吳夢帆，吳利敏＊

（河南師范大學水產學院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

近幾年來，對Wnt/β-catenin信號通路在人類和動物胚胎發(fā)育、細胞命運和疾病發(fā)病率調節(jié)作用的研究和報道越來越多。Wnt/β-catenin信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物[1]。在正常的體細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發(fā)揮作用。只有當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合激活胞內的散亂蛋白導致GSK-3β失活，使β-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運，β-catenin才能在胞質中積累起來。當胞質中β-catenin的濃度達到一定水平時，就可向細胞核轉移。在胞核中β-catenin與轉錄因子家族LEF/TCF結合，促進下游靶基因表達而導致細胞的增殖、分化、成熟。顯然，在這條信號通路中β-catenin發(fā)揮了重要作用，其在胞質中積累繼而向胞核的轉位，被認為是該信號通路被激活的標志[3]。

已有研究表明，Wnt信號通路中β-catenin的過表達或抑制會導致脊椎動物的發(fā)育異常。例如：在斑馬魚胚胎中，過表達β-catenin會導致斑馬魚第二體軸的形成[4]，β-catenin的抑制物過表達會降低背部基因的表達，產生腹部化的胚胎[5]；在爪蟾胚胎早期發(fā)育過程中抑制β-catenin的表達最終會破壞背部組織的形成[6]。在小鼠中，β-catenin缺失會損害代謝性肝分區(qū)和肝臟增殖[7]，而β-catenin過表達會導致代謝分區(qū)蛋白不受控制地表達，并導致小鼠肝臟生長不受控制[8]；βcatenin的缺失也會導致小鼠的低骨量表型[9]和眼組織上皮層異常和缺陷[10]。以上結果暗示，β-catenin參與脊椎動物組織胚胎發(fā)育和器官發(fā)生過程。

淇河鯽（Carassius auratus in Qihe river)屬鯉形目（Cypriniformes)鯉科（Cyprinidae)鯉亞科（Cyprinidae)，是天然的三倍體魚類，具有兩性生殖和雌核發(fā)育兩種繁殖方式。通過異源精子刺激，進行雌核發(fā)育，可產生全雌性個體。本研究用免疫組化法檢測βcatenin在淇河鯽各組織如眼、腦、鰓、軟骨、脾、肝、腸、腎和卵巢細胞中細胞定位。本研究結果將為進一步研究Wnt/β-catenin途徑在硬骨魚發(fā)育和器官發(fā)生中的作用提供理論和基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取河南師范大學水產養(yǎng)殖基地的淇河鯽作為實驗材料。養(yǎng)殖采用帶有循環(huán)曝氣淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)的大型養(yǎng)殖池。環(huán)境溫度保持在24℃左右，光照周期為14 h光照、10 h黑暗。在繁殖季節(jié)將雌性淇河鯽與雄性鯉魚按8:1的比例放入親魚池，人工誘導產卵。受精卵在23℃的環(huán)境下孵育，直至發(fā)育成幼魚。

1.2 免疫組化分析

采集10 dah幼魚（全魚）和120 dah的卵巢組織固定在波恩式液中用于制備組織學切片。室溫靜置過夜。脫水透明后，石蠟包埋切片，片厚7 μm。石蠟切片脫蠟，復水處理后，用一級抗體和二級抗體孵育，蘇木精染色，梯度酒精脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡觀察組織形態(tài)結構是否完整，是否具有陽性信號，并用顯微鏡采集分析系統(tǒng)鏡鑒，拍照保存以待分析。以正常家兔血清為陰性對照。

2 結果

通過免疫組化檢測β-catenin在淇河鯽在不同組織細胞中的免疫定位，結果顯示β-catenin在腸杯狀細胞和腎小管的上皮細胞中呈陽性信號（圖1A、B）。如圖1C所示，在鰓組織中，鰓小片的泌氯細胞中檢測到β-catenin陽性表達。在軟骨的軟骨基質和軟骨膜中也發(fā)現(xiàn)β-catenin的陽性信號(圖1C）。在肝臟中，βcatenin在肝細胞中表達，在肝血竇中沒有發(fā)現(xiàn)βcatenin的陽性信號（圖1D）。在脾臟中，β-catenin在紅髓的巨噬細胞中有表達，而在白髓中無表達（圖1E）。β-catenin在眼內表達的區(qū)域為全視網(wǎng)膜、色素層和晶狀體，而在叢狀層未檢測到陽性信號（圖1F）。

圖1 淇河鯽腸（A）、腎（B）、鰓、軟骨（C）、肝（D）、脾（E）、和眼（F）組織細胞中β-catenin的免疫定位

在卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母細胞中表達，在Ⅲ期卵母細胞中不表達（圖2A）。在腦中，βcatenin在淇河鯽中腦和間腦的支持細胞中表達 （圖2C、D、E、F）。

圖2 淇河鯽卵巢（A）和腦（C、D、E、F）組織細胞中β-catenin的免疫定位

3 討論

β-catenin是典型Wnt信號通路中的關鍵轉錄調節(jié)因子，在動物胚胎發(fā)育和器官發(fā)生中起著重要作用。為了研究β-catenin在淇河鯽體內各組織中的表達情況，本研究采用免疫組織化學的方法，對淇河鯽各組織中的β-catenin進行免疫定位檢測。結果顯示β-catenin在淇河鯽多個組織都表達。

在淇河鯽的腦組織，β-catenin在中腦中部和間腦邊緣有表達，而在羅非魚中，β-catenin在中腦邊緣和間腦中部表達[11]。在成年小鼠中β-catenin主要分布于皮層、海馬、室下層、丘腦及紋狀體等區(qū)域[12]。這表明β-catenin可能參與脊椎動物神經系統(tǒng)發(fā)育，其在不同物種的腦組織中的免疫定位的差異可能是由于不同的發(fā)育時期導致的，也不排除β-catenin在不同脊椎動物中可能具體功能存在某些差異這種可能性。報道顯示，β-catenin在小鼠骨細胞的間質前體細胞分化為成骨細胞和成骨細胞存活必不可少[13,14]，表明β-catenin參與了小鼠的骨骼發(fā)育，在本研究中βcatenin在軟骨的軟骨基質和軟骨膜中的表達暗示其可能在淇河鯽的軟骨組織發(fā)育中可能有某種作用。已有研究結果表明，在小鼠中，β-catenin在眼部晶狀體纖維分化過程中起著獨特的作用，參與Wnt信號轉導和黏附相關機制，調節(jié)晶狀體上皮和早期纖維分化[10]。本研究中，β-catenin在淇河鯽眼中也有相似的表達模式，表明β-catenin在淇河鯽眼組織發(fā)育過程中可能起著相似的作用。

在120dah淇河鯽的卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母細胞中表達，在Ⅲ期卵母細胞中不表達。βcatenin只在卵巢早期生殖細胞中表達的現(xiàn)象說明βcatenin可能參與早期生殖細胞的增殖和分化等過程。

β-catenin在不同物種各組織中的泛表達表明這種表達模式是脊椎動物的普遍現(xiàn)象，β-catenin在各組織發(fā)育中的起著非常重要的作用，其功能可能相似。綜上，通過對β-catenin在淇河鯽各組織細胞中的免疫定位研究，可以為以后研究Wnt/β-catenin信號通路在各器官發(fā)生中的功能研究提供參考。