毛磊

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023）

時(shí)至今日，越來(lái)越多的植物藥作為抗癌藥在臨床上得到廣泛應(yīng)用。大多數(shù)具有抗癌活性的藥物來(lái)源于植物中提取的天然化合物或合成衍生物，且結(jié)構(gòu)上與木質(zhì)素配體、紫杉烷二甲苯二苯甲酸酯、生物堿等相關(guān)[1]。大量研究表明，從可食用植物或中草藥中提取的天然化合物在體外或體內(nèi)模型中均展現(xiàn)出良好的抗癌活性，且可使多種異常信號(hào)通路恢復(fù)正常[2-4]。這些天然化合物大多數(shù)通過控制癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及炎癥和凋亡的關(guān)鍵信號(hào)分子來(lái)發(fā)揮作用。目前，人們對(duì)特定分子和細(xì)胞靶點(diǎn)作用的小分子藥物的鑒定和開發(fā)非常感興趣，因?yàn)榇_定藥物療效需要其具有明確地作用機(jī)制。

通常，遺傳分子改變是導(dǎo)致癌細(xì)胞異常生長(zhǎng)的原因，選擇某些致癌特定靶點(diǎn)進(jìn)行治療可能是最有針對(duì)性的策略。但是，由于大多數(shù)癌細(xì)胞都會(huì)發(fā)生多種類型的基因突變，因此單靶點(diǎn)的藥物其抗癌活性通常較低，甚至可能導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性。因此，目前普遍認(rèn)為組合療法是很好的治療方法。粗糠柴毒素（Rottlerin）是一個(gè)多靶點(diǎn)天然化合物，這一特性使該藥物可能成為一個(gè)非常具有前景的抗癌藥物，本篇綜述將重點(diǎn)介紹其在非經(jīng)典通路上的抗癌活性。

1 Rottlerin 概述

東南亞等熱帶地區(qū)廣泛分布著粗糠柴，Rottlerin是粗糠柴的主要成分，是一種覆蓋在其果實(shí)表面的紅色粉末，相對(duì)分子質(zhì)量約為516 g/mol。自古以來(lái)，粗糠柴在民間被用于治療感染或炎癥性疾病，例如疥瘡、支氣管炎、腹部疾病等[5]。粗糠柴粉末也可以用于體內(nèi)驅(qū)蟲（如絳蟲、蛔蟲等），可能是由于其具有引起腹瀉的作用[6]。后來(lái)，有研究認(rèn)為是由于Rottlerin激活鉀離子通道，使細(xì)胞膜發(fā)生超極化，從而使寄生蟲死亡并從宿主腸道中排出[7-8]。商品化的Rottlerin為橙棕色粉末，溶于二甲基亞砜、氯仿或乙醇，不溶于水。

Rottlerin 的商業(yè)生產(chǎn)始于1994 年，GSCHWENDT等報(bào)道蛋白激酶C-δ（Protein Kinase C-δ，PKCδ）被3 ～6 μmol/L 的Rottlerin 選擇性抑制，在相同濃度下比對(duì)其他PKC 的抑制作用強(qiáng)5 ～30 倍[9]。從此，許多關(guān)于PKCδ 信號(hào)傳導(dǎo)的研究使用Rottlerin 作為特異性抑制劑，然而這個(gè)理論目前仍然存在著一些爭(zhēng)議，如有證據(jù)表明Rottlerin 在體外對(duì)PKCδ 激酶活性沒有直接影響[10]。此外，大量研究表明Rottlerin 抑制許多其他蛋白激酶，如p38 調(diào)節(jié)/活化的蛋白激酶（PRAK）、MAP 激酶活化蛋白激酶-2（MAPKAP-2）、AKT8 病毒癌基因細(xì)胞同系物/蛋白激酶B（Akt/PKB）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMK）[11]。此外，SOLTOFF 證明Rottlerin 將線粒體呼吸與氧化磷酸化解偶聯(lián)，從而降低腺苷三磷酸（ATP）水平并影響多種細(xì)胞功能[12]。因此，Rottlerin 是PKCδ 的特異性抑制劑的觀念在整個(gè)科學(xué)界受到挑戰(zhàn)和改變，關(guān)于Rottlerin 的機(jī)制研究目前還并不十分清晰，需要更多地進(jìn)行研究和探索。

最近，許多研究揭示了Rottlerin 的其他一些性質(zhì)，例如氧化淬滅[13]、抗增殖[14]、抗血管生成[15]、抗炎[16]、抗過敏[17]、抗菌[18]、抗真菌[19]和抗寄生蟲[20]。就癌癥而言，一些研究報(bào)告了Rottlerin 通過多種作用機(jī)制對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的功效。如今，Rottlerin 已可以被認(rèn)為是一種多靶點(diǎn)藥物，能夠干擾凋亡和自噬途徑，從而可以通過單獨(dú)或聯(lián)合治療的方式發(fā)揮抗癌作用[21]。在本綜述中，將重點(diǎn)探討Rottlerin 對(duì)乳腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的抑制能力，以期能夠?yàn)樵撍幬飳?lái)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

2 Rottlerin 與乳腺癌

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 是最廣泛使用的乳腺癌體外模型之一，是研究抗癌藥物的基本模型[22]。由于促凋亡蛋白半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的缺失和抗凋亡蛋白B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-Cell Lymphoma-2，BCL-2）的高表達(dá)，MCF-7 細(xì)胞具有極高的凋亡閾值。此外，MFC-7 細(xì)胞表達(dá)低水平的自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白芐氯素1（Beclin1，BECN1），因此也對(duì)經(jīng)典通路觸發(fā)的細(xì)胞自噬具有抗性。但TORRICELLI 等發(fā)現(xiàn)，在非饑餓和不加任何處理的條件下，Rottlerin 不僅抑制增殖，而且以時(shí)間和劑量依賴性地殺死MCF-7 細(xì)胞[23]。這項(xiàng)研究提供的證據(jù)表明，MCF-7 細(xì)胞中Rottlerin 觸發(fā)的細(xì)胞凋亡機(jī)制是由Caspase-3 決定的。因此，Rottlerin 可能對(duì)不同的癌細(xì)胞類型具有細(xì)胞毒性，要么誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵抗的細(xì)胞發(fā)生自噬，要么刺激具有細(xì)胞凋亡功能的細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)Rottlerin 通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)復(fù)合物1（mTORC1）導(dǎo)致MCF-7 細(xì)胞發(fā)生自噬[23]。然而，這一事件的發(fā)生并未依賴于經(jīng)典通路的磷酸化，同時(shí)也不發(fā)生于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）已知上游信號(hào)分子的招募——例如AMP 活化蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）信號(hào)通路。該研究利用親和蛋白實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Rottlerin 通過與mTOR 蛋白形成復(fù)合物來(lái)抑制其活性，即Rottlerin 調(diào)控信號(hào)分子的新機(jī)制可能是通過與蛋白直接相互作用抑制關(guān)鍵酶的活性。

3 Rottlerin 與黑色素瘤

除MCF-7 細(xì)胞外，在其他背景和化學(xué)敏感性不同的癌細(xì)胞中也評(píng)估了Rottlerin 的細(xì)胞毒性作用。在這方面，值得一提的是對(duì)SK-MEL-28 黑色素瘤細(xì)胞的研究。眾所周知，SK-MEL-28 細(xì)胞具有許多遺傳信息突變，這使它們對(duì)大多數(shù)化學(xué)治療藥具有明顯的耐受性。大量證據(jù)表明，SK-MEL-28 細(xì)胞中除了存在原癌基因B-RAF 突變之外，還存在著抑癌基因p53 和PTEN 的突變，這是由基因組擴(kuò)增引起的凋亡相關(guān)基因p21 下調(diào)及細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的過表達(dá)產(chǎn)生的[24-26]。DAVERI 等的研究證明Rottlerin 作為一種抑制藥物的功效，從機(jī)制上講，Rottlerin 抑制核因子κB（Nuclear Factor kappa-B，NF-κB），從而下調(diào)Cyclin D1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制了SK-MEL-28 細(xì)胞的增殖[27]。有趣的是，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Rottlerin 沒有誘導(dǎo)SK-MEL-28 黑色素瘤細(xì)胞中Caspase-3 和Caspase-9 的激活或多聚ADP 核糖聚合酶1（Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP）的裂解。因此，Rottlerin 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程并不是細(xì)胞凋亡的過程。

盡管Rottlerin 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的能力較高，但SK-MEL-28 黑色素瘤細(xì)胞并未因自噬而死亡，因?yàn)樽允梢种苿┞揉茨茏柚筊ottlerin 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的死亡。從機(jī)制上講，Rottlerin 并未刺激Beclin-1 引起的黑色素瘤細(xì)胞的自噬，而是通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路及其下游底物乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），從而使靶點(diǎn)Raptor（mTORC1 的一個(gè)亞單位）發(fā)生磷酸化[28]。這一全新的機(jī)制很容易使人聯(lián)想到Rottlerin 處理細(xì)胞后是否會(huì)發(fā)生壞死性凋亡。然而實(shí)際情況更加復(fù)雜，因?yàn)镾K-MEL-28 黑色素瘤中的Rottlerin 細(xì)胞毒性并不是由壞死性凋亡介導(dǎo)的。壞死性凋亡是一種不尋常的程序性細(xì)胞死亡形式，依賴于關(guān)鍵的上游激酶-受體相互作用蛋白激酶1（Receptor Interaction Protein Kinase 1，RIP1）和RIP3 對(duì)死亡受體的刺激。研究發(fā)現(xiàn)，使用RIP1 激酶抑制劑Nec-1 未能挽救Rottlerin 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明壞死性凋亡途徑未參與其中[28]。

為了嘗試解開Rottlerin 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制，綜合上述內(nèi)容所提到的，不難發(fā)現(xiàn)在Rottlerin 處理細(xì)胞后，絕大多數(shù)的磷酸化或非磷酸化的蛋白，如AMPK、Raptor、乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）、真核生物起始因子4E 結(jié)合蛋白1（4EBP-1）、Beclin-1、mTOR、PKCδ、Caspase-3 和Caspase-9，都出現(xiàn)了下調(diào)。這一情況表明，Rottlerin 處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯過程受到了極大的破壞，而且極大可能是由于mTORC1 的抑制產(chǎn)生的。有研究表明，Rottlerin 通過阻斷真核生物起始因子4E（eIF4E）抑制了4EBP-1 的磷酸化，進(jìn)而限制了蛋白翻譯的啟動(dòng)[29]。這些結(jié)果表明，靶向eIF4E 作為新的抗癌藥物途徑或?qū)⒊蔀橐环N新興的治療方式。

除了上述機(jī)制外，Rottlerin 還可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum stress，ER stress）負(fù)調(diào)節(jié)起始因子eIF2 來(lái)阻止蛋白質(zhì)翻譯過程[20]。對(duì)于這一機(jī)制，已有文獻(xiàn)報(bào)道了Rottlerin 在人類結(jié)腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)ER stress 的能力[30]。在對(duì)一組人類惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的類似研究中，證實(shí)Rottlerin 通過ER stress/Chop（C/EBP 同源蛋白，C/EBP-homologous protein）介導(dǎo)的死亡受體5（Death Receptor 5，DR5）上調(diào)和Caspase-8 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡觸發(fā)了細(xì)胞凋亡旁通路[31]。因此，Rottlerin 觸發(fā)的ER stress 可以直接導(dǎo)致翻譯過程減少或通過旁通路引起凋亡或兩者同時(shí)發(fā)生，這可能取決于不同的細(xì)胞類型。

4 結(jié)語(yǔ)

基于本篇綜述總結(jié)的證據(jù)，很明顯Rottlerin 在多個(gè)不同的維度（增殖、經(jīng)典和非經(jīng)典途徑引起的凋亡、自噬、蛋白質(zhì)合成）和細(xì)胞模型上具有抑制腫瘤進(jìn)展的能力，使這種化合物成為可能用于開發(fā)新型治療方法的藥物。盡管處于非常早期的研究階段，仍然缺乏嚴(yán)格的臨床前和臨床研究，但從藥理學(xué)的角度來(lái)看，在體內(nèi)和體外模型中，Rottlerin 在細(xì)胞和組織中都能得到有效吸收，甚至在腫瘤組織（胰腺癌的異種移植模型）和Rottlerin 飼喂小鼠的血漿中檢測(cè)到大量藥物[32]。當(dāng)前，研究者多會(huì)將Rottlerin 與姜黃素進(jìn)行類比，然而兩者有很大不同。姜黃素是一種源自香料姜黃的多酚，是研究最多的天然藥物之一[33]。盡管Rottlerin 和姜黃素在執(zhí)行其藥物作用（如抗腫瘤、抗氧化、抗淀粉樣蛋白、抗炎、抗菌等）時(shí)調(diào)控相同信號(hào)分子和通路，但姜黃素本身的生物利用度差且在全身分布較低，其在體內(nèi)被快速代謝、在肝臟中結(jié)合并從糞便中排出[34]。

在臨床應(yīng)用中，抗癌藥物的功效往往由于其對(duì)正常細(xì)胞的不利影響而被限制使用。令人興奮的是，無(wú)論是體內(nèi)或體外模型，Rottlerin 在非致瘤細(xì)胞中的毒性幾乎不存在，這在之前的一些研究中已被充分證實(shí)[35-36]，甚至在正常皮膚成纖維細(xì)胞中也得到了同樣的結(jié)果[29]。

有趣的是，一些Rottlerin 的無(wú)毒作用甚至可以用于治療非腫瘤性疾病。例如，對(duì)皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞抑制作用以及對(duì)NF-κB 的抑制已被提出作為銀屑病的治療方法[37-38]。此外，Rottlerin打開鉀離子通道并充當(dāng)氧化猝滅劑的能力可以改善冷性心臟停搏后心臟的功能恢復(fù)[13,39]。

顯然，細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)需要與相應(yīng)的臨床試驗(yàn)相結(jié)合，以評(píng)估并確認(rèn)Rottlerin 的抗癌特性以及其他治療潛力，同時(shí)深入地了解其作用機(jī)制，為Rottlerin 的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。