1 mmol/L 處理原花青素含量顯著低于(P<0.05)其他處理,9 d和15 d 時0.5 mmol/L處理原花青素含量顯著低于其他處理。上述結果表明 MeJA對樹莓葉片原花青素的積累具有抑制作用,且0.5 mmol /L MeJA 作用最顯著。

圖3 不同處理葉片原花青素含量的動態(tài)變化

2.4 不同處理葉片提取物DPPH自由基清除率分析

DPPH自由基清除能力是評價植物酚類物質體外抗氧化活性的有效方法。由圖4可知,各處理葉片提取物DPPH自由基清除率整體變化趨勢呈先升后降,且不同處理間存在差異。0.5 mmol/L處理6 d時清除率最大(69.48%),其余處理均在3 d 時出現峰值,分別為：CK(55.44%)、1 mmol/L(60.9%)、1.5 mmol/L(59.17%)。隨后,不同處理DPPH自由基清除率均不同程度降低。處理后3 d至15 d,0.5 mmol/L MeJA處理葉片提取物DPPH自由基清除率均顯著高于(P<0.05)其他處理。處理后6 d至15 d,1.5 mmol/L組DPPH自由基清除率顯著低于對照組。上述結果表明,0.5 mmol /L MeJA處理可有效提高‘秋金’樹莓葉片提取物DPPH自由基清除率,提高抗氧化能力。

圖4 不同處理葉片DPPH自由基清除率

2.5 不同處理葉片提取物ABTS陽離子自由基清除率分析

ABTS陽離子自由基清除率分析亦是評價酚類物質體外抗氧化活性的可靠方法之一。由圖5可以看出,不同處理葉片提取物ABTS陽離子自由基清除率整體變化趨勢呈先升后降,但不同處理間存在差異。0.5 mmol/L處理6 d時清除率最大(75.20%),其余處理均在3 d 時出現峰值,分別為：CK(61.35%)、1 mmol/L(71.5%)、1.5 mmol/L(68.04%)。隨后,不同處理ABTS陽離子自由基清除率均不同程度降低。處理后3 d至15 d,0.5 mmol/L MeJA處理葉片提取物ABTS陽離子自由基清除率均顯著高于(P<0.05)其他處理。處理后6 d至9d,對照組ABTS陽離子自由基清除率顯著低于1 mmol/L和1.5 mmol/L組。15 d時對照組顯著高于1.5 mmol/L組。上述結果表明,0.5 mmol /L MeJA處理可有效提高‘秋金’樹莓葉片提取物ABTS陽離子自由基清除率。

圖5 不同處理葉片ABTS+·自由基清除率

2.6 酚類物質含量與抗氧化活性相關性分析

對樹莓葉片酚類物質(總酚、總黃酮、原花青素)含量與抗氧化活性(DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力)進行相關性分析,結果如表1所示,‘秋金’樹莓葉片提取物中總酚含量與DPPH自由基清除率(r=0.852,P< 0.05)呈顯著正相關關系,與ABTS陽離子自由基清除能力(r=0.704,P<0.05)呈顯著正相關關系;DPPH自由基清除率與ABTS陽離子自由基清除率之間呈極顯著相關性,相關系數為0.922(P< 0.01)。上述結果表明,‘秋金’樹莓葉片提取物活性成分中總酚對其抗氧化活性的貢獻最高。

表1 樹莓葉片提取物活性成分與其抗氧化活性的相關性分析

3 討論與結論

茉莉酸甲酯作為廣泛存在于植物體內的新型植物生長調節(jié)物質,參與調控植物生長發(fā)育、抗逆性以及酚類物質、生物堿等次級代謝產物的合成。孫永蓉等[10]研究發(fā)現1 mmol/L MeJA噴施處理能夠促進葡萄果皮中酚類物質的積累。陳春曉等[13]研究表明5 μmol/L MeJA熏蒸處理能有效提高楊梅果實中總酚、總黃酮的含量。本研究通過不同濃度MeJA噴施處理,測定分析葉片總酚、總黃酮、原花青素含量,探究外源MeJA對‘秋金’樹莓葉片總酚、總黃酮和原花青素等的影響。分析結果發(fā)現,MeJA處理的葉片原花青素含量則不斷下降,而葉片前期總酚和總黃酮含量均有增加,這與翟雪琴等[14]在煙草上的研究結果類似。此外,不同濃度MeJA處理后葉片活性組分含量存在較大差異。王燕芳等[15]研究表明0.5 mmol/L MeJA處理棉葉第4 d時酚類物質含量顯著高于其他濃度處理。本研究發(fā)現0.5 mmol/L MeJA處理樹莓葉片中的總酚、總黃酮在6 d時顯著高于其他處理,這與已有研究結果類似,但總酚含量存在差異,可能是由于物種不同所致。處理后期,總酚、總黃酮亦出現下降趨勢,但與其他處理相比,0.5 mmol/L MeJA處理能明顯降低樹莓葉片中總酚和總黃酮等抗氧化活性成分的下降速度,這與付安珍等[16]在青圓椒中的研究結果類似。

為進一步探究外源MeJA對樹莓葉片提取物活性成分抗氧化能力的影響。本研究采用DPPH和ABTS法測定分析不同處理樹莓葉片DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的差異。結果發(fā)現,各處理DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率變化趨勢均為先升后降,與總酚的變化趨勢較一致。陳春曉等[13]研究發(fā)現0.5 mmol/L MeJA可以有效提高楊梅果實DPPH自由基清除能力。孫永蓉等[10]研究表明,1 mmol/L MeJA能夠提高葡萄果皮中DPPH自由基清除能力。本研究中0.5 mmol/L MeJA處理較對照、1 mmol/L和1.5 mmol/L處理樹莓葉片提取物保持較高的DPPH 自由基清除能力,這與楊梅和葡萄的研究結果較一致。為明確‘秋金’樹莓葉片提取物活性成分與抗氧化活性的相關性,對樹莓葉片總酚、總黃酮、原花青素等主要活性物質含量與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力進行了相關性分析。結果發(fā)現總酚含量與DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力均呈顯著正相關,總酚對樹莓葉片抗氧化性的貢獻最高,這與前人的研究結果較一致[7,17]。綜上表明適宜濃度的外源MeJA可有效提高樹莓葉片中總酚和總黃酮的含量,使葉片提取物保持較高抗氧化能力,且處理效果以0.5 mmol/L MeJA最佳。