趙 珂，程守前，劉小雙，王連倩，陳湛娟，于飛飛，高亞男*

（1. 海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2. 齊魯制藥（海南）有限公司，海南 ?？?570314）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科番木瓜屬植物，又名萬壽果。目前我國主要種植在廣東、海南、廣西、云南、福建等熱帶、亞熱帶地區(qū)。番木瓜屬藥食同源類食品，目前關(guān)于番木瓜的研究主要集中在其果實(shí)及種子。研究表明，其果實(shí)中含豐富的木瓜蛋白酶、類胡蘿卜素、黃酮類、萜烯類、多酚類和生物堿等多種營養(yǎng)成分和植物化學(xué)物質(zhì)，種子中含大量的異硫氰酸酯類和硫代葡萄糖苷類物質(zhì)，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)及抗炎、抑菌等作用[1-7]。而番木瓜葉作為番木瓜的可再生附加物鮮有研究，目前僅有番木瓜葉中含番木瓜堿類、黃酮類、酚類等的報(bào)道，關(guān)于其進(jìn)一步的藥理活性研究甚少。番木瓜葉在印度及澳大利亞有廣泛的民間藥用報(bào)道，主要用于治療發(fā)燒、哮喘、腳氣病、腹絞痛及預(yù)防和治療癌癥[8-9]。

多酚類物質(zhì)是一族在分子結(jié)構(gòu)中含若干個(gè)酚羥基的化合物，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物體內(nèi)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗癌及輔助治療心血管疾病等多種生物功能[10-11]。本文采用超聲輔助提取番木瓜葉中的多酚，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響提取番木瓜葉多酚含量較大的因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，最大程度地對多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，并對提取物中多酚類物質(zhì)的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為番木瓜葉的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

SK3210HP 型超聲儀（上?？茖?dǎo)）；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義予華）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義予華）；LYSF-200-B2型超高速多功能粉碎機(jī)（長沙卓成）；TD4C離心機(jī)（長沙英泰）；TP-520A電子天平（湘儀天平）。

1.2 材料

番木瓜葉，采摘于海南省海口市龍華區(qū)，清洗干凈后于40 ℃烘箱烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，備用；無水乙醇（西隴科學(xué)）；維生素C（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；沒食子酸（源葉生物）；三氯化鐵（廣州化學(xué)試劑廠）；福林酚（源葉生物）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，源葉生物）；鐵氰化鉀（廣州化學(xué)試劑廠）；三氯乙酸（羅恩）；碳酸鈉（西隴科學(xué)）。

2 方法

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

采用Folin-Ciocalteu法測定總多酚含量[12]。精密稱取沒食子酸對照品10.00 mg，置入100 ml量瓶，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.1 mg/ml沒食子酸對照品溶液。分別精密量取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml沒食子酸對照品溶液，置于7支10 ml比色管中，分別編號(hào)0～6，每管均加入1 ml福林酚顯色劑，振搖后放置2 min，再加入10 %碳酸鈉溶液5 ml，純水稀釋至刻度，搖勻后室溫避光放置1 h，以0號(hào)管為空白，在波長760 nm處測定0～6管的吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，760 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 番木瓜葉多酚的提取和測定

稱取番木瓜葉粉末2.0 g，置于帶蓋的錐形瓶中，按液料比加入提取溶劑，在一定溫度、功率下，超聲提取一定時(shí)間，冷卻過濾，并進(jìn)行減壓濃縮，再用純水稀釋至100 ml，搖勻，備用。精密吸取上述樣品溶液0.3 ml，按2.1項(xiàng)下方法配制樣品溶液，并測定其吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3 番木瓜葉多酚提取工藝條件的確定

2.3.1 單因素試驗(yàn)[13]

2.3.1.1 乙醇濃度 稱取6份番木瓜葉粉末，每份2.0 g，按液料比20:1分別加入40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %乙醇，在超聲功率100 W，溫度50 ℃條件下提取60 min，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3.1.2 液料比 稱取6份番木瓜葉粉末，每份 2.0 g，按液料比5:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1 ml/g分別加入70 %乙醇，在超聲功率100 W，溫度50 ℃條件下提取60 min，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3.1.3 提取溫度 稱取5份番木瓜葉粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 % 乙醇，分別在超聲溫度為20，30，40，50，60 ℃，超聲功率100 W條件下提取60 min，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3.1.4 提取時(shí)間 稱取7份番木瓜葉粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 %乙醇，在超聲功率100 W，超聲溫度50 ℃條件下，分別提取 20，40，60，80，100，120，150 min，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3.1.5 超聲功率 稱取5份番木瓜葉粉末，每份2.0 g，按液料比20:1加入70 %乙醇，分別在超聲功率 60，80，100，120，150 W，超聲溫度50 ℃條件下提取60 min，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。

2.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選用乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、超聲功率作為Box-Behnken自變量，以番木瓜葉多酚含量為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH·清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[14]方法測定。

2.4.2 還原力的測定 參照文獻(xiàn)[15]的方法測定。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Dexign-Expert 8.0.6.1設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，760 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.1327x-0.1151，相關(guān)系數(shù)r=0.9985。

3.2 各單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對番木瓜葉提取物多酚含量的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可見，當(dāng)乙醇濃度在40 %～50 %濃度范圍時(shí)，隨乙醇濃度上升，多酚含量增加；在乙醇濃度在50 %～90 %范圍內(nèi)時(shí)，隨乙醇濃度下降，多酚含量呈下降趨勢，這可能是由于乙醇濃度過高會(huì)使蛋白質(zhì)等大分子變性沉淀，阻礙多酚從組織細(xì)胞內(nèi)向提取溶劑擴(kuò)散[16]。因此，選擇合適的乙醇濃度為50 %。

3.2.2 液料比對番木瓜葉提取物多酚含量的影響 結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對番木瓜葉提取物多酚含量的影響

由圖2可見，多酚含量隨液料比的增加而迅速增大，這是由于提取溶劑的增加增大了番木瓜葉和提取溶劑的接觸面積，有利于多酚的溶出。液料比為15:1 ml/g時(shí)，多酚含量達(dá)最大，之后隨液料比的增加而逐漸降低，這可能是由于液料比的增加致更多的雜質(zhì)溶出，從而降低提取效果[17]。因此，選擇液料比15:1 ml/g。

3.2.3 提取溫度對番木瓜葉提取物多酚含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對番木瓜葉提取物多酚含量的影響

由圖3可見，隨著提取溫度的升高，多酚含量先增加后下降，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，多酚含量最高。溫度升高可提高番木瓜葉多酚的含量，但溫度過高可能導(dǎo)致多酚物質(zhì)被分解，從而降低多酚含量。因此，選擇提取溫度為50 ℃。

3.2.4 提取時(shí)間對番木瓜葉提取物多酚含量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對番木瓜葉提取物多酚含量的影響

由圖4可見，隨著提取時(shí)間的延長，多酚含量逐漸增加，且在超聲100 min時(shí)趨于平衡，這可能是由于超聲時(shí)間達(dá)100 min時(shí)，多酚基本已溶出，超聲時(shí)間過長，有可能增加雜質(zhì)的溶出，且提取的成本也會(huì)增加，因此選取超聲時(shí)間為120 min。

3.2.5 超聲功率對番木瓜葉多酚含量提取的影響 結(jié)果見圖5。

圖5 超聲功率對番木瓜葉提取物多酚含量的影響

由圖5可見，超聲功率為60～120 W時(shí)，多酚含量隨超聲功率的增大而升高，超聲功率大于120 W時(shí)，多酚含量反而呈下降趨勢，推測功率過高會(huì)使此成分分解。因此，選擇最適宜的超聲功率為120 W。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間及超聲功率對多酚含量影響顯著的因素進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對表 2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合， 得回歸方程： 多酚含量=11.60-2.11A+0.25B+0.12C+0.19D+0.67AB-0.45AC+0.14AD+0.095BC+0.35BD-0.19CD-1.42A2-1.26B2-1.52C2-0.89D2, 方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型極其顯著，失擬項(xiàng)（P=0.3914＞0.05）不顯著，試驗(yàn)誤差小，表明未知因素對結(jié)果影響較小。R2=0.9486，R2adj=0.8972，表明模型擬合程度良好。根據(jù)P值可知，一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2對多酚含量影響極其顯著，AB的P值小于0.05，表明其對提取物的多酚含量影響顯著。由F值的大小可判斷各因素對多酚含量的影響大小依次為乙醇濃度＞液料比＞超聲功率＞提取時(shí)間。響應(yīng)面分析見圖6。

表3 方差分析表

圖6 各因素交互作用對番木瓜葉提取物多酚含量的影響

3.4 最佳提取工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

由以上結(jié)果確定最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度52.97 %，液料比16.23 ml/g，提取時(shí)間123.65 min，超聲功率84.36 W，番木瓜葉提取物中多酚含量為12.33 mg/g，考慮到生產(chǎn)操作的實(shí)際情況及節(jié)約成本，將其修正為乙醇濃度53 %，液料比16 ml/g，提取時(shí)間124 min，超聲功率90 W。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得多酚含量為12.29 mg/g，與預(yù)測值12.33 mg/g接近，表明模型預(yù)測性良好。

3.5 抗氧化性活性分析

3.5.1 番木瓜葉多酚對DPPH自由基的清除作用結(jié)果見圖7。

圖7 番木瓜葉多酚對DPPH自由基的清除能力

由圖7可見，番木瓜葉多酚濃度為0.2～1.0 mg/ml時(shí)，隨著多酚濃度的不斷增加，對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢。番木瓜葉多酚濃度為1.0 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)90.92 %，接近同濃度的維生素C（92.01 %）。

3.5.2 番木瓜葉多酚的鐵離子還原能力 結(jié)果見圖8。

圖8 番木瓜葉多酚的鐵離子還原能力

由圖8可見，番木瓜葉多酚在0.2～1.0 mg/ml濃度范圍內(nèi)時(shí)，隨著多酚濃度的不斷增加，其鐵離子還原能力呈上升趨勢。番木瓜葉多酚濃度為1.0 mg/ml時(shí)，其鐵離子還原能力與同濃度維生素C溶液的鐵離子還原能力相接近。

4 結(jié)論

本研究以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取番木瓜葉多酚的工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度及乙醇濃度和液料比的交互作用對番木瓜葉提取物多酚含量有顯著影響，各因素對番木瓜葉提取物多酚含量影響的主次順序如下：乙醇濃度＞液料比＞超聲功率＞提取時(shí)間。番木瓜葉多酚最佳提取工藝參數(shù)如下：乙醇濃度53 %，液料比16 ml/g，提取時(shí)間124 min，超聲功率90 W，在此條件下，測得番木瓜葉提取物多酚含量為12.29 mg/g。此外，體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，番木瓜葉多酚對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，清除率可高達(dá)90.92 %（多酚濃度為1.0 mg/ml）；對鐵離子也具有較好的還原能力。本研究將為番木瓜葉的進(jìn)一步研究提供重要的參考依據(jù)。