荊少東,劉忠,祝威,谷梅霞*,吳磊

黃河三角洲鹽堿地土壤性質與微生物對石油污染的響應

荊少東1,2,劉忠2,祝威1,2,谷梅霞1,2*,吳磊1,2

1.中石化石油工程設計有限公司, 山東 東營 257200 2.中國石油化工股份有限公司工程部, 山東 東營 257200

土壤理化性質與微生物組的變化是田間土壤污染風險評估和修復的重要指標。然而，土壤理化性質及微生物組如何響應石油污染尚不清楚。本研究以山東省某油田為研究對象，從運行中和長期廢棄的油井附近采集石油污染土壤。研究了土壤理化性質、微生物組和土壤微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡變化。結果表明，土壤總石油烴、總碳、總氮、總硫和總磷的含量因石油污染而增加。相比對照，兩種石油污染持續(xù)時間都會降低土壤pH值。另外，石油污染還降低了細菌和真菌的多樣性。同時，細菌多樣性與土壤總石油烴含量和電導率呈負相關，而真菌多樣性僅與土壤電導率呈負相關。此外，石油污染增加了土壤中變形菌門、子囊菌門、油桿菌屬和鐮刀菌屬的相對豐度。最后，石油污染土壤微生物網(wǎng)絡的節(jié)點數(shù)、連接數(shù)和模塊化系數(shù)均下降。短期的重度石油污染會導致土壤理化性質和微生物組發(fā)生變化，并驅動形成低復雜程度和脆弱的土壤微生物網(wǎng)絡。且自然恢復很難還原土壤性質和微生物網(wǎng)絡結構。

鹽堿土;土壤微生物; 石油污染

隨著全球人口增長和石油產(chǎn)品的大量使用，石化產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，而在石油生產(chǎn)、運輸、使用和泄漏過程中將會造成海洋和陸地環(huán)境污染[1]。由于石油烴的成分復雜、生物毒性大、生物可利用性低等特點，其泄露將對土壤、地下水和區(qū)域生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害[2,3]。

土壤微生物在物質循環(huán)和能量流動中起至關重要的作用，如碳、氮和磷的生物地球化學循環(huán)。此外，當土壤受到污染時，微生物群落會產(chǎn)生響應。目前，許多研究針對石油烴或有機污染物影響的土壤、水和沉積物中的微生物群落[4,5]。例如，Paisse S等[6]發(fā)現(xiàn)，湖泊沉積物細菌群落的結構組成與湖泊中的石油污染梯度相關。且石油烴降解菌豐度不隨污染物含量的增加而提升。相反，一項基于國內(nèi)石油污染場地微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，污染土壤中的石油降解微生物比清潔土壤中的石油降解微生物多[7]。然而，很少有研究關注石油污染對土壤微生物群落的長期或短期影響。

微生物并非獨立存在于土壤中，而是形成一個復雜的生態(tài)相互作用矩陣。除環(huán)境因素外，群落相互作用也會影響微生物行為，例如原核生物和真核生物之間的相互作用。當細菌和真菌共存于同一環(huán)境中，它們之間必然存在物質和能量交換[8]。最近，部分基于自然環(huán)境樣本的研究針對性的描述了細菌和真菌群落共存的狀態(tài)[9,10]。一項基于限制性片段長度多態(tài)性數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡研究表明，網(wǎng)絡中模塊顯示細菌和真菌群落與土壤特性是緊密相關的[11]。與簡單的異質性和結構指數(shù)相比，網(wǎng)絡模式研究解釋了對微生物組合的更豐富的見解。此外，它們填補了我們對微生物群落之間或群落與環(huán)境參數(shù)（如土壤污染）之間相互作用的知識面空白。然而，目前為止很少有針對石油污染下的土壤微生物互作網(wǎng)絡的研究，尤其是在不同污染持續(xù)時間下。

本研究以我國山東省某油田為研究對象，探究不同石油污染年限下土壤的理化性質、微生物群落多樣性與組成變化，以及微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡模式。初步探明了土壤理化指標及微生物群落對不同年限石油污染的響應。本研究旨在為土壤石油污染風險提供微生物指示，并為進一步修復工作提供新視野。

1 材料與方法

1.1 土樣采集和場地描述

土壤樣品采集自山東省東營市河口區(qū)某油田的兩個油場。在每個場地中，用五點采樣法采集了以下三組表層土壤樣本（0～20 cm）：工作中抽油機一米半徑范圍內(nèi)的短期污染土壤（PS），廢置抽油機一米半徑范圍內(nèi)的長期污染土壤（OS，場地Ⅰ棄置8年，場地Ⅱ棄置10年），以及油田附近的未污染對照土壤（CT）。每組設五個平行，每個平行由五個土芯完全均勻混合而組成。因此，共采集得30個土壤樣本（2個場地×3個分組×5個平行）。采集后的土壤樣品置于冰上，盡快運送至實驗室。過4 mm篩后，部分土壤樣品風干，用于測定理化性質。剩余土壤樣本儲存于-80 ℃等待分子生物學分析。

1.2 土壤理化性質測定

土壤總石油烴（TPH）含量使用超聲索氏提取重量法測定[12]。土壤pH值使用pH計測定（土水比1:2.5）。土壤總碳（TC），總氮（TN），及總硫（TS）含量使用元素分析儀測定。土壤總磷（TP）含量在250℃下用H2SO4-HClO4溶液消解后用鉬藍比色法進行測定[13]。土壤電導率（EC）用電導率儀測定。

1.3 土壤微生物群落分析

土壤基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取。細菌16s rDNA V4-V5高變區(qū)用帶標簽的特異性引物組515F/926R擴增，真菌內(nèi)部轉錄間隔2區(qū)（ITS2）片段使用引物組ITS7/ITS4擴增。所有聚合酶鏈反應均使用15 μL體系的Phusion?高保真PCR專用MIX，2 μM正向與反向引物以及約10 ng DNA模板進行。反應程序包括在95 ℃下60 s的初始變性，然后在95 ℃下進行27次10 s循環(huán)，57 ℃下持續(xù)30ss，72 ℃下進行30 s的延伸，最后在72 ℃下延長10 min。將相同量的1倍TAE緩沖液與PCR產(chǎn)物混合，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。然后，使用DNA純化試劑盒提純PCR產(chǎn)物。隨后，DNA樣本在低溫下運送至深圳微生態(tài)公司進行Illumina雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

在驗證了本研究數(shù)據(jù)集的正態(tài)性分布與方差齊性后，利用單因素方差分析與最小差異性檢驗（LSD）獲得了組間土壤理化性質與微生物多樣性指數(shù)的差異（<0.05）。基于擴增序列變體（ASVs）水平的土壤微生物群落主成分分析（PCA），微生物群落多樣性指數(shù)與土壤性質間的相關性分析均使用軟件版本3.5.1中的vegan包進行。

運用分子生態(tài)網(wǎng)絡分析來揭示細菌和真菌分類群（相對豐度>0.1%）之間的關系。首先使用R軟件（v.3.5.1）中的psych包計算成對微生物間的Spearman相關系數(shù)（<0.05），再使用Gephi軟件（v.0.9.2）對微生物網(wǎng)絡進行可視化。網(wǎng)絡中每個節(jié)點代表一個微生物分類單元，紅線或藍線分別代表強的正相關或負相關。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

結果顯示，不同石油污染持續(xù)時長下土壤理化性質存在顯著差異（表1）。與對照相比，石油污染土壤中總石油烴、總碳、總氮、總硫和全磷含量均有提升（<0.05），而土壤pH值則顯著降低。對土壤電導率而言，PS土壤顯著低于OS土壤，而采樣點Ⅰ對照土壤的電導率遠高于污染土壤，這與采樣點Ⅱ的情況完全相反。

表 1 兩個點位下的不同石油污染程度土壤理化性質

注: 數(shù)字后不同字母代表組間存在顯著性差異（<0.05）。

Note: Different letters after the numbers represent significant differences between groups (<0.05).

2.2 土壤微生物多樣性

測序結果表明，三組土壤中細菌和真菌多樣性存在顯著差異（圖1）。在點位Ⅰ，相比于對照，短期石油污染導致土壤細菌多樣性顯著降低（<0.05），長期污染卻無顯著影響。點位Ⅱ中，無論長期或短期石油污染均顯著降低土壤細菌多樣性。對于真菌而言，無論點位Ⅰ或是Ⅱ，長期和短期石油污染均顯著降低了土壤真菌多樣性。

圖 1 兩個點位下三種土壤的細菌與真菌多樣性

主成分分析結果顯示（圖2），不同組間的土壤微生物群落被顯著分隔開。對細菌群落而言，短期污染組與其他組土壤間顯著分離，一軸和二軸共解釋了47.6%的群落變異。對真菌群落而言，一軸和二軸共解釋了75.2%的群落變異。

圖 2 基于OTU水平的微生物群落結構主成分分析

相關性分析結果表明（表2），細菌的Chao1指數(shù)與土壤總石油烴含量和電導率呈負相關（<0.05）。而真菌的Chao1指數(shù)與土壤電導率呈負相關（<0.001）。

表 2 土壤理化性質與細菌和真菌群落α多樣性指數(shù)的相關性分析

2.3 土壤微生物群落組成

測序結果表明，本研究從30個土壤樣品中得到了1947305個細菌序列和2631038個真菌序列，它們分別被歸類為17295個細菌OTU和1681個真菌OTU。對細菌序列而言，每個樣本中98.11%的16s序列被歸類為細菌，僅有1.89%的序列被歸類為古細菌。另外，變形菌門在所有樣品中所占比例最高，平均占總量的77.79%。其他優(yōu)勢細菌包括擬桿菌門（5.02%）、放線菌門（3.95%）、厚壁菌門（3.04%）和芽單胞菌門（2.15%）。對真菌序列而言，100%鑒定為真菌。子囊菌門占優(yōu)勢，平均占總序列的82.58%。其他主要門有被孢霉門（10.61%）和擔子菌門（1.88%）。

圖 3 兩個采樣點位下不同污染時長土壤中細菌與真菌門水平微生物相對豐度

在門水平上（圖3），與對照相比，石油污染土壤中變形菌門的相對豐度增加，而芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度減少。在真菌群落中，子囊菌門和壺菌門的相對豐度增加。相反地是，與對照組相比，短期石油污染后擔子菌門、被孢霉門和捕蟲霉亞門的相對豐度降低（<0.05）。此外，長期石油污染后，土壤中子囊菌門的相對豐度有所提高，而壺菌門和捕蟲霉亞門的相對豐度有所下降（<0.05）。

在前20個已確定的細菌屬中（圖4），羅爾斯通氏菌、假單胞菌、硫單胞菌、油桿菌和海桿菌為主導菌屬。與對照組相比，PS樣品中羅爾斯通氏菌、寡養(yǎng)單胞菌、不動桿菌、檸檬酸桿菌的相對豐度顯著降低。相反，假單胞菌、油桿菌、海桿菌、硫單胞菌、海小桿菌、假海源桿菌、梭桿菌、弓形菌和嗜鹽單胞菌的相對豐度增加（<0.05）。在OS樣本中，羅爾斯通氏菌、不動桿菌和檸檬酸桿菌的相對豐度顯著降低，相反，油桿菌、海桿菌、硫單胞菌、海小桿菌、、硫桿狀菌、HB2_32_21、食烷菌的相對豐度增加（<0.05）。

圖 4 兩個采樣點位下不同污染時長土壤中細菌與真菌屬水平相對豐度熱圖

對真菌而言，鐮刀菌、被孢霉、假絲孢菌、鏈格孢菌和赭孢菌最為豐富的菌屬。與對照相比，PS樣品中被孢霉菌、鏈格孢菌、枝孢菌、合頭菌的相對豐度降低。相反，鐮刀菌、赭孢菌和黑孢菌的相對豐度增加（<0.05）。另外，在OS樣品中，被孢霉、鏈格孢菌、枝孢菌、合頭菌和曲霉的相對豐度降低，而鐮刀菌和赭孢菌的相對豐度增加（<0.05）。

2.4 土壤微生物網(wǎng)絡與拓撲學性質

為了探究土壤微生物群落間的互作模式，研究基于細菌和真菌屬水平（相對豐度>0.1%）之間的斯皮爾曼相關系數(shù)（<0.05）構建了三組土壤中的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡（圖5）。結果顯示（表3），與對照組相比，PS和OS網(wǎng)絡中的點數(shù)、連接數(shù)、正連接數(shù)比例和平均度均逐漸減少。有趣的是，PS網(wǎng)絡擁有最高的網(wǎng)絡模塊化系數(shù)，其次是OS，Control網(wǎng)絡模塊化系數(shù)最低。此外，在PS網(wǎng)絡中，正連接的比例顯著下降至53.6%，而在OS網(wǎng)絡中，正連接的數(shù)量反彈至61.4%。

圖 5 三種污染（a：對照，b：PS，c：OS）狀況下土壤微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡模式

表 3 土壤微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡部分拓撲學性質

3 討 論

目前，土壤石油污染被認為是最嚴重的環(huán)境問題之一。這類污染會降低或破壞土壤肥力，改變土壤和水循環(huán)的元素組成，導致生態(tài)系統(tǒng)遭受破壞，進而造成空氣和地下水的二次污染，同時抑制或殺死土壤生物，如動植物或微生物等[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)土壤碳、氮、硫含量顯著增加。同時，石油污染后土壤pH顯著降低（表1），這與前人的報道一致[17]。這主要是由于石油中含有大量的碳、氮和硫元素，從而造成元素累積。并且，當硫元素進入土壤時，可能形成硫氧化物從而降低土壤pH值。

此前的研究發(fā)現(xiàn)，石油污染會導致土壤微生物群落發(fā)生改變[18,19]。本研究對不同石油污染時長土壤微生物組進行了測序，結果表明（圖1），石油污染顯著降低了土壤細菌和真菌α多樣性，并塑造了微生物群落（圖4）。Cheema S等[18]發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)土壤中的細菌多樣性明顯高于石油烴污染的土壤。此外，Wang HH等[19]發(fā)現(xiàn)石油污染物的毒理作用顯著降低了土壤真菌的多樣性。

在這項研究中，石油污染增加了變形菌門和子囊菌門的相對豐度（圖3）。此前的一項研究表明，變形菌被證明是石油污染土壤中最容易培養(yǎng)的細菌[20]。另外，部分變形菌可以降解石油污染土壤中的石油烴或多環(huán)芳烴（PAHs）[20,21]。Kim等富集了土壤中產(chǎn)生物表面活性劑的微生物，這些生物表面活性劑具有降解石油污染土壤中碳氫化合物的潛力，更重要的是，其中變形菌的相對豐度最高。此外，研究證明子囊菌是已知最主要的石油降解真菌門[22]。結果還顯示，油桿菌和鐮刀菌的相對豐度在PS和OS組樣品中均顯著增加。油桿菌先前被證明是一種高性能碳氫化合物降解菌[23]，而鐮刀菌[24]也被用于石油降解處理。

微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡分析可以解釋微生物群落的結構和功能，隨著土壤微生物群落組成的變化，微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡也隨之發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)相比于對照，網(wǎng)絡節(jié)點、連接數(shù)以及正連接數(shù)的比例在PS和OS組中均顯著降低。受到石油污染的土壤樣品中較少的微生物網(wǎng)絡連接表明土壤微生物之間的相互作用受到抑制。這可能是由于石油污染導致土壤中微生物活性下降所致[25,26]。此外，PS組土壤中網(wǎng)絡正連接的比例低于OS組。這說明土壤微生物在短期內(nèi)受到石油污染后微生物群落之間的相互作用更具競爭性或拮抗性。隨后，經(jīng)過長期的自然恢復，土壤微生物之間的相互作用模式逐漸向協(xié)同或共生轉變。

研究表明，功能性合作行為普遍存在于土壤微生物群落中[27]。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡分析確定了具有合作或相互依賴關系的微生物類群，通常代表一個模塊，表明它們具有類似的功能[28]。網(wǎng)絡中的模塊具有最小化環(huán)境紊亂影響的功能[29]。因此，OS和PS組微生物網(wǎng)絡中的模塊性升高，表明土壤微生物正在形成相似的模塊以應對石油污染物的干擾。

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Soil Properties and Microbial Community Responses to Oil Pollution in Saline-alkali Soil in the Yellow River Delta

JING Shao-dong1,2, LIU Zhong2, ZHU Wei1,2, GU Mei-xia1,2*, WU Lei1,2

1.257200,2.257200,

Shifts in soil physicochemical properties and microbiome are important indicators for field soil pollution risk assessment and remediation. However, it is still unclear how soil physicochemical properties and microbiome respond to oil contamination. In this study, oil-contaminated soil samples were collected from working and long-term abandoned oil wells in an oil field located in Shandong Province. In the meanwhile, we investigated the impact of oil contamination on soil physicochemical properties, microbiome, and microbial co-occurrence network patterns. Results showed that oil contamination increased the concentration of soil total petroleum hydrocarbons, total carbon, total nitrogen, total sulfur, and total phosphorus, while decreasing soil pH. Oil contamination also reduced the-diversity of soil bacteria and fungi, which were negatively correlated with soil total petroleum hydrocarbon content and electrical conductivity. Moreover, oil contamination increased the relative abundance of Proteobacteria, Ascomycota,, andin soil. Furthermore, oil contamination decreased the number of nodes, edges, and modularity values of microbial networks in soil, indicating the construction of low-complexity and fragile microbial networks. Our findings suggest that short-term severe oil contamination can alter soil physicochemical properties, microbiome and drive the construction of unstable soil microbial networks, which are difficult to restore through natural restoration.

Saline-alkali soil; soil microbial community; oil pollution

S154.36

A

1000-2324(2023)02-0267-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.02.015

2022-08-12

2022-09-08

礦區(qū)土壤生態(tài)修復與大宗固廢高值利用關鍵技術及工程示范(2020CXGC011403)

荊少東(1972-),男,博士研究生,教授級高級工程師,研究方向:巖土工程勘察,地質工程與能源環(huán)保. E-mail:1318315178@qq.com

Author for correspondence. E-mail:sxxnl163@163.com