劉 佳，柴改鳳，郭風清，張樹武，徐秉良

（甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室·甘肅農業(yè)大學植物保護學院 蘭州 730070）

美洲南瓜（Cucurbita pepo）是葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物，因其營養(yǎng)成分種類多，藥用和食用價值極高，在我國很多地區(qū)都有種植[1-2]。甘肅省武威市是美洲南瓜重要的育種基地，美洲南瓜也是當?shù)刂匾慕?jīng)濟作物之一，生產的南瓜籽遠銷海外[3]。

瓜類枯萎病（Fusariumwilt）是由鐮孢菌引起的土傳病害，也是瓜類生產中的毀滅性病害[4]。其中，以西瓜發(fā)病最為嚴重，其次是南瓜，一般發(fā)病率為20%～30%，嚴重時達80%[5]，有時在連作地甚至造成全田死亡。因此，瓜類枯萎病是瓜類生產上的一大難題，也是限制美洲南瓜生產的重要因素之一[6]。前人研究表明，引起甘肅省武威市美洲南瓜枯萎病的致病菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）[5]。

鐮孢菌引起植物發(fā)生枯萎病的生理水平上致病機制，一種是導管阻塞，另一種是致病毒素。鐮孢菌產生的毒素-鐮刀菌酸損傷宿主植物根系細胞膜，增強細胞的通透性，同時降低線粒體活性氧的含量、阻止ATP 合成，從而導致植物根系水分吸收受阻，生長受到抑制[7]。目前發(fā)現(xiàn)的鐮孢菌可以產生最重要的3 類真菌毒素（伏馬菌素、單端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮），也能夠產生包括恩鐮孢菌素、串珠鐮刀菌素和白僵菌素在內的新型真菌毒素[8]。

同一種鐮孢菌在人工培養(yǎng)基和植物體內的產毒種類可能存在差異，同時在人工培養(yǎng)條件下的產毒能力也受到培養(yǎng)基成分、溫度、濕度等環(huán)境條件的影響[9-10]。如苦瓜枯萎病菌毒素發(fā)酵的最佳培養(yǎng)液為Czapek 培養(yǎng)液，最佳培養(yǎng)時間為14 d，裝液為100 mL。該毒素發(fā)酵濾液在高溫高壓下具有較好的穩(wěn)定性[11]。

也有研究結果表明，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對玉米不同品種的發(fā)芽率、幼苗生長均有顯著影響[12]?？浊扒暗萚13]研究表明，尖孢鐮孢菌QD3-2 產生的毒素對苜蓿種子萌發(fā)和胚根生長均具有抑制作用。莊敬華等[14]研究發(fā)現(xiàn)甜瓜枯萎病菌毒素粗提液對甜瓜胚根的生長具有顯著的抑制作用，誘發(fā)甜瓜幼苗表現(xiàn)典型的枯萎病萎蔫癥狀，推測該病原菌產生的粗毒素中含有甜瓜生長的抑制性物質。

前人研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌侵入寄主后分泌的毒素物質，改變了寄主植物細胞膜的透性、抑制植物根的生長，而低量毒素又能誘導植物合成植保素[15]。陳慧杰等[16]研究表明，菊花枯萎病菌毒素可抑制切花菊幼苗根、莖的正常生長，增加幼苗根系的細胞膜透性以及根系組織中可溶性糖、脯氨酸和MDA 的含量，在短時間內提高根系保護酶POD、PAL 和PPO 活性。有關美洲南瓜枯萎病菌產生毒素的培養(yǎng)條件以及毒素粗提液對幼苗影響的研究相對較少。

因此，筆者通過探究影響美洲南瓜枯萎病菌產毒的各項培養(yǎng)條件，研究病原菌產生的毒素粗提液對美洲南瓜幼苗生長和生理的影響，以期為探索美洲南瓜枯萎病菌致病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥品及試劑盒 馬鈴薯、葡萄糖、自來水、KNO3、蔗糖、蛋白胨、無菌水、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、KCl、FeSO4、瓊脂等。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.1.2 供試儀器和用具 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、pH 計、酶標儀、離心機、滅菌鍋、電導儀、電子天平、搖床、烘箱、各種量程的移液器及吸頭、各種規(guī)格的離心管、研缽、錘形瓶、96 孔UV 板、圓形玻璃瓶等。

1.1.3 供試病原菌及品種 試驗于2020 年6

月至2021 年5 月在甘肅農業(yè)大學植物保護學院植物病毒與分子生物學實驗室進行。植物供試病原菌：美洲南瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum，尖孢鐮孢菌），是甘肅農業(yè)大學植物保護學院植物病害及生物防治課題組前期從甘肅省武威市金蘋果有限責任公司種質資源試驗基地患枯萎病的美洲南瓜中分離得到，由甘肅農業(yè)大學植物保護學院植物病毒與分子生物學實驗室分離鑒定與保存。供試美洲南瓜品種：金蘋果2 號，由甘肅省武威市金蘋果有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的純化 用接種針從菌種凍存管中挑取美洲南瓜枯萎病菌，在PDA 培養(yǎng)基中進行菌種接種，接種5～10 皿，轉移至25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌毒素粗提液的制備 取純化好的病原菌，用直徑為0.7 cm 的打孔器打取菌餅，用接種環(huán)接入150 mL 三角瓶80 mL 培養(yǎng)液中，進行滅菌處理，滅菌后在超凈工作臺上進行操作，每個三角瓶內用接種環(huán)接入8 個菌餅，試驗進行3 次重復。將三角瓶放在28 ℃、180 r·min-1的恒溫搖床中連續(xù)震蕩15 d 后，將培養(yǎng)液中的菌絲體用紗布過濾掉，接著用6 層紗布進行過濾，準備若干50 mL 離心管，將毒素濾液收集其中，3000 r·min-1離心30 min，最后棄去沉淀，將上清液裝在另一個離心管中，置于沸水浴中水浴10 min，得到毒素粗提液[17]。

1.2.3 培養(yǎng)液對病原菌產毒的影響 設置3 種不同培養(yǎng)液：理查（Richard）培養(yǎng)液，硝酸鉀5.00 g，硫酸亞鐵5 mg、磷酸二氫鉀2.50 g、蔗糖2.50 g、硫酸鎂0.25 g、蒸餾水500 mL；改良察氏（Czapek）培養(yǎng)液，蔗糖15.00 g、硝酸鈉1.00 g、磷酸二氫鉀0.50 g、氯化鉀0.25 g、硫酸亞鐵5 mg、硫酸鎂5 mg、蒸餾水500 mL；察氏蛋白胨（PSC）培養(yǎng)液，蔗糖15.00 g、硫酸鎂0.25 g、蛋白胨5.00 g、磷酸二氫鉀0.50 g、硫酸亞鐵5 mg、氯化鉀0.25 g、蒸餾水500 mL；以馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液為對照培養(yǎng)液，即葡萄糖10.00 g、馬鈴薯100 g、蒸餾水500 mL。

將病原菌菌餅接種于上述3 種不同培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液（PD 培養(yǎng)液）中，振蕩培養(yǎng)（25 ℃，15 d），制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測定美洲南瓜種子胚根生長抑制率，試驗進行3 次重復。

1.2.4 培養(yǎng)時間對病原菌產毒的影響 在1.2.3 篩選出的最佳培養(yǎng)液的基礎上（下同），將接有菌餅的培養(yǎng)液于25 ℃震蕩培養(yǎng)5、10、15、20、25 d，培養(yǎng)至相應時間時制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測定美洲南瓜種子胚根生長抑制率，試驗進行3 次重復。

1.2.5 培養(yǎng)方式對病原菌產毒的影響 將接有菌餅的培養(yǎng)液置于25 ℃搖床中，設置全天振蕩培養(yǎng)、振蕩12 h+靜置12 h、全天靜置3 種處理，每組培養(yǎng)15 d，制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測定美洲南瓜種子胚根生長抑制率，試驗進行3 次重復。

1.2.7 光照對病原菌產毒的影響 將接有菌餅的培養(yǎng)液在25 ℃下，分別在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替處理下振蕩培養(yǎng)15 d，制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測定美洲南瓜種子胚根生長抑制率，試驗進行3 次重復。

1.2.8 毒素粗提液的熱穩(wěn)定性測定 將制備好的毒素粗提液設置高溫處理（121 ℃滅菌，20 min）和不進行高溫處理兩種。處理后處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測定美洲南瓜種子胚根生長抑制率，試驗進行3次重復。

1.2.9 胚根的生長抑制率的測定方法 美洲南瓜種子用清水充分沖洗干凈，然后用1%的次氯酸鈉溶液處理種子表面，清水充分沖洗，將種子裝在燒杯中，倒入超過種子2/3 的蒸餾水，設置水浴鍋溫度為55～60 ℃，種子在水浴鍋中水浴10 min，其間不斷攪拌，水浴后取出攪拌至水溫至室溫，將種子置于28 ℃恒溫箱浸泡4～5 h 后，將種子平鋪在底層鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃的人工氣候恒溫箱內進行催芽處理（芽長長度為2～3 mm 時），將美洲南瓜種子胚芽向下均勻放在鋪滿無菌濾紙且滅菌的培養(yǎng)皿內，用移液槍加5 mL 毒素粗提液于培養(yǎng)皿內的美洲南瓜種子。以空白培養(yǎng)液處理為對照。25 ℃下培養(yǎng)，48 h 后測定并計算胚根生長抑制率。每處理20 粒種子，試驗進行3 次重復。

胚根生長抑制率/%=（對照胚根長度－處理胚根長度）/對照胚根長度×100。（1）

1.2.10 病原菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗生長及生理的影響 選取長勢一致的美洲南瓜幼苗小心取出，清洗干凈，輕剪傷根，浸入設置的不同倍數(shù)毒素粗提液中，毒素粗提液設置5 個不同梯度：100%、80%、60%、40%、20%毒素粗提液各10 mL；以蒸餾水10 mL 為對照。在上述粗提液中處理24 h 后，將植株移栽入塑料杯中，分別于5、7、9、11、13 d 取樣測定美洲南瓜幼苗相關生理指標。每個處理20株，3 次重復。

（1）美洲南瓜幼苗株高、莖粗、根長的測定：用直尺測量美洲南瓜幼苗的株高和根長，游標卡尺測量幼苗的莖粗，試驗進行3 次重復。

（2）美洲南瓜幼苗葉片和根系電導率的測定：將幼苗的葉片和根系洗凈晾干，取1 g 葉片或者根系放入裝有10 mL 超純水的試管內，靜置12 h，測定每管電導率，再在沸水浴30 min，之后測定每管的電導率，試驗進行3 次重復。

細胞膜透性=35 ℃水浴條件下外滲液的電導率值/沸水浴條件下外滲液的電導率值×100%。（2）

（3）美洲南瓜幼苗葉片PAL 酶活性和MDA 含量的測定：均參照相應的活性檢測試劑盒說明書進行，試驗進行3 次重復。

從國外電力市場運行目標來看：其總收益要補償所有需量機組的總成本。對應到云南煤電機組，其在系統(tǒng)中的作用主要為保安全和枯水期備用，所以保安全的機組和枯水期備用容量機組的全成本需要得到補償。目前由于云南省內能量市場尚不完善，能量市場不足以補償?shù)牟糠謶O定一定的補償機制進行補償，以彌補電能市場的不足。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，差異顯著性分析依據(jù)LSD 最小顯著性差異法，由SPSS 21.0 專業(yè)版完成。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.1 培養(yǎng)液對病原菌產毒的影響 由圖1 可知，美洲南瓜枯萎病菌最適宜產毒的培養(yǎng)液是Czapek培養(yǎng)液，對美洲南瓜種子胚根生長抑制率為67.51%，其次是PD 培養(yǎng)液，胚根生長抑制率為47.71%。Czapek 培養(yǎng)液對胚根生長抑制率與PD培養(yǎng)液、PSC 培養(yǎng)液和Richard 培養(yǎng)液對胚根生長抑制率差異顯著。

圖1 培養(yǎng)液對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.2 培養(yǎng)時間對病原菌產毒的影響 由圖2 可知，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d時，毒素粗提液對美洲南瓜胚根生長抑制率為19.78%，培養(yǎng)10 d 時胚根生長抑制率上升至28.17%。培養(yǎng)15 d 時，毒素粗提液對美洲南瓜胚根生長抑制率的影響最大，胚根生長抑制率達到67.17%，此時的胚根抑制率是培養(yǎng)5 d 時的3.40倍。培養(yǎng)20 d 和25 d 時，毒素粗提液對美洲南瓜胚根生長抑制率分別為41.45%和48.25%，不同處理間差異均顯著。

圖2 培養(yǎng)時間對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.3 培養(yǎng)方式對病原菌產毒的影響 由表1 可知，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中，全天振蕩培養(yǎng)方式下，毒素粗提液對美洲南瓜種子具有明顯抑制作用，胚根生長抑制率最高，為73.67%，振蕩12 h+靜置12 h 培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)下，胚根生長抑制率依次降低。3 種培養(yǎng)方式的胚根生長抑制率存在顯著差異。

表1 培養(yǎng)方式對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.4 pH 值對病原菌產毒的影響 由圖3 可知，pH 值為4～6 時，病原菌毒素粗提液對美洲南瓜的胚根抑制率分別為51.12%、48.40%、52.24%，3 個處理間差異不顯著。pH 值為7 時毒素粗提液對美洲南瓜胚根生長的抑制作用最強，胚根生長抑制率為69.26%，與pH 值為4～6 的3 個處理差異顯著。

圖3 pH 值對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.5 光照對病原菌產毒的影響 由圖4 可知，美洲南瓜枯萎病菌在連續(xù)黑暗、12 h 光暗交替和連續(xù)光照3 種方式下培養(yǎng)產生的毒素粗提液均對美洲南瓜胚根有抑制作用。其中，在連續(xù)光照條件下最有利于產毒，胚根生長抑制率為65.57%，相比連續(xù)黑暗和12 h 光暗交替培養(yǎng)時，胚根生長抑制率分別提高109.22%和176.43%，連續(xù)光照和其他2 個處理差異顯著。

圖4 光照對美洲南瓜枯萎病菌產毒的影響

2.1.6 毒素粗提液的熱穩(wěn)定性 由表2 可知，高溫滅菌的病原菌毒素粗提液處理美洲南瓜胚根生長抑制率為43.32%，未經(jīng)高溫滅菌處理的胚根生長抑制率為44.75%。高溫滅菌的病原菌毒素粗提液和未經(jīng)高溫滅菌的毒素粗提液處理美洲南瓜種子胚根生長抑制率無顯著差異，表明毒素粗提液的熱穩(wěn)定性較好。

表2 病原菌毒素粗提液的熱穩(wěn)定性

2.2 美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗生長及生理的影響

2.2.1 病原菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗株高莖粗的影響 純毒素粗提液（100%）處理的美洲南瓜幼苗全部枯萎死亡，對其他4 個處理和對照進行比較分析。由圖5-A 可知，幼苗株高均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加逐漸下降趨勢。在處理第5天時，對照處理的美洲南瓜幼苗的株高最高，為124.52 mm，80%毒素粗提液處理下幼苗的株高最低，為102.34 mm，4 個毒素粗提液處理間株高存在顯著性差異。處理13 d 時，對照處理下幼苗株高最高，為146.22 mm，而80%毒素粗提液處理下株高僅為110.31 mm，相差35.91 mm，各處理間株高存在顯著差異。

由圖5-B 可知，幼苗莖粗均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加呈逐漸下降趨勢，病原菌毒素粗提液濃度越大，對幼苗莖粗的影響也越大。在處理第5 天時，80%毒素粗提液處理下莖粗最小，為3.37 mm，對照處理幼苗莖粗最大，為4.28 mm，各處理間莖粗差異顯著。處理13 d 時，對照莖粗顯著高于4 個毒素粗提液處理，20%和40%毒素粗提液處理下莖粗差異不顯著，但均顯著高于60%和80%毒素粗提液處理。

由圖5-C 可知，幼苗根長均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加逐漸下降趨勢，且各處理間根長差異顯著。處理第5 天時，80%毒素粗提液處理下的根長為103.74 mm，與對照相比降低60.92 mm。處理第13 天時，80%毒素粗提液處理下幼苗根長為119.14 mm，與對照相比降低了93.98 mm。

圖5 枯萎病菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗株高、莖粗及根長的影響

2.2.2 病原菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗根系和葉片細胞膜透性的影響 由表3、4 可以看出，除40%毒素粗提液處理7 d 的美洲南瓜幼苗根系外，毒素粗提液濃度越大，幼苗根系或葉片的電導率越高，細胞膜透性也相對越高。處理11 d 時，80%毒素粗提液處理下，美洲南瓜幼苗根系和葉片的細胞膜透性分別達到了62.71%和62.31%，均顯著高于其他濃度毒素粗提液處理，且與對照差異顯著。

表3 枯萎病菌毒素對美洲南瓜幼苗根系細胞膜透性的影響%

表4 枯萎病菌毒素對美洲南瓜幼苗葉片細胞膜透性的影響%

2.2.3 病原菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗葉片丙二醛（MDA）含量的影響 由圖6 可知，在各處理時間，美洲南瓜葉片中MDA 含量均呈現(xiàn)隨毒素粗提液處理濃度的增大逐漸增高趨勢，在相同處理時間時，毒素粗提液濃度越大，MDA 含量越高。處理11 d時，60%和80%毒素粗提液下的葉片MDA 含量分別為29.57 μmol·g-1和31.49 μmol·g-1，分別為對照的2.45 倍和2.61 倍，均顯著高于其他濃度處理。

2.2.4 病原菌毒素粗提液對美洲南瓜幼苗葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響 由圖7 可以看到，隨著處理時間的增加，不同濃度毒素粗提液處理的美洲南瓜葉片中PAL 活性均呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢，且均在11 d 時達到峰值。處理第11 天時，80%毒素粗提液處理下葉片PAL 活性最高，為84.25 U·g-1，是對照處理PAL 酶活性的2.09 倍。在相同處理天數(shù)時，毒素粗提液濃度越大，PAL 活性越高。

3 討論與結論

尖孢鐮孢菌毒素的粗提取和產毒條件的篩選，是研究枯萎病致病機制的理論基礎，也是致病毒素研究中的熱點[15]。最佳產毒條件的篩選，對于研究病原菌產毒至關重要，而影響病原菌產毒的關鍵因素是培養(yǎng)液的種類[18]。前人研究表明培養(yǎng)液不同，產毒量也不同，如向日葵黃萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液培養(yǎng)，以獲得毒素粗提液[19]；香蕉枯萎病菌在Richard 培養(yǎng)液中產毒能力最強[20]。

除了培養(yǎng)液影響產毒的多少外，其他因素如培養(yǎng)時間、培養(yǎng)液的酸堿度、培養(yǎng)溫度等對病原菌產毒也有很大的影響[21]。前人研究發(fā)現(xiàn)，大豆根腐病菌產毒的最適條件是在25 ℃、連續(xù)振蕩培養(yǎng)15 d，而培養(yǎng)基的種類和光照影響不大[22]；玉米穗腐病菌產毒的最適條件是25 ℃、pH 值為5 的Richard 培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d[23]；玉米苗枯病菌的最佳產毒條件為25 ℃、pH 值為9 的PD 培養(yǎng)液、12 h 光暗交替培養(yǎng)10 d[24]；赤霉病菌在PD 培養(yǎng)液中，25～30 ℃培養(yǎng)15 d 具有較強的產毒能力，光照和連續(xù)振蕩培養(yǎng)有利于產毒，但pH 值對產毒影響不顯著[25]；27 ℃最有利于番茄枯萎病菌產毒[26]。番茄褐斑病菌最佳產毒條件為光照12 h、25 ℃、pH 值為6 時、振蕩培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)基對病原菌產毒能力影響不顯著[27]。由此可知，病原物的產毒條件根據(jù)病原菌的特性不同而異，相同的病原菌產毒的條件亦存在差異，發(fā)病寄主不同，產毒量也不同。筆者研究發(fā)現(xiàn)，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中，pH 值為7 時，連續(xù)光照條件下振蕩培養(yǎng)15 d，產生的毒素粗提液對美洲南瓜種子的胚根生長抑制率最高。

田雪亮等[28]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜枯萎病菌粗毒素對黃瓜胚根生長和側根分化均有抑制作用，且隨著毒素粗提液處理濃度的升高，抑制現(xiàn)象越明顯。黃銘慧等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌粗毒素對大豆不同抗性品種的胚根生長均有顯著的抑制作用，25%的毒素粗提液明顯抑制了大豆感病品種胚根的伸長和側根的生長。筆者的研究也得到相似的研究結果，美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液處理能夠抑制美洲南瓜幼苗根、莖的生長，且抑制程度與病原菌毒素粗提液濃度呈正相關，80%的病原菌毒素粗提液對植株的抑制效果最強。

MDA 含量的變化與細胞膜脂過氧化程度的高低呈正相關，因此，MDA 含量常被作為膜脂過氧化指標之一[30]。筆者的試驗結果表明，美洲南瓜在受到枯萎病菌毒素粗提液處理時，葉片中MDA 含量上升，且毒素粗提液處理濃度越高，MDA 含量越高。說明美洲南瓜枯萎病菌產生的毒素粗提液使寄主植物細胞的質膜系統(tǒng)受到損傷，影響了植物正常的生理活動。80%毒素粗提液處理下，美洲南瓜幼苗根系和葉片的細胞膜透性分別達到了62.71%和62.31%，均顯著高于對照，這與陳慧杰等[16]的研究結果一致。說明病原菌毒素粗提液破壞了美洲南瓜根系和葉片的細胞膜，導致組織細胞膜透性增大，對幼苗造成了一定程度的傷害。40%毒素粗提液處理第7 天，美洲南瓜幼苗根系細胞膜透性短暫降低，第9 天細胞膜透性又迅速上升，分析原因可能是美洲南瓜幼苗對毒素粗提液影響的感應略微滯后。

參與植物體內多種生理代謝過程的苯丙氨酸解氨酶（PAL）與植物防衛(wèi)反應及抗病性密切相關，是衡量植物體內防衛(wèi)反應的重要指標[31]。孫淑琴等[32]研究表明草坪草高羊茅葉片經(jīng)草坪草褐斑病菌粗毒素液處理后，PAL 活性均有不同程度的提高，高濃度毒素處理酶活性較低，低濃度毒素處理的酶活性高。筆者的研究結果表明，隨著處理時間的增加，不同濃度病原菌毒素粗提液處理下的美洲南瓜葉片中，PAL 的活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，均在11 d 時達到峰值，毒素粗提液的濃度越大，葉片中PAL 的酶活性越高，推測美洲南瓜枯萎病菌毒素在短期內可以通過提高防御酶活性，提高寄主的抗性。對于美洲南瓜枯萎病菌產生毒素的類型進行分析是筆者下一步的主要研究方向。

筆者的研究結果表明，使用pH 值為7 的Czapek 培養(yǎng)液，在連續(xù)光照、振蕩培養(yǎng)15 d 的條件下，美洲南瓜枯萎病菌可以產生的毒素粗提液對美洲南瓜胚根的生長具有明顯的抑制作用，并且毒素粗提液有較好的熱穩(wěn)定性。隨著處理時間的增加，不同濃度的美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液可以抑制美洲南瓜幼苗的生長，增加幼苗根系和葉片的細胞膜透性和葉片MDA 含量，一定程度上提升PAL 的酶活性。研究結果可為揭示美洲南瓜枯萎病菌的致病機制提供理論基礎。