王 鵬,田哲娟,趙雪芳,康 忱,吳志明,2,李亞棟,2,黃冀楠

(1.河北省農林科學院 經濟作物研究所,河北 石家莊 050051;2.河北省蔬菜工程技術研究中心,河北 石家莊 050051; 3.河北省農林科學院 糧油作物研究所,河北 石家莊 050035)

番茄(Solanumlycopersicum)是喜溫蔬菜,在全世界范圍內廣泛種植。其生長發(fā)育所需的最適溫度在18～25 ℃,對低溫比較敏感。低溫脅迫嚴重影響番茄植株健康,甚至導致植株死亡[1]。冬春季節(jié),設施種植的番茄極易受到低溫影響,番茄品質和產量無法得到保證,低溫限制了番茄的周年連續(xù)生產[2]。因此,生產上迫切需要耐寒的番茄品種,開展番茄耐寒研究和選育新品種顯得尤為重要。

鈣是植物體生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素,鈣離子(Ca2+)是一種重要的第二信使,在植物生長發(fā)育和抗逆反應中發(fā)揮重要作用。Ca2+的濃度變化可以精確反映外部環(huán)境和內源激素的變化,是啟動鈣離子信號通路的中心環(huán)節(jié)[3-4]。鈣調蛋白(Calmodulin,CaM)是一種分布廣、功能多、分子結構保守的Ca2+靶蛋白,在鈣離子信號途徑中扮演重要角色。CaM通常由149個氨基酸組成,含有4個能夠與Ca2+結合的螺旋環(huán)螺旋(Helix-loop-helix)構成的EF-hand結構域[5-6]。CaM可以與Ca2+結合來影響Ca2+濃度,同時結合后所形成的復合體還可以激活鈣離子信號通路中一系列下游蛋白,進而調控植物生長發(fā)育及反應外界刺激[7-8]。

大量研究證明,CaM在植物響應低溫脅迫中具有非常重要的作用。Ca2+-CaM介導的信號轉導途徑通過與NO、活性氧系統(tǒng)(ROS)以及MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)交互作用,進而建立植物的耐低溫應答[9]。天山雪蓮SikCML7參與了天山雪蓮對低溫、干旱和鹽脅迫響應的過程[10]。在麻風樹(JatrophacurcasL.)中證實CaM可通過提高植株脯氨酸含量,進而改善植株的低溫耐受性[11]。近年來,通過生物技術手段,進一步證明CaM在提高植物的抗低溫脅迫上的重要作用。Zhang等[12]將一種南極魚的CaM基因片段轉入煙草后,可顯著增加轉基因植株在0 ℃或4 ℃下的PS Ⅱ光合效率,明顯提高轉基因植株的抗低溫能力。在番茄中,類CaM蛋白SlCML37過表達可顯著改善了果實的低溫耐受性[13];而過表達SlCML44的番茄植株表現出優(yōu)異的耐低溫能力,低溫脅迫下種子萌發(fā)率和幼苗生長情況顯著優(yōu)于對照植株[14]。Zhao等[15]鑒定的番茄CaM基因家族中發(fā)現SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列雖然不同,但卻能編碼相同的蛋白,并對多種脅迫刺激具有高敏感性。然而利用CaM基因探討番茄耐寒性的研究卻鮮有報道。

目前,番茄耐寒品種的選育工作仍以常規(guī)雜交育種為主,具有選育時間長、雜交不親和等缺點。CaM在眾多植物耐低溫方面的貢獻為番茄耐寒品種的選育提供了新的思路。針對SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列和蛋白序列進行生物信息學分析,并預測啟動子順勢作用元件。利用qRT-PCR技術探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在不同番茄品種中低溫脅迫下的表達模式。以期為CaM基因在番茄耐低溫方面應用,培育番茄新品種提供技術基礎和理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以番茄品種Heinz1706、LA3969、冀粉2號、冀粉3號和農博粉霸15為試驗材料。其中Heinz1706和LA3969引自TGRC(Tomato Genetics Resource Center,番茄遺傳資源中心);冀粉2號和冀粉3號為河北省農林科學院經濟作物研究所生物技術室選育,對低溫具有較高耐受性;農博粉霸15為石家莊農博士科技開發(fā)有限公司(河北)培育的商用品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理方法 分別選取飽滿、大小一致的供試材料種子20粒,經消毒、殺菌后于2020年10月16日浸種,10月21日播種于日光溫室。模擬田間環(huán)境(25 ℃,光周期12 h/12 h,光照強度為50 000 lx,相對濕度60%)培養(yǎng)生長21 d。①取Heinz1706品種幼苗葉片組織保存于-80 ℃,提取RNA用于克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因。②5種供試材料各選取長勢一致的植株10株,分為2批,每批材料5株,分別轉移至5, 15 ℃的培養(yǎng)箱中,光周期均設置為12 h/12 h,光照強度為50 000 lx,相對濕度60%,處理至0 ,0.25,0.5,1,2,4,8,12,24,48 h時取幼苗葉片于-80 ℃保存,提取RNA,上述處理每組取3次生物學重復,用于研究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在低溫脅迫下的表達模式。

1.2.2 總RNA 提取及反轉錄 按照Plant Total RNA Isolation Kit 試劑盒(成都福際生物技術有限公司)說明要求提取上述所取材料的總RNA,使用NanoDrope 2000微量紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質量,使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,并將濃度稀釋為100 ng/μL,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列參照參考文獻 [15]。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的cDNA序列收集自SGN數據庫(https://solgenomics.net/),對應的序列編號分別為Solyc10g077010.1.1、Solyc11g072240.1.1和Solyc12g099990.1.1。利用Primer Premier 5.0軟件跨基因編碼區(qū)設計特異性PCR引物(表 1)。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

以Heinz1706品種幼苗葉片cDNA為模板,利用SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的特異性引物進行PCR擴增。按照EasyTaq?DNA Polymerase(北京全式金生物技術有限公司)說明要求配置PCR擴增體系(25 μL):10×EasyTaq? Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,EasyTaq? DNA Polymerase 0.3 μL,正向引物(10 μmol/L) 1 μL,反向引物(10 μmol/L) 1 μL,模板cDNA(100 ng/μL) 2 μL,加ddH2O補至25 μL。反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒回收目的片段。并由華大基因(北京)測序。

1.2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5氨基酸序列分析 利用DNAMAN(ver.6.0)軟件將SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因翻譯為蛋白質序列,利用Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白理化性質分析,利用在線SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質二級結構,通過NCBI中的CDD(Conserved domain database)數據庫和SMART在線結構域篩查工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白保守結構域。

1.2.5 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因啟動子區(qū)順式作用元件分析 參考番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的CDS序列及基因組序列,截取起始密碼子上游2 kb的基因組序列認定為啟動子序列。利用PlantCARE在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子區(qū)順式作用元件預測分析。

1.2.6 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因在低溫脅迫下的表達模式及組織表達分析 根據SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的cDNA序列,避開保守片段,在各自的特異性區(qū)域內設計qRT-PCR引物(表1),以1.2.1中所述材料的cDNA為模板,以番茄β-actin基因為內參進行qRT-PCR分析。反應體系(10 μL):2 × SYBR premix EX Taq(TaKaRa) 5 μL,正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA(100 ng/μL)1 μL,加ddH2O補至10 μL。反應程序:95 ℃ 預變性30 s;95 ℃ 變性5 s,60 ℃ 退火30 s,45個循環(huán);95 ℃ 變性30 s,60 ℃ 退火1 min,95 ℃ 變性15 s。每種材料設置3次生物學重復,每個樣品設置3次技術重復,最終結果采用2-ΔΔCT法計算分析,其中,以各基因在0 h,即尚未進行脅迫處理時的表達量為對照,設為“1”[16]。使用SPSS 20.0進行顯著性分析。

于番茄功能基因組數據庫(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi)中下載番茄栽培種Heinz1706不同組織的RNA-seq測序數據(D004),提取SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同組織中的表達數據,導入MeV軟件,生成表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆

以番茄栽培種Heinz1706幼苗葉片組織的cDNA為模板,分別擴增SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現3次擴增反應均產生一條接近500 bp的特異性條帶?；厥諟y序分析表明,三者長度均為450 bp,具有連續(xù)完整的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼149個氨基酸。核酸序列比對(圖1)發(fā)現3條序列僅有較小差異,相似度為93.63%,而其編碼的氨基酸序列完全相同。

圖1 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因序列比對Fig.1 Sequence multi-alignment of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.2 氨基酸序列分析

對SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因所編碼的相同的蛋白序列進行理化性質分析,發(fā)現其蛋白長度為149個氨基酸,分子式為C721H1133N189O254S10,相對分子質量為16.83 ku;由20種氨基酸組成,其中酸性氨基酸Asp和Glu的含量最多,分別為13.4%和12.1%,堿性氨基酸(Arg和Lys)占10.06%,理論等電點4.1,為酸性蛋白;不穩(wěn)定系數24.43,為穩(wěn)定蛋白;親疏水性分析結果顯示,該蛋白的平均疏水指數為-0.619,為親水性蛋白。二級結構預測結果顯示,該蛋白由60.4%的α-螺旋、9.4%的β-折疊、6.04%的延伸鏈和24.16%的無規(guī)則卷曲組成;三級結構預測結果顯示(圖 2-A),該蛋白由較多α-螺旋構成了類似骨棒狀結構,中間由較長的α-螺旋連接,棒狀結構兩端分別含有2個鈣離子;對該蛋白結構域分析發(fā)現(圖 2-B),該蛋白屬于PTZ00184家族,即CaM蛋白家族,另含有4個EF-h domain(鈣離子結合結構域),與三級結構預測結果一致。

A.番茄CaM蛋白的三級結構預測;B.番茄CaM蛋白的保守結構域分析。A.Predicted tertiary structure of CaM protein of tomato;B.Conservative domain of CaM protein of tomato.圖2 番茄CaM蛋白的三級結構預測和保守結構域分析Fig.2 Predicted tertiarystructure and conservative domain of CaM protein of tomato

2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

為解析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達模式,分別對3個基因的啟動子區(qū)順式作用元件進行分析。結果顯示,3個基因的啟動子序列含有多種脅迫響應和激素信號響應的順勢元件(表 2),表明SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因雖然編碼同一個蛋白質,但各自的表達模式受到內外多因素的共同調控。3個基因各自的啟動子區(qū)除含有真核生物所必需的核心元件CAAT-box和TATA-box外,還含有如光信號響應元件:G-box、GT1-motif和MRE;激素類信號應答元件:ABRE(脫落酸信號響應元件)、CGTCA-motif(茉莉酸信號響應元件)、P-box(赤霉素信號響應元件)、TATC-box(赤霉素信號響應元件)、TCA-element(水楊酸信號響應元件)、TGA-element(生長素信號響應元件)和TGACG-motif(茉莉酸信號響應元件);脅迫響應元件:ARE(缺氧信號響應元件)、LTR(低溫信號響應元件)、MBS(干旱信號響應元件)和TC-rich repeats(防御和脅迫信號響應元件);另外在SlCaM3和SlCaM4基因的啟動子區(qū)還鑒定到CAT-box(分生組織特異性表達元件),推測SlCaM3和SlCaM4可能在分生組織中特異性表達并發(fā)揮作用。進一步分析發(fā)現,SlCaM3基因啟動子區(qū)所含順式作用元件的類型最為豐富,表明該基因在激素響應和抵御非生物脅迫等活動發(fā)揮著重要作用。橫向對比3個番茄CaM基因的順式元件分布情況發(fā)現,多數元件呈互補模式分布,預示著CaM蛋白功能的多樣性。

表2 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的啟動子序列順式作用元件分析Tab.2 Putative cis-element analysis in promoter regions of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因低溫脅迫下的表達模式

本研究共設置2個處理組:15,5 ℃,利用qRT-PCR技術,以0 h(尚未進行脅迫處理)的葉片cDNA樣品為對照,探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在多個番茄品種幼苗葉片組織中受低溫脅迫后一段連續(xù)時間內的表達情況。結果顯示,15 ℃處理(圖 3)時,番茄品種Heinz1706的葉片中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的表達在受脅迫2h內被抑制;4h之后表達量緩慢升高,其中SlCaM5基因表達上調較為明顯,SlCaM3和SlCaM4基因恢復至原有水平;LA3969的葉片中,SlCaM4基因在受到低溫刺激后0.25h內表達量降低,之后其表達緩慢升高,在4h時顯示為上調;SlCaM3和SlCaM5基因在受到脅迫后表達量持續(xù)升高,4h后尤為明顯,其中SlCaM5基因表達上調更為顯著。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在冀粉2號、冀粉3號和農博粉霸15中的表達模式與在Heinz1706中的表達模式類似;縱觀全局發(fā)現,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5種番茄材料中的表達模式均呈現出先降低后升高的趨勢,值得注意的是,SlCaM5基因處理后期表達量升高更為顯著。

不同小寫字母表示基因表達差異顯著(P<0.05)。圖4同。Different lowercase indicate significant different(P<0.05).The same as Fig.4.圖3 15 ℃低溫脅迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達模式Fig.3 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 15 ℃ cold stress

5 ℃處理(圖 4)時,SlCaM3基因在Hein1706z、LA3969、冀粉2號和冀粉3號葉片中的表達模式相似,其表達量雖有小幅度升高或降低,但總體水平與未進行低溫處理時基本一致;SlCaM4基因在Heinz1706中受到低溫脅迫后12 h內表達量無顯著變化,24 h后開始緩慢升高,在LA3969、冀粉2號和冀粉3號中2 h內表達受到抑制,4 h表達升高恢復至原有水平,之后再次受到抑制,于24～48 h再次升高;SlCaM5基因在Heinz1706、LA3969、冀粉2號和冀粉3號中的表達模式相似,在低溫處理前期其表達量變化不明顯,處理后期表達量顯著升高。在農博粉霸15中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達量均為先升高后降低的情況,且同時在處理1 h出現上調峰值,之后表達量逐步降低,在24 h后3個基因的表達均受到抑制,同時形態(tài)觀察顯示植株生命活動受到威脅。

圖4 5 ℃低溫脅迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達模式Fig.4 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 5 ℃ cold stress

上述結果顯示SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因對低溫較為敏感,在不同番茄品種中的表達模式不同,其中SlCaM5基因在受到不同程度的低溫脅迫后,表達量變化更為明顯,在多個耐寒品種中表達量呈上升趨勢,推測該基因在番茄抵御低溫過程中的高表達,在維持CaM蛋白的翻譯水平中發(fā)揮著重要作用。

本研究參考番茄RNA-Seq數據,分析了SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在栽培品種Heinz1706的不同組織及果實發(fā)育階段中的特異性表達模式。結果表明(圖 5),Heinz1706品種SlCaM3和SlCaM4在分生組織活躍的花、根和果實發(fā)育初期中具有較高的表達,而在葉和成熟果實中的表達水平較低;在啟動子順式元件分析結果中,SlCaM3和SlCaM4基因均含有分生組織特異性表達元件,結果相一致。SlCaM5基因在Heinz1706的不同組織中表達水平差異不明顯。

1.花蕾;2.花;3.葉片;4.根;5.1 cm 果實;6.2 cm 果實;7.3 cm 果實;8.綠熟期果實;9.轉色期果實;10.轉色10 d果實。1.Flower buds;2.Flowers;3.Leaves;4.Roots;5.1 cm fruits;6.2 cm fruits;7.3 cm fruits;8.Mature green fruits;9.Breaker fruits;10.Breaker +10 d fruits.圖5 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同組織中的表達模式Fig.5 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in different tissues of Heinz1706

3 結論與討論

CaM在高等生物中具有高度保守性,能夠承受很強的選擇壓力,在生物體中發(fā)揮著重要的生物學功能[17]。本研究中克隆到的SlCaM3、SlCaM4和SlCaM53條序列相似度為93.63%,編碼的149個氨基酸序列完全相同,并且具有CaM蛋白家族典型EF-h domain。CaM是一類廣譜型信號分子,其功能也具有廣泛性以適應復雜的生長環(huán)境,但不同的CaM基因在響應環(huán)境脅迫和激素信號時具有不同的分工[18]。本研究對3個基因的啟動子區(qū)順式元件分析發(fā)現,盡管SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因雖然編碼同一個蛋白質,但啟動子序列含有多種順勢元件響應多種非生物脅迫和激素信號,說明各自的表達模式受到內外多種不同因素的調控,在多種逆境脅迫下保證CaM蛋白功能不受影響。在SlCaM3和SlCaM4基因的啟動子區(qū)還鑒定到分生組織特異性表達元件,這與組織特性表達結果相互印證,表明啟動子區(qū)域復雜性,同時提示了作用元件的重要性。橫向對比順式元件分布,呈互補模式分布,提示基因家族或可能存在聯(lián)動調控的機制。

植物感受低溫信號并傳遞信號到細胞核內,激活轉錄因子,進而調節(jié)基因表達,引起一系列生理生化反應,產生抗寒能力,這是一個復雜的信號系統(tǒng)[19]。在低溫信號轉導途徑中,Ca2+是重要的第二信使[20-22]。低溫脅迫發(fā)生時,Ca2+濃度發(fā)生變化,Ca2+與受體蛋白CaM結合后進一步激活下游鈣依賴的蛋白激酶(CaMK)或CaM結合蛋白(CaMBP)[23-24],蛋白激酶的活化導致與活性氧代謝相關的POD、SOD、CAT等活性增強或轉錄因子激活,從而完成信號轉導,參與脅迫應答[25-26]。大量研究表明,CaM蛋白可以通過鈣離子信號途徑來提高植物對低溫脅迫的耐受性。沙冬青AmCaM1在低溫處理下1 h表達量開始上調[27]。茶樹CsCaM1和CsCaM2在低溫脅迫(4 ℃)下表達量均升高,其中CsCaM2受低溫影響的誘導程度更大[28]。本研究中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在5個番茄栽培品種受低溫脅迫時表達量均有所變化,15 ℃下這3個基因在所有番茄品種中表達量均呈上調趨勢,其中SlCaM5對低溫的響應更為迅速(LA3969、農博粉霸15),并且在5個品種中表達量變化更為明顯。5 ℃時這3個基因的表達情況更為復雜,在Heinz1706、LA3696、冀粉2號和冀粉3號4個品種中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5表達量均表現為上調趨勢,但對低溫脅迫時間的響應不盡相同;然而在農博粉霸15中,這3個基因表達量先升高,并于低溫脅迫1 h后達最高表達量,然后下降。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品種中對不同程度低溫以及脅迫時間有不同的響應模式,表明其參與了番茄抵御低溫過程,并在其中發(fā)揮著重要的調控作用。

CaM蛋白在植物中的表達具有器官差異性。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表達量較高;而CoCaM2在果實發(fā)育以及油脂積累過程中的表達量較高[29]。鴨梨PbCaM1和PbCaM2在成葉、盛花期花瓣和幼果期表達量較高[30]。百脈根LjCaM3在根及根瘤中的相對表達量顯著高于莖、葉、花和豆莢[31]。本研究中,SlCaM5基因在Heinz1706的不同組織中表達水平差異不明顯,而SlCaM3和SlCaM4在分生組織活躍的花、根和果實發(fā)育初期中具有較高的表達,而在葉和成熟果實中的表達水平較低。這表明它們在花、果實形成以及根的發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調控作用,同時也提示了基因調控的多樣性。

克隆獲得了番茄SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因,三者編碼相同的蛋白序列,啟動子區(qū)域含有多種響應生物及非生物脅迫的順式作用元件。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在番茄不同組織中表達差異性明顯,在不同番茄品種中對低溫脅迫較為敏感,預示著番茄CaM基因可能在番茄抵御低溫過程中發(fā)揮著作用。