焦燕 李三峰 李紅燕

偏頭痛是一種常發(fā)的神經(jīng)血管紊亂性疾病,患者出現(xiàn)搏動性頭痛、單側(cè)或雙側(cè)中重度頭痛,并可反復(fù)發(fā)作,對身心健康、生活質(zhì)量及工作能力造成很大危害[1,2]。目前普遍認(rèn)為三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活與偏頭痛的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān),其中神經(jīng)炎癥是關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[3]。瞬時受體電位錨蛋白1(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)參與了神經(jīng)病理性傷害過程,被激活時可導(dǎo)致眶周機(jī)械性痛覺超敏[4],且TRPA1在偏頭痛發(fā)病過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用,以抗TRPA1抗體預(yù)處理偏頭痛大鼠,可抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活致敏,減輕神經(jīng)炎癥,改善頭痛癥狀[5],因此TRPA1可成為偏頭痛的潛在治療靶點。磷酯酶C(phospholipase C,PLC)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信號可介導(dǎo)促炎介質(zhì)誘導(dǎo)慢性疼痛,PLC和PKC的抑制劑可減輕促炎因子前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)引發(fā)的背根神經(jīng)節(jié)炎癥損傷,進(jìn)而改善持續(xù)的外周疼痛過敏癥狀[6],抑制PKC信號可降低硝酸甘油誘導(dǎo)的小鼠炎性因子過表達(dá),減輕頭痛[7]。另有研究顯示TRPA1可激活PKC信號,并促進(jìn)瑞芬太尼誘導(dǎo)的術(shù)后痛覺過敏發(fā)生[8],因而推測TRPA1可能通過PLC/PKC信號通路影響偏頭痛大鼠的行為學(xué)和疼痛敏感性。本研究以腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體敲低偏頭痛大鼠TRPA1基因,對以上假設(shè)進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠購自武漢大學(xué)動物實驗中心,許可證號SCXK(鄂)2019-0004,SPF級,6周齡,雄性,體重(190±15)g。大鼠飼養(yǎng)在醫(yī)院動物房內(nèi)飼養(yǎng)籠中,每籠4～5只,動物房內(nèi)保持屏障環(huán)境,嚴(yán)格遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 (1)硝酸甘油(貨號100236)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司購買;PMA(貨號YT346)自北京百奧萊博科技有限公司購買;以腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體、空慢病毒載體、TRPA1及GAPDH引物、Trizol(貨號B511311)、PGE2酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號D751014)、大鼠白介素(interleukin,IL)-6 ELISA試劑盒(貨號D731010)、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(貨號B639277)、大鼠IL-10 ELISA試劑盒(貨號D731011)自生工生物工程(上海)股份有限公司購買;兔源抗大鼠PLC抗體(貨號ab107455)、兔源抗大鼠p-PLC抗體(貨號ab4828)、兔源抗大鼠PKC抗體(貨號ab181558)、兔源抗大鼠p-PKC抗體(貨號ab109539)自美國Abcam公司購買;強(qiáng)RIPA裂解液(貨號P0013B)、BCA蛋白測定試劑盒(貨號P0011)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司購買等。(2)Von Frey觸痛儀(型號BIO-EVF3)購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司;鼠尾光照測痛儀(型號YLS-12A)購自濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司;全波長多功能自動酶標(biāo)儀(型號Varioskan Flash)購自美國賽默飛世爾科技公司;小型垂直電泳槽(型號1658001)、電泳儀電源(型號1645050)、小型轉(zhuǎn)印槽(型號1703930),購自美國伯樂公司;實時熒光定量PCR儀(FT-CW96)購自山東風(fēng)途物聯(lián)網(wǎng)科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 制備大鼠偏頭痛模型及分組給藥:取SD大鼠60只,隨機(jī)分為對照組、模型組、TRPA1敲低組(腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體)、TRPA1空載組(空慢病毒載體)、TRPA1敲低+PMA(PKC激活劑)組,每組12只。TRPA1敲低+PMA組大鼠每只靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體1次(1×1011PFU),同時皮下注射0.1 ml PMA 1次(0.2 ng/μl)[9];TRPA1空載組大鼠每只靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的空載體1次(1×1011PFU),同時皮下注射0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液1次;TRPA1敲低組大鼠每只靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體1次(1×1011PFU),同時皮下注射0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液1次;模型組和對照組大鼠每只靜脈注射0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液1次,同時皮下注射0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液1次,模型組和給藥干預(yù)組大鼠于給藥后24 h皮下注射10 mg/kg硝酸甘油[10]制備大鼠偏頭痛模型,對照組大鼠于給藥后24 h皮下注射10 mg/kg 0.9%氯化鈉溶液,大鼠產(chǎn)生雙耳發(fā)紅及頻繁搔頭、爬籠等煩躁不安癥狀,可作為判斷造模成功的標(biāo)志。

1.3.2 大鼠行為學(xué)觀察:大鼠給藥造模后30 min,記錄大鼠耳紅消失時間及30 min內(nèi)撓頭和爬籠次數(shù),撓頭和爬籠次數(shù)記錄觀察3次,取平均值。

1.3.3 ①大鼠疼痛癥狀檢測:行為學(xué)觀察全部完成后,進(jìn)行漆刷實驗及針刺實驗檢測各組大鼠機(jī)械性疼痛癥狀,漆刷實驗:使用一個光滑的畫筆輕刷大鼠須墊部,當(dāng)大鼠縮頭時,計為1分,共輕刷5次,每次間隔5 min,重復(fù)3次后得動態(tài)痛覺超敏評分,最大分值為15,最小分值為0。針刺實驗:使用Von Frey觸痛儀的電子探針刺激大鼠須墊部,力度以不損傷皮膚且可使皮膚輕微凹陷為宜,探針從最小克數(shù)開始逐漸增大,大鼠縮頭時的探針克數(shù),即是縮頭閾值,測量3次,每次間隔5 min,取3次測量的均值。②以熱刺激實驗檢測大鼠溫度痛閾[12]:待大鼠安靜后進(jìn)行固定,以強(qiáng)光刺激大鼠須墊部,記錄大鼠出現(xiàn)縮頭反應(yīng)時所用時間即為熱刺激潛伏期,重復(fù)測試3次,每次間隔5 min,取3次測量的均值。

1.3.4 大鼠腦組織及血液中TRPA1 mRNA的表達(dá)檢測及標(biāo)本采集:大鼠疼痛檢測結(jié)束后,采集其頸動脈血后離心,將上清存于-80℃?zhèn)溆?再次采集頸動脈血后斷頭處死大鼠,取出大腦,使用手術(shù)剪自大腦上剪下腦組織約0.6 g存于液氮備用,再次使用手術(shù)剪自剩余大腦上剪下腦組織約0.4 g,向除TRPA1敲低+PMA組外其余各組大鼠腦組織及頸動脈血中加入適量Trizol(腦組織剪碎后研磨),遵照其試劑說明書指導(dǎo)提取腦組織及血液中總RNA,然后遵照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,GAPDH作為檢測TRPA1 mRNA表達(dá)的內(nèi)參基因,GAPDH上游引物:5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’,下游引物:5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’;TRPA1上游引物:5’-ATCCAAATAGACCCAGGCACG-3’,下游引物:5’-CAAGCATGTGTCAATGTTTGGTACT-3’。

1.3.5 大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6及抗炎因子IL-10水平測定:將1.3.4中血清自-80℃冰箱中取出凍融后,遵照試劑盒說明書指導(dǎo)以ELISA實驗測定其中PGE2、IL-6、IL-10水平。

1.3.6 大鼠腦組織PLC/PKC通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測:將1.3.4中腦組織自液氮中取出,加入強(qiáng)RIPA裂解液后研磨勻漿、離心,遵照蛋白測定試劑盒說明書以BCA法測量上清中總蛋白濃度,分組記錄,根據(jù)結(jié)果每組均取20 靏蛋白變性后以SDS-PAGE凝膠跑電泳,通過電轉(zhuǎn)將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,經(jīng)5%的脫脂奶粉封閉、兔源抗大鼠PLC(1∶2 000)、p-PLC(1∶3 000)、PKC(1∶1 000)、p-PKC(1∶2 500)抗體孵育、洗滌、山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育、洗滌、顯色、掃描后,以Image J軟件分析掃描所得的蛋白條帶圖像,最終即可得各蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠腦組織及外周血中TRPA1的表達(dá) 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠腦組織及外周血中TRPA1表達(dá)顯著增高(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠腦組織及外周血中TRPA1表達(dá)降低(P<0.05);TRPA1空載組大鼠腦組織及外周血中TRPA1表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠腦組織及外周血中TRPA1表達(dá) n=12,

2.2 TRPA1對大鼠行為的影響 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)顯著增高(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)降低(P<0.05);TRPA1空載組大鼠耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)無顯著變化(P>0.05)。與TRPA1敲低組比較,TRPA1敲低+PMA組大鼠耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠行為學(xué)觀察 n=12,

2.3 TRPA1對大鼠機(jī)械性疼痛的影響 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠縮頭閾值顯著降低(P<0.05),動態(tài)痛覺超敏評分顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠縮頭閾值升高(P<0.05),動態(tài)痛覺超敏評分降低(P<0.05);TRPA1空載組大鼠縮頭閾值、動態(tài)痛覺超敏評分無顯著變化(P>0.05)。與TRPA1敲低組比較,TRPA1敲低+PMA組大鼠縮頭閾值降低(P<0.05),動態(tài)痛覺超敏評分升高(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠機(jī)械性疼痛 n=12,

2.4 TRPA1對大鼠溫度痛閾的影響 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠熱刺激潛伏期顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠熱刺激潛伏期升高(P<0.05);TRPA1空載組大鼠熱刺激潛伏期無顯著變化(P>0.05)。與TRPA1敲低組比較,TRPA1敲低+PMA組大鼠熱刺激潛伏期降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠溫度痛閾 n=12,

2.5 TRPA1對大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白p-PLC/PLC、p-PKC/PKC顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白p-PLC/PLC、p-PKC/PKC降低(P<0.05);TRPA1空載組大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白p-PLC/PLC、p-PKC/PKC無顯著變化(P>0.05)。與TRPA1敲低組比較,TRPA1敲低+PMA組大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白p-PKC/PKC升高(P<0.05)。見表5,圖1。

表5 5組大鼠腦組織PLC/PKC通路相關(guān)蛋白表達(dá) n=12,

圖1 免疫印跡檢測5組大鼠腦組織PLC/PKC通路蛋白表達(dá);A 對照組;B 模型組;C TRPA1敲低組;D TRPA1敲低組;E TRPA1敲低+PMA組

2.6 TRPA1對大鼠血清促炎因子及抗炎因子的影響 與對照組比較,模型組、TRPA1空載組大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平顯著升高(P<0.05),抗炎因子IL-10水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,TRPA1敲低組大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平降低(P<0.05),抗炎因子IL-10水平升高(P<0.05);TRPA1空載組大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平與抗炎因子IL-10水平無顯著變化(P>0.05)。與TRPA1敲低組比較,TRPA1敲低+PMA組大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平升高(P<0.05),抗炎因子IL-10水平降低(P<0.05)。見表6。

表6 5組大鼠促炎因子及抗炎因子水平 n=12,

3 討論

偏頭痛作為一種發(fā)病率較高的原發(fā)性慢性頭疼疾病,目前還沒有能夠完全治愈的手段[11,12]。本研究通過皮下注射10 mg/kg硝酸甘油以制備偏頭痛大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平降低,抗炎因子IL-10水平升高,引發(fā)體內(nèi)炎癥,導(dǎo)致大鼠疼痛敏感性提高,具體表現(xiàn)為縮頭閾值、熱刺激潛伏期顯著降低,動態(tài)痛覺超敏評分顯著升高,造成大鼠出現(xiàn)持續(xù)耳紅及頻繁撓頭、爬籠等頭痛癥狀,揭示偏頭痛大鼠模型構(gòu)建成功。

促炎細(xì)胞因子過度表達(dá)導(dǎo)致三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活,引發(fā)神經(jīng)源性炎癥是偏頭痛發(fā)生的重要病理現(xiàn)象,消炎止痛是有效治療方法[3,13]。研究顯示TRPA1在神經(jīng)源性炎癥相關(guān)的痛覺超敏產(chǎn)生過程中起關(guān)鍵作用,激活TRPA1可大量釋放活性氧,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥,引發(fā)并維持痛覺超敏[14],還可促進(jìn)三叉神經(jīng)傳入纖維釋放降鈣素基因相關(guān)肽,偏頭痛[15],且TRPA1表達(dá)功能性缺失的小鼠降鈣素基因相關(guān)肽釋放減少,改善芥子油和辣椒素誘發(fā)的頭痛癥狀[16]。本研究結(jié)果顯示,偏頭痛模型大鼠腦組織及外周血中TRPA1表達(dá)明顯升高,以腺病毒包裝的TRPA1 siRNA載體對其進(jìn)行干預(yù)處理可下調(diào)腦組織及外周血中TRPA1表達(dá),并可降低促炎因子PGE2、IL-6水平,升高抗炎因子IL-10水平,進(jìn)而抑制炎癥,升高大鼠縮頭閾值、熱刺激潛伏期,降低其耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)、動態(tài)痛覺超敏評分,最終降低大鼠疼痛敏感性,改善其持續(xù)耳紅及頻繁撓頭、爬籠等頭痛癥狀,進(jìn)一步證實了TRPA1在偏頭痛發(fā)病過程中的調(diào)控作用。

PLC/PKC信號參與炎癥和疼痛的病理機(jī)制,抑制PLC及PKC信號可抑制蛋白酶激活受體2表達(dá),減輕酸中毒和促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的痛覺過敏癥狀[17]。PKCδ的功能性抑制可顯著減輕硝酸甘油誘導(dǎo)的持續(xù)自發(fā)性偏頭痛[18],且抑制PKC信號可降低突觸傳遞,減輕中樞致敏,改善慢性偏頭痛[19]。另有研究表明PKC可參與TRPA1對痛覺過敏的調(diào)控過程,阻斷PKC信號可逆轉(zhuǎn)TRPA1上調(diào)誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)[8,20]。本研究結(jié)果顯示,相比TRPA1敲低組,敲低TRPA1和PKC激活劑PMA同時干預(yù)的大鼠血清促炎因子PGE2、IL-6水平升高,抗炎因子IL-10水平降低,且耳紅消失時間、撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)、動態(tài)痛覺超敏評分、腦組織PLC/PKC通路蛋白p-PKC/PKC升高,縮頭閾值、熱刺激潛伏期降低,表明PMA可拮抗敲低TRPA1對偏頭痛大鼠腦組織PLC/PKC信號的抑制作用,減弱其抗炎功效,最終逆轉(zhuǎn)其對大鼠疼痛敏感性及頭痛癥狀的改善作用,揭示敲低TRPA1是通過抑制PLC/PKC信號激活來減輕大鼠疼痛敏感性及頭痛癥狀的。

綜上所述,TRPA1可通過激活PLC/PKC信號參與偏頭痛的致病過程,下調(diào)TRPA1可通過阻斷PLC/PKC信號途徑傳導(dǎo)而抑制神經(jīng)炎癥,減輕偏頭痛大鼠疼痛敏感性,最終緩解頭疼。本研究證實TRPA1通過調(diào)控PLC/PKC信號在偏頭痛發(fā)病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,為偏頭痛的臨床治療提供了新的見解及思路。