關(guān)丫丫，鐘根深，王 偉，路 申，楊秀珍，葉建平

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科/新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;4.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院代謝研究中心,河南 鄭州 450007)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種多系統(tǒng)疾病,主要由于胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌受損(胰島素減少癥)和代謝活躍組織中的胰島素信號傳導(dǎo)缺陷(胰島素抵抗)引起,主要特征是慢性高血糖癥狀。T2DM會導(dǎo)致心臟、血管系統(tǒng)、眼睛、腎臟、大腦和神經(jīng)受損,使患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命下降。內(nèi)臟肥胖、低體力活動、高熱量飲食和高齡是 T2DM 的主要危險因素,與炎癥和代謝/氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝紊亂是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制。有研究報(bào)道,代謝活躍的組織和胰腺 β 細(xì)胞中的線粒體功能障礙與 T2DM 的發(fā)展有關(guān)[1-4]。ANTOUN等[5]研究發(fā)現(xiàn),T2DM肥胖患者的肌肉樣本中線粒體氧化磷酸化 (mitochondrial oxidative phosphorylation,OXPHOS) 系統(tǒng)(包含電子傳遞鏈和ATP合酶)受損。有研究報(bào)道,OXPHOS 功能障礙可導(dǎo)致β-氧化和 ATP 生成減少以及活性氧生成增加,從而導(dǎo)致胰島素抵抗和 ATP 依賴性胰島素分泌缺陷[6-10]。核編碼蛋白三磷腺苷合酶抑制因子1(adenosine triphosphate synthase inhibitory factor 1,ATPIF1)是線粒體ATP合酶的內(nèi)源性抑制劑。長期以來,ATPIF1 被認(rèn)為是 ATP 合酶的單向抑制劑,僅通過在缺氧狀態(tài)下抑制ATP 合酶的水解酶活性(即 ATP 酶活性)發(fā)揮作用[11]。最近研究發(fā)現(xiàn),ATPIF1 也可能在正常呼吸條件下部分抑制 ATP 合酶的合成活性(即 ATP 合成),從而限制 OXPHOS[11]。同時,在體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了ATPIF1,且循環(huán)中ATPIF1 與心血管疾病發(fā)生風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[12-14]。本課題組前期研究顯示,髙脂誘導(dǎo)的ATPIF1基因敲除肥胖小鼠可出現(xiàn)血糖升高、胰島素抵抗、線粒體功能亢進(jìn)等表現(xiàn)[15]?；诖?本研究分析了血清ATPIF1和外周血ATPIF1 mRNA 表達(dá)水平與T2DM的相關(guān)性,以期為臨床T2DM的診斷提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2021年5月至2021年9月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的80例T2DM患者為研究對象,其中男43例,女37例;年齡 40～70(56.58±6.15)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中國2型糖尿病防治指南(2020版)[16]關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)年齡40～70歲;(3)患者之間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患慢性肝病、甲狀腺功能亢進(jìn)、肢端肥大癥、胰腺瘤、腦垂體瘤等疾病者;(2)長期應(yīng)用激素類藥物、鎮(zhèn)靜藥物、抗癌藥物的患者;(3)存在外傷、手術(shù)等各種應(yīng)激情況者。選擇同期在本院體檢健康者80例為健康對照組,其中男43例,女37例;年齡40～70(56.70±5.98)歲。2組受試者的性別分布和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:K2020-034-01)。

1.2 方法

1.2.1 血清血糖(glucose,GLU)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平檢測采集2組受試者外周靜脈血4 mL,3 000 r·min-1離心3 min分離血清,應(yīng)用AU5800生物化學(xué)分析儀(美國Beckman Coulter公司)采用己糖激酶法檢測血清GLU水平,采用氧化酶法檢測血清TC、TG水平,采用直接法檢測血清LDL-C、HDL-C水平,試劑購自上海科華生物工程股份有限公司,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中胰島素(insulin,INS)、C-肽和ATPIF1水平采集2組受試者外周靜脈血4 mL,3 000 r·min-1離心3 min分離血清,應(yīng)用全自動Phomo酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司),采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中INS、C-肽及ATPIF1水平,試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 離子交換高效液相色譜法檢測糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平采集2組受試者外周靜脈血4 mL,應(yīng)用HbA1c檢測儀(深圳普門科技股份有限公司)采用離子交換高效液相色譜法檢測HbA1c水平,試劑盒購自深圳普門科技股份有限公司,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量采集2組受試者乙二胺四乙酸抗凝全血標(biāo)本4 mL,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液提取單核細(xì)胞,采用TRIzol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用7500 Fast Real-Time 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀(美國Thermo Fisher公司)及配套試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。ATPIF1上游引物序列為5′-CGATATTTCCGAGCACAGAGTAG-3′,下游引物序列為5′-TGCTTATGGCGCTCAATTTCTTT-3′;人β-actin 上游引物序列為5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′,下游引物序列為5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′,引物購自上海英濰捷基公司。PCR反應(yīng)體系(總體積20.0 μL):SYBRTMSelect Master Mix 10.0 μL,上下游引物各4.5 μL,cDNA (110稀釋) 1.0 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃延伸1 min,共40個循環(huán);以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者的GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、INS、C-肽、ATPIF1水平及外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA表達(dá)水平比較結(jié)果見表1。T2DM組患者的GLU、HbA1c、INS、C-肽水平顯著高于健康對照組,血清ATPIF1水平、外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于健康對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2組受試者的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組受試者的GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、INS、C-肽、ATPIF1水平及外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量比較Tab.1 Comparison of the levels of GLU,TC,TG,HDL-C,LDL-C,HbA1c,INS,C-peptide,ATPIF1 and the relative expression of ATPIF1 mRNA in peripheral mononuclear cells of subjects between the two groups

2.2 血清ATPIF1水平、外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量及GLU、INS、C-肽和HbA1c水平診斷T2DM的效能比較結(jié)果見圖1、圖2和表2。血清ATPIF1水平預(yù)測T2DM的AUC為0.916(95%置信區(qū)間:0.873～0.960,P<0.05);當(dāng)ATPIF1以1.37 μg·L-1為截?cái)帱c(diǎn)時,Youden指數(shù)為0.738,敏感度為93.8%,特異度為80.0%。外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量預(yù)測T2DM的AUC為0.965(95%置信區(qū)間:0.943～0.988,P<0.05);當(dāng)ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量以0.95為截?cái)帱c(diǎn)時,Youden指數(shù)為0.838,敏感度為83.8%,特異度為100.0%。GLU、HbA1c、INS、C-肽診斷T2DM的AUC分別為1.000、0.991、0.883、0.648。 血清ATPIF1水平和外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA 相對表達(dá)量預(yù)測T2DM的Youden指數(shù)顯著低于GLU和HbA1c,顯著高于INS和C-肽,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1 血清ATPIF1和外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA診斷T2DM的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum ATPIF1 level and expression level of ATPIF1 mRNA in peripheral monocyte in the diagnosis of T2DM

圖2 血清GLU、HbA1c、INS和C-肽水平診斷T2DM的ROC曲線 Fig.2 ROC curve of serum GLU,HbA1c,INS and C-peptide levels in the diagnosis of T2DM

表2 血清ATPIF1、GLU、HbA1c、INS、C-肽水平及外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA的相對表達(dá)量診斷T2DM的效能Tab.2 Efficacy of serum ATPIF1,GLU,HbA1c,INS,C-peptide levels and relative expression level of ATPIF1 mRNA in peripheral blood mononuclear cell in diagnosing T2DM

3 討論

肥胖可通過誘導(dǎo)胰島素抵抗增加T2DM的患病風(fēng)險[17]。細(xì)胞內(nèi)ATP是細(xì)胞內(nèi)主要的能量來源,其水平升高是胰島素抵抗的危險因素[18]。胰島素抵抗是細(xì)胞能量過剩的反饋調(diào)節(jié),通過底物控制線粒體超載。因此,在底物供應(yīng)過剩的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)中,ATP可能是胰島素抵抗的主要信號。預(yù)防ATP過量生產(chǎn)是INS增敏的關(guān)鍵策略[17]。雖然之前的很多研究已經(jīng)評估了內(nèi)源性ATPIF1的生理作用[19],但尚未研究ATPIF1在T2DM中的作用。本課題組前期研究表明,ATPIF1基因敲除可增加成纖維細(xì)胞中ATP水平,促進(jìn)成纖維細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化,提高白色脂肪細(xì)胞儲存三酰甘油的能力[15],推測ATPIF1的缺失會使ATP過度生成,小鼠更易變得肥胖,對糖尿病的形成是一個危險因素。有研究發(fā)現(xiàn),ATPIF1基因變異(rs3767303)與男性的肥胖患病率和代謝參數(shù)顯著相關(guān),而對女性則不明顯[20];更具體地說,男性次要等位基因(rs3767303)攜帶者肥胖患病率較低。另有研究表明,ATPIF1參與人類肥胖和代謝特征的改變[20]。因此,探討 ATPIF1 對T2DM的診斷價值對臨床T2DM的診斷有重要意義。

本研究結(jié)果顯示,T2DM患者的GLU、HbA1c、INS和C-肽水平顯著高于健康對照組,T2DM患者的血清ATPIF1水平、外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于健康對照組;這說明,T2DM患者發(fā)生了胰島素抵抗,ATPIF1水平降低使ATP合酶受到的抑制作用減弱,導(dǎo)致ATP合成過量,而過量的ATP使INS敏感性降低,易使患者發(fā)生胰島素抵抗,最終進(jìn)展為T2DM[17]。國外研究結(jié)果顯示,將重組ATPIF1注射到高脂飲食喂養(yǎng)的去卵巢雌性小鼠中,可顯著減少小鼠的食物攝入和體質(zhì)量[20],因此,推測體內(nèi)注射一定劑量的重組ATPIF1蛋白,可增加血循環(huán)中ATPIF1水平,抑制ATP過度生成,增加INS敏感性,從而降低T2DM的患病率。此外,本研究結(jié)果顯示,血清ATPIF1水平預(yù)測T2DM的AUC為0.916,當(dāng)ATPIF1以1.37 μg·L-1為截?cái)帱c(diǎn)時,Youden指數(shù)為0.738,敏感度為93.8%,特異度為80.0%;外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA預(yù)測T2DM的AUC為0.965,當(dāng)ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量以0.95為截?cái)帱c(diǎn)時,Youden指數(shù)為0.838,敏感度為83.8%,特異度為100.0%;血清ATPIF1水平和外周血單核細(xì)胞中ATPIF1 mRNA相對表達(dá)量預(yù)測T2DM的Youden指數(shù)顯著低于GLU和HbA1c,顯著高于INS和C-肽;這說明,ATPIF1診斷T2DM的效能低于GLU和HbA1c,但優(yōu)于INS和C-肽,ATPIF1可作為診斷T2DM基因水平的生物標(biāo)志物,且能夠在基因水平指導(dǎo)T2DM的預(yù)防和治療。

綜上所述,T2DM患者的血清ATPIF1水平及外周血單核細(xì)胞ATPIF1 mRNA表達(dá)水平可作為診斷T2DM基因水平的生物學(xué)標(biāo)志物,且可預(yù)測糖尿病前期患者向新發(fā)生糖尿病的轉(zhuǎn)化過程。