唐清泰

（ 鯤鵬基因（北京）科技有限責(zé)任公司，北京 102206 ）

0 引言

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，核酸檢測已經(jīng)成為病原微生物鑒定的常用手段。PCR 實(shí)時熒光檢測是實(shí)現(xiàn)核酸檢測的關(guān)鍵技術(shù)，對熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行研究，特別是對多色、多通道以及多靶標(biāo)檢測模塊進(jìn)行開發(fā)可以達(dá)到提高儀器性能、擴(kuò)大儀器適用范圍的目的[1]。

該文在相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，以AXT-12 核酸提純以及PCR 檢測一體機(jī)（簡稱一體機(jī)）熒光掃描系統(tǒng)為研究對象，重點(diǎn)對系統(tǒng)的核心模塊（4 通道（FAM、VIC、ROX以及CY5）熒光掃描頭）進(jìn)行研究，并對結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。

1 光學(xué)系統(tǒng)開發(fā)設(shè)計(jì)

1.1 應(yīng)用背景

一體機(jī)熒光掃描系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。系統(tǒng)共有12 個熱循環(huán)模塊，每個模塊上包括2 個反應(yīng)管孔（放置PCR 反應(yīng)管），12 個熱循環(huán)模塊放置在蛇形冷卻水倉上面，水倉上包括進(jìn)/出冷卻水接頭，在PCR 擴(kuò)增的過程中，通過冷卻水接頭不斷注入冷卻液來實(shí)現(xiàn)快速熱交換的功能。4 通道熒光掃描頭放置在水倉的下方，在步進(jìn)電機(jī)傳動系統(tǒng)的帶動下可以快速移動，以底部掃描的方式對反應(yīng)管中發(fā)出的熒光信號進(jìn)行檢測。

圖1 熒光掃描系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

1.2 光路設(shè)計(jì)原理

光路設(shè)計(jì)是整個熒光掃描檢測系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，也是熒光掃描頭的核心[2]，該部分的主要工作是通過單色LED光源將激發(fā)光匯聚到樣品上，激發(fā)樣品上的熒光素分子產(chǎn)生熒光，熒光信號通過匯聚光路匯聚到MPPC 上，以生成光電流，再通過AMP 轉(zhuǎn)換電路生成可供A/D（16 位）進(jìn)行采樣的電信號。它主要包括激發(fā)光路和發(fā)射光路2 個部分，光學(xué)系統(tǒng)單通道光路結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.1 激發(fā)光路

激發(fā)光路由光源LED 發(fā)出的單色激發(fā)光經(jīng)過平凸鏡進(jìn)行準(zhǔn)直后，由激發(fā)光濾光片EXF 變?yōu)椴ㄩL更窄的窄帶激發(fā)光照射到二向色鏡DM 上，二向色鏡的功能是可以反射激發(fā)光、透射熒光，由二向色鏡反射的激發(fā)光入射到激發(fā)平凸鏡上，經(jīng)激發(fā)平凸鏡匯聚后聚焦到樣品上，誘導(dǎo)熒光染料產(chǎn)生熒光。

1.2.2 發(fā)射光路

激發(fā)光誘導(dǎo)熒光染料產(chǎn)生的熒光經(jīng)過激發(fā)平凸鏡收集后變成平行熒光光束入射到二向色鏡DM 上，經(jīng)二向色鏡DM 透射后入射到發(fā)射濾光片EMF 上，以濾除雜散光，濾除雜散光后的平行熒光經(jīng)過發(fā)射平凸鏡聚焦，形成熒光光斑，熒光光斑打在檢測器MPPC 上，產(chǎn)生與該熒光強(qiáng)度匹配的電信號。

1.2.3 光路選型

一體機(jī)采用4 色4 通道（FAM、VIC、ROX 以及CY5）熒光掃描系統(tǒng)，根據(jù)掃描頭的整體設(shè)計(jì)需求、各通道光路的設(shè)計(jì)指標(biāo)和要求，激發(fā)/發(fā)射光路中各職能部件的選擇將直接決定光學(xué)性能。職能部件主要包括LED、濾光片、二向色鏡、探測器和凸鏡等，各光學(xué)元件的重要指標(biāo)類型及要求見表1。

表1 光學(xué)元件主要指標(biāo)及性能控制

由于各通道熒光基團(tuán)不同且存在斯托克斯位移[3]，因此各通道工作時所需最大激發(fā)光和發(fā)射光波長不同，發(fā)射光顏色也不同，見表2。

表2 通道光譜特性

由于各通道光譜特性的不同，所選用的LED 激發(fā)光源、激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片以及匹配的二向色鏡也不同，因此各通道性能差異較大。各通道熒光基團(tuán)所需激發(fā)匹配的單色光源，需要注意的是光源的強(qiáng)度，應(yīng)避免亮度過大引起染料出現(xiàn)“光漂白”現(xiàn)象，可以過LED 串接限流電阻來調(diào)整亮度。

根據(jù)各通道光譜特性及光學(xué)元器件的控制指標(biāo)要求，我公司聯(lián)合深圳納宏光電技術(shù)公司分別針對各通道定制了包括LED 激發(fā)光源在內(nèi)的光學(xué)器件，具體包括激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片以及二向色鏡等。

為了驗(yàn)證各通道所選光學(xué)器件的可行性，采用光譜儀分別對各通道的光譜特性進(jìn)行測量，得到各通道的傳輸光譜曲線，如圖3 所示。由圖3 可知，各通道中通過激發(fā)濾光片的光基本被二向色鏡完全反射，熒光的透射率基本也在50%以上，所選光學(xué)器件能夠滿足使用要求。

圖3 FAM、VIC、ROX 以及CY5 通道光譜特性

探測器采用濱松MPPC（多像素光子計(jì)數(shù)器）S13360 系列，與傳統(tǒng)的CCD、PD 或者PMT 不同，MPPC 表面貼裝型號為3050PE（3050PE 的光學(xué)特性見表3）和3075PE，由于3050PE 的量子效率及靈敏度已經(jīng)滿足檢測要求且它具有更優(yōu)越的單位面積像素率、價格更低，因此推薦使用前者。

表3 MPPC 光學(xué)特性

可以通過光譜響應(yīng)曲線（如圖4 所示）查詢S13360-3050PE 的光子靈敏度Sλ。由圖4 可知，MPPC 的靈敏度與熒光波長有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在可見光范圍內(nèi)，Sλ基本在8×104A/W以上。

圖4 光譜響應(yīng)曲線

該MPPC 的串?dāng)_概率P如圖5 所示，當(dāng)工作溫度為25 ℃且VOP=VBR+3 時（VOP為工作電壓；VBR為擊穿電壓），通過插補(bǔ)計(jì)算可知，串?dāng)_概率約為0.03。

圖5 MPPC 串?dāng)_概率

MPPC 的暗電流如公式（1）所示。

式中：Id為MPPC 的暗電流；N為暗計(jì)數(shù)，N=0.5p.e（p.e為電荷脈沖）；M為增益；q為電荷電量，q=1.60×10-19C；P為串?dāng)_概率。

1.3 光路仿真

對選用的光學(xué)器件來說，在Code V 中進(jìn)行建模，然后在Light Tools 中搭建光學(xué)系統(tǒng)模型，根據(jù)所選LED 的發(fā)光屬性進(jìn)行光線追跡，并對各通道進(jìn)行分析和優(yōu)化，單獨(dú)對ROX通道的激發(fā)、發(fā)射光路進(jìn)行追跡后的仿真模擬正視圖如圖6所示。由圖6 可知，該通道的激發(fā)、發(fā)射光路準(zhǔn)直度較強(qiáng)，熒光收集效率也比較高。用相同方法對其他通道光路的仿真也達(dá)到了相同的效果。

圖6 ROX 通道仿真模型

1.4 靈敏度驗(yàn)證

該文主要使用傳統(tǒng)方法來驗(yàn)證各通道的熒光收集效率和熒光激發(fā)能力。

熒光收集效率驗(yàn)證：各通道在最小分辨率下的熒光功率Fτ與靈敏度Sλ的乘積大于MPPC 的暗電流Id，即Fτ·Sλ>1.5Id，F(xiàn)τ如公式（2）所示。以此證明，在激發(fā)光強(qiáng)度足夠的情況下，系統(tǒng)能夠探測到熒光信號。

式中：Fτ為入射在探測器光窗上的熒光功率；h為普朗克常數(shù)，h=6.6×10-34J·s；c為真空中光速，c=3.0×1017nm/s；n為單位面積熒光分子個數(shù)；η為平凸鏡熒光收集效率，與透鏡數(shù)值孔徑NA有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T為光路綜合透過率，通常取50%；λ為發(fā)射熒光波長；τ為熒光的壽命。

熒光激發(fā)能力驗(yàn)證：根據(jù)比爾定律，在最小檢測分辨率下，各通道熒光功率F與MPPC 靈敏度Sλ的乘積大于MPPC的暗電流，即F·Sλ>1.5Id，F(xiàn)如公式（3）所示。以此證明，熒光激發(fā)能力充足，系統(tǒng)能夠檢測到最小靈敏度下的熒光分子。

式中：K為儀器常數(shù)，與光學(xué)系統(tǒng)綜合透過率和熒光收集效率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；φ為量子產(chǎn)率，與熒光波長有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各通道量子產(chǎn)率不同；I0為激發(fā)光強(qiáng)度（激發(fā)光輻射功率）；ε為分子吸收系數(shù)；c為樣品濃度；l為試樣光程。

通過計(jì)算和評估熒光激發(fā)能力和熒光收集效率再次證明了在激發(fā)光充足的情況下各通道理論上可以探測到熒光信號，并且能夠檢測到最小靈敏度下的熒光分子。后續(xù)的試驗(yàn)證明，各通道探測器MPPC 能夠滿足最小靈敏度為100 copies/mL 的檢測需求。

2 光學(xué)機(jī)械設(shè)計(jì)

光學(xué)機(jī)械是光學(xué)系統(tǒng)的外圍輔助設(shè)施，主要作用是固定、保護(hù)光學(xué)元件，協(xié)助實(shí)現(xiàn)光學(xué)性能，它保證整個光路及光路中各元件的密光性，同時保證各元件方便安裝、固定牢靠。一體機(jī)掃描頭在步進(jìn)電機(jī)傳動系統(tǒng)的帶動下頻繁加/減速、長距離連續(xù)移動，這就要求掃描頭各光路零部件高度集成、體積小且質(zhì)量輕。

多次優(yōu)化后，一體機(jī)掃描頭采用定制光學(xué)零部件，成功實(shí)現(xiàn)了4 通道小體積、輕量化集成的設(shè)計(jì)目標(biāo)。集成后，各通道中心間距為8.6 mm，主要光學(xué)零部件最大光軸直徑為6.0 mm，整體尺寸為36mm×23mm×18mm， 質(zhì)量約為40 g，工作距離6 mm～8 mm 或者14 mm～19 mm。

結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)完整光學(xué)性能的關(guān)鍵因素，在方案階段，應(yīng)堅(jiān)持在保證功能的前提下盡可能簡單，降低因環(huán)節(jié)增多而帶來失效風(fēng)險的概率，同時須注意以下6 個方面：1）固定鏡架和主體采用銷釘定位、過孔調(diào)節(jié)以及螺釘緊固的原則。2） 鏡片與固定機(jī)械間要設(shè)置彈性壓緊結(jié)構(gòu)，避免鏡片受到?jīng)_擊破裂。3） 做好密光處理，特別是LED 處和濾光片后的光路，避免激發(fā)光的交叉和對熒光信號的干擾。4） 遠(yuǎn)離熱源，預(yù)防光學(xué)元件因熱釋而導(dǎo)致性能下降。5） 整體發(fā)黑處理，避免因零部件變形而導(dǎo)致光路扭曲。6） 組裝后各部件密封線貼合部分用黑色密封膠填縫，避免外界雜散光的影響。

3 結(jié)語

設(shè)計(jì)多通道熒光檢測系統(tǒng)的目的是保證PCR 能在多色、多靶標(biāo)以及多樣本應(yīng)用下完成高精度、高穩(wěn)定性和高重復(fù)性的工作。在開發(fā)AXT-12 一體機(jī)的過程中，利用MPPC 作為熒光的終端探測器是實(shí)時熒光定量PCR 檢測的新嘗試。對基于MPPC 探測器的4 通道熒光掃描頭的關(guān)鍵核心——光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行理論分析、設(shè)計(jì)選型、仿真和計(jì)算，從理論上保證掃描頭的檢測能力，使其能夠正確解讀“S”形曲線，避免誤判。另外，對光學(xué)機(jī)械設(shè)計(jì)的討論和總結(jié)可以避免盲目開發(fā)，提高效率，節(jié)約設(shè)計(jì)成本。隨后的實(shí)況試驗(yàn)表明，基于MPPC 的一體機(jī)熒光掃描頭的設(shè)計(jì)是合理的，熒光檢測掃描系統(tǒng)也達(dá)到了預(yù)期要求。