李東澤，付 琳，任書杉，王 超，張向宇

（佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007）

阿托伐他汀鈣（ATC）廣泛用于治療高脂血癥，通過將β-羥［基］-β-甲戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）轉(zhuǎn)化為甲戊酸［1］以抑制膽固醇的生物合成，降低血液中膽固醇、低密度脂蛋白和三酰甘油的水平。但其水溶性差，生物利用度低，體內(nèi)半衰期短，消除速率快，單次大劑量口服可能導致肝功能異常及腎功能衰竭［2］，限制了臨床應用。故需應用類脂囊泡藥物遞送系統(tǒng)［3］、自乳化藥物遞送系統(tǒng)［4］、口腔黏膜給藥系統(tǒng)［5］、胃滯留緩釋給藥系統(tǒng)［6］、局部透皮給藥系統(tǒng)［7］、聚合物納米粒［8］等新型給藥系統(tǒng)，以改善ATC的疏水性，提高生物利用度。類脂囊泡是由非離子表面活性劑和膽固醇或膽固醇衍生物構(gòu)成的類脂質(zhì)雙分子層球囊結(jié)構(gòu)，具備包封親水性和親脂性物質(zhì)的能力［9-10］。類脂囊泡生物膜相容性良好［11］，可避免藥物在到達有效位點前被破壞，延長藥物半衰期，并起到被動靶向的作用［12-13］。響應面法是以數(shù)理統(tǒng)計為基礎(chǔ)，對設計點及因素進行數(shù)學建模集合，得到約束目標函數(shù)的響應面模型，進一步預測非試驗點響應值的試驗優(yōu)化方法，包括中心組合設計、全因素設計、Box - Behnken 設計等。Box - Behnken 響應面法優(yōu)化的擬合模型準確、可靠［14-15］，在各參數(shù)離散水平影響下得到最佳的條件組合及對應的最優(yōu)響應值，廣泛用于醫(yī)學、生物、化學等行業(yè)［16-18］。β- 谷甾醇是一種膳食植物甾醇［19］，具備與膽固醇相似的化學結(jié)構(gòu)和可生物降解的性能，在生物制藥領(lǐng)域中常作為膽固醇的替代物用于藥用輔料。本研究中采用薄膜-超聲分散法［20］制備以β- 谷甾醇和Span60 為囊材、包載ATC 的類脂囊泡（ATC-NIS），采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化處方工藝，分別從外觀形態(tài)、粒徑分布、包封率、載藥量、體外釋放性能等方面進行評價，以得到ATC-NIS 的最佳制備工藝及處方?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FA2004N 型電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司，精度為萬分之一）；TGL - 16GB 型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV765 型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ - 400KB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為220 W）；JY92 - 2D 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為900 W）；DF - 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

ATC 原料藥（武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號為J1203AS）；Span60（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號為O1013A）；β- 谷甾醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為S111182，含量＞95%）；乙腈、甲醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；醋酸銨、醋酸（天津凱通化學試劑有限公司）；透析袋（美國Union Carbide公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 類脂囊泡制備

采用薄膜-超聲分散法制備。稱取處方量的ATC、Span60和β-谷甾醇，溶于3.0 mL氯仿-甲醇（4∶1，V/V）的混合溶劑中，超聲（功率為88 W）使分散均勻，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃、減壓蒸發(fā)至有機溶劑揮發(fā)完全，在圓底燒瓶內(nèi)形成均一的透明薄膜，加入同溫適量蒸餾水，靜置孵育30 min后，置恒溫磁力加熱攪拌器（轉(zhuǎn)速為100 r/min）65 ℃加熱條件下水化1.0 h，得ATC-NIS 混懸液，轉(zhuǎn)移至超聲波細胞破碎機超聲處理（功率為200 W）5 min，即得ATC-NIS。

2.2 ATC 體外分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：醋酸銨緩沖液（醋酸調(diào)pH至4.5）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：246 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 方法學考察

專屬性試驗：分別取類脂囊泡和ATC - NIS，加入10倍體積甲醇超聲（功率為200 W）處理2 min，溶解，使類脂囊泡破碎，分別過0.22 μm有機相微孔濾膜，備用。加等量標準貯備液（質(zhì)量濃度為5 μg/mL），按2.2.1項下色譜條件進樣測定，并根據(jù)出峰情況考察藥物與類脂囊泡的特性?？瞻最愔遗輰TC 測定無干擾，ATC保留時間為5.20 min，理論板數(shù)、拖尾因子等均符合要求，特征峰與其他成分峰間的分離度均大于1.5，表明方法專屬性強。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

線性關(guān)系考察：取ATC 適量，用甲醇溶解，并分別稀釋為質(zhì)量濃度為5，10，15，20，30，40，50 μg/mL 的標準貯備液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=48.187C-74.23（R2=0.999 9，n=7）。結(jié)果ATC 質(zhì)量濃度在5～50 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：精密量取ATC 供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖的信噪比（S/N），分別以S/N為10 和3 時的進樣量確定最低定量限和最低檢測限。結(jié)果ATC 最低定量限和檢測限分別為0.617 ng和0.184 ng。

精密度試驗：分別取等體積10，20，40 μg/mL 不同質(zhì)量濃度的ATC供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，每日進樣5次，計算日內(nèi)精密度；另在每日同一時間內(nèi)進樣1 次，連續(xù)進樣5 d，計算日間精密度。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

表1 日內(nèi)和日間精密度試驗結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of intra-day and inter-day precision tests（n=5）

加樣回收試驗：取精密度試驗項下不同質(zhì)量濃度的ATC 供試品溶液，分別加入空白類脂囊泡液5.0 mL，經(jīng)適量甲醇稀釋得3 種質(zhì)量濃度貯備液，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定3 次，記錄峰面積，代入線性回歸方程，經(jīng)計算得3種質(zhì)量濃度下的加樣回收率分別為（100.65±0.84）%，（100.52±0.62）%，（100.38±0.67）%，RSD分別為0.84%，0.62%，0.67%（n=3），表明方法準確度好。

2.3 包封率與載藥量測定

量取2.1 項下ATC-NIS 混懸液1.0 mL，置離心管中離心（轉(zhuǎn)速為10 000 r/ min）10 min，棄上清液，加蒸餾水重新分散清洗沉淀2 次，加適量甲醇溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至25.0 mL 容量瓶中，定容，過0.22 μm 有機相濾膜，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，帶入線性回歸方程計算游離藥物量，按公式計算ATC-NIS 的包封率及載藥量。包封率（%）=（投藥量- 游離藥物量）/投藥量×100%，載藥量（%）=囊泡內(nèi)包封藥物量/囊泡質(zhì)量×100%。

2.4 工藝與處方因素水平確定

超聲時間：按2.1項下方法制備ATC-NIS，固定其他因素不變。只改變超聲時間［21］，設定超聲功率為200 W，超聲時間分別為5，8，10，12，15 min，考察超聲時間對類脂囊泡包封率的影響。超聲時間的長短會直接影響類脂囊泡的粒徑及包封率的大小，超聲時間過久可能會破環(huán)類脂囊泡的結(jié)構(gòu)而使藥物泄露。由圖2 A可知，經(jīng)單因素試驗確定超聲時間范圍為10～15 min。

Span60 與ATC 質(zhì)量比：按2.1 項下方法制備ATCNIS，固定其他因素不變。只改變Span60 與ATC 質(zhì)量比［22］，設定處方內(nèi)Span60 添加量為0.086 g，比例分別為4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1，考察Span60與ATC的比例對類脂囊泡包封率的影響。藥脂比是類脂囊泡構(gòu)成的關(guān)鍵因素，非離子表面活性劑起支撐作用，影響類脂囊泡的構(gòu)型，從而影響藥物的包封率。由圖2 B 可知，經(jīng)單因素試驗確定Span60 與ATC 質(zhì)量比在6∶1～8∶1 范圍內(nèi)存在最優(yōu)比例。

β- 谷甾醇添加量：按2.1 項下方法制備ATC -NIS，固定其他因素不變。考察當β-谷甾醇添加量分別為6，8，10，12，14 mg 時對類脂囊泡包封率的影響。β-谷甾醇在類脂囊泡中起膜穩(wěn)定劑的作用［23］，使雙層膜結(jié)構(gòu)更加緊密，防止藥物泄露，提高包封率。由圖2 C 可知，經(jīng)單因素試驗確定β-谷甾醇添加量為10～14 mg。

圖2 不同處方單因素對ATC-NIS包封率的影響（n=3）A.Ultrasound time B.Span60∶ATC（m∶m） C.Addition amount of β-sitosterolFig.2 Effect of different prescription factors on the encapsulation efficiency of ATC-NIS（n=3）

2.5 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化處方

優(yōu)化編碼及水平：經(jīng)單因素試驗確定影響ATC -NIS 制備過程中較顯著的3 個因素的3 個水平，采用Box - Behnken 響應面法優(yōu)化處方，以包封率為評價指標，考察Span60∶ATC（因素A）、β- 谷甾醇加水量（因素B）、超聲時間（因素C）對類脂囊泡包封率的影響。試驗因素與水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken響應面法因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box-Behnken response surface methodology

表3 Box-Behnken響應面法試驗設計與結(jié)果Tab.3 Experimental design and results of the Box-Behnken response surface methodology

多元二次回歸方程建立：經(jīng)Design - Expert 8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次多元回歸方程Y= 74.41 - 0.067 5X1+ 1.13X2-1.39X3+0.432 5X1X2+1.64X1X3+2.31X2X3-9.20X12-8.96X228.12X32（R2=0.993 6，P＜0.01）。由表4 可知，數(shù)學模型擬合良好，預測數(shù)據(jù)可靠，可信度高，失擬項P值大于0.05，表明模型預測值與實測值差異較小。

表4 ATC-NIS包封率回歸模型系數(shù)的方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results of encapsulation efficiency regression model coefficient of ATC-NIS

優(yōu)化預測：由試驗結(jié)果可知，影響因素中顯著性大小為C ＞B ＞A，根據(jù)優(yōu)化目的，將包封率設為最大，通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制不同影響因素對于各指標的三維響應面圖，結(jié)果見圖3。得到優(yōu)化后的處方為Span60∶ATC為7∶1（m/m），β-谷甾醇添加量為12 mg，超聲時間為12 min。按優(yōu)化的最優(yōu)處方工藝，平行制備3批ATC-NIS，所得包封率為（75.36±1.17）%（n=3），載藥量為（7.95 ± 0.42）%（n= 3）。與包封率預測值74.6%接近，說明所建立的方法預測性良好。

圖3 各影響因素對ATC包封率影響的三維響應面圖Fig.3 3D response surface of various influencing factors on encapsulation efficiency of ATC

2.6 ATC-NIS 的體外質(zhì)量評價

粒徑分布及Zeta 電位測定：取ATC - NIS 適量，精密稱定，加蒸餾水按1∶1比例稀釋，使其分散均勻，使用激光粒度分析儀測量平均粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和Zeta電位，重復3次。ATC-NIS粒徑為（211.81±1.05）nm，PDI為0.199±0.013，Zeta電位為（-38.24±0.105）mV。詳見圖4和圖5。

圖4 ATC-NIS粒徑分布Fig.4 Distribution of particle size of ATC-NIS

圖5 ATC-NIS Zeta電位圖Fig.5 Zeta-potential of ATC-NIS

外觀形態(tài)：采用磷鉬酸負染色法制備透射電鏡樣品，取少量ATC-NIS，加雙蒸水稀釋后滴在銅網(wǎng)上，室溫干燥，滴加2.0%磷鎢酸染液負染色，室溫下孵育過夜，晾干，在透射電子顯微鏡下觀察ATC - NIS 的微觀形態(tài)。結(jié)果ATC-NIS 相對分散無聚集，呈大小均一、表面光滑的類球形。詳見圖6。

圖6 ATC-NIS透射電子顯微鏡整體形態(tài)（×10 000）Fig.6 Overall morphology of the transmission electron microscope of ATC-NIS（×10 000）

體外釋放行為考察：考察ATC-NIS 在磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中的釋放行為［24］，首先取等體積ATC-NIS和ATC 溶液適量，置透析袋中，兩端扎緊，將透析袋浸入900.0 mL 含有0.5% SDS 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）釋放介質(zhì)中，置恒溫水浴搖床振蕩，溫度保持在（37 ±0.5）℃，攪拌速率為90 r/min，于0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0 h 時收集樣品3.0 mL，同時添加等體積新鮮釋放介質(zhì)，采集的樣品經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，適當稀釋，并按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，分析每個時間點的藥物含量，并以ATC原料藥為參比制劑進行試驗，重復5次。計算各時間點的累積釋放率，繪制ATC 和ATC-NIS 的釋放曲線。由圖7 可知，ATC 在5.0 h 內(nèi)釋放96.77%以上，而ATC-NIS在48.0 h內(nèi)可穩(wěn)定、長效地持續(xù)釋放。

圖7 ATC-NIS在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的體外釋放情況（n=5）Fig.7 Release profiles in vitro of ATC-NIS in pH 6.8 PBS（n=5）

3 討論

類脂囊泡是具備優(yōu)良生物相容性的藥物載體，其特殊的雙層類脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可將疏水性成分ATC 包載于壁層。本研究中制備ATC - NIS，經(jīng)單因素篩選Span60與ATC 質(zhì)量比可知，隨著投藥量的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，推測是由于投藥量增加使囊材所包覆藥物量增大，囊泡體系黏度增加，但當投藥量持續(xù)增大時，囊材的包載能力達到臨界值后會引起漏藥，包封率減小。

因3個影響因素間存在交互作用，采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化ATC-NIS的制備工藝，經(jīng)Design-Expert構(gòu)建數(shù)學模型響應面圖，因素影響大小為超聲時間＞β-谷甾醇添加量＞Span60∶ATC（m∶m）。超聲時間對包封率的影響最顯著，隨著超聲時間的增大，包封率先增大后減小，可能是超聲使囊泡粒子均勻分散在外水相溶液中，但超聲時間過長會使囊泡粒子破裂，導致包封藥物滲出，從而降低包封率。

β-谷甾醇作為類脂囊泡中的膜穩(wěn)定劑，與類脂囊泡的包封率關(guān)系密切，隨著添加量的增加，膜材由堅實變得柔軟且富有彈性，為類脂囊泡提供了較強的流動性，藥物更穩(wěn)定地包載于囊材中，不易破裂，但添加過量時會導致囊材流動性過大，使ATC - NIS 不易成型，從而降低包封率。

對所優(yōu)化的最優(yōu)處方進行模擬體外釋放顯示，ATC-NIS 可顯著減緩ATC 的釋放。激光粒度儀分析顯示，ATC - NIS 粒徑分布均勻，通過透射電子顯微鏡觀察ATC-NIS 的形態(tài)特征為球形或類球形。綜合分析表明，薄膜分散法結(jié)合超聲的應用可有效減小NIS的粒徑大小，降低粒子間的聚集，Box-Behnken 響應面法優(yōu)化ATC - NIS 準確可靠、高效可行，得到具備緩釋效果的ATC-NIS，為后期試驗奠定了制劑學基礎(chǔ)。