任海偉，石瑞鋒，魏慧元，王 莉，郭曉鵬，陸 棟，劉瑞媛，李金平

·農(nóng)產(chǎn)品加工工程·

菌/酶添加對(duì)甜高粱渣青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果

任海偉1,2,3，石瑞鋒1，魏慧元1，王 莉1，郭曉鵬1，陸 棟4，劉瑞媛4，李金平2,3※

（1. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院/西部能源與環(huán)境研究中心，蘭州 730050；2. 甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；3. 西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，蘭州 730050；4. 中科院近代物理研究所，蘭州 730050）

為實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)甜高粱渣的青貯強(qiáng)化預(yù)處理和能源化利用，該研究探究了不同添加劑對(duì)其青貯質(zhì)量和酶解糖化效果的影響。試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（CK組）、植物乳桿菌組（L組）、纖維復(fù)合酶組（E組）和復(fù)合添加劑組（LE組），系統(tǒng)考察甜高粱渣在21 d青貯預(yù)處理期間的營(yíng)養(yǎng)成分、木質(zhì)纖維組分和發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，采用隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)青貯質(zhì)量，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析青貯預(yù)處理過(guò)程的微生物菌群動(dòng)態(tài)演繹。結(jié)合酶解糖化性能評(píng)價(jià)青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果，從而篩選適宜的添加劑。結(jié)果表明：青貯預(yù)處理后甜高粱渣的粗蛋白、淀粉、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、半纖維素和纖維素等能量組分含量顯著高于原料（<0.05）。青貯21 d時(shí)，3個(gè)添加劑組的干物質(zhì)、可溶性碳水化合物和粗蛋白含量顯著高于CK組（<0.05），綜纖維素含量顯著低于CK組（<0.05），且E組的干物質(zhì)含量最高，L組的粗蛋白含量最高，E組和LE組的可溶性碳水化合物含量最高。青貯預(yù)處理期間，3 個(gè)添加劑組的pH值均低于4.2，L組的乳酸和乙酸含量明顯高于CK組（<0.05），E組的乳酸/乙酸和乳酸/總有機(jī)酸比值顯著高于CK組（<0.05）。隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)E組的青貯發(fā)酵質(zhì)量最高。微生物菌群結(jié)果顯示，甜高粱渣經(jīng)青貯預(yù)處理后，3個(gè)添加劑組的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性都明顯下降，門(mén)水平細(xì)菌主要以變形菌為主，屬水平細(xì)菌主要包含腸桿菌、泛菌、明串珠菌、魏斯氏菌、拉恩氏菌和葡糖桿菌等，這些微生物與青貯質(zhì)量密切相關(guān)。甜高粱渣經(jīng)青貯預(yù)處理后的還原糖得率顯著提升，尤其E組得率比原料提高了117%。結(jié)合成本效益法分析，利用纖維復(fù)合酶對(duì)甜高粱渣進(jìn)行青貯強(qiáng)化處理的E組純收益最高，較甜高粱渣原料提高了近3倍?？傊?，單獨(dú)添加纖維復(fù)合酶不僅能明顯改善甜高粱渣的青貯發(fā)酵質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定保存，還能使其青貯預(yù)處理作用得到強(qiáng)化，進(jìn)而提高甜高粱渣的生物降解性能，是一種經(jīng)濟(jì)合理、技術(shù)可行的青貯預(yù)處理強(qiáng)化方法。

青貯；發(fā)酵；植物乳桿菌；纖維復(fù)合酶；甜高粱渣；微生物菌群；酶解糖化

0 引 言

中國(guó)生物質(zhì)資源量豐富，年均產(chǎn)生量約34.94億t（折合4.6億t標(biāo)煤），目前已實(shí)現(xiàn)能源化利用的資源量約4.61億t，碳排量減少約2.18億t。預(yù)計(jì)2030年各類(lèi)生物質(zhì)能的利用將會(huì)為全社會(huì)減少碳排放約9億t，到2060年將實(shí)現(xiàn)碳減排約20億t。因此，大力發(fā)展生物質(zhì)能等清潔能源不僅是“十四五”期間生物經(jīng)濟(jì)和可再生能源發(fā)展的重點(diǎn)方向，也是中國(guó)順利實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的重要途徑。甜高粱是一種C4能源植物，具有耐旱、耐鹽堿、生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)。甜高粱莖汁含有豐富的葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性碳水化合物，能發(fā)酵制取氫氣、丁酸等產(chǎn)品[1-2]。榨汁后的甜高粱渣富含纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物，被廣泛用于生物乙醇、生物甲烷、復(fù)合材料、動(dòng)物飼料等領(lǐng)域[3-4]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2022年中國(guó)甜高粱種植面積約4.88萬(wàn)hm2，產(chǎn)量約475萬(wàn)t，其榨汁后可產(chǎn)生甜高粱渣136.4萬(wàn)t，資源量巨大[3]。由于甜高粱渣的水分、糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量還相對(duì)較高，若不能及時(shí)保質(zhì)貯存和高效利用，不僅容易造成腐敗變質(zhì)和資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染等問(wèn)題。

青貯作為一種典型的濕法貯存技術(shù)，不僅能延長(zhǎng)生物質(zhì)原料貯存時(shí)間，有效保存其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量組分，還能起到一定的生化預(yù)處理作用[5-6]。同時(shí)，添加乳酸菌、酵母菌、木質(zhì)纖維分解菌等微生物菌劑以及酶制劑和有機(jī)酸等添加劑能在一定程度上強(qiáng)化青貯預(yù)處理作用，進(jìn)而提高其生物降解性能和乙醇、甲烷等能源產(chǎn)出[7-8]。XING等[7]發(fā)現(xiàn)高粱秸稈青貯過(guò)程中加入復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶）能顯著降低中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量，提高青貯質(zhì)量。USMAN等[9]發(fā)現(xiàn)添加產(chǎn)阿魏酸酯酶的植物乳桿菌能促進(jìn)高粱秸稈的青貯發(fā)酵，降低pH值并抑制不良微生物生長(zhǎng)，提高還原糖和乙醇發(fā)酵得率。WRIGHT等[10]發(fā)現(xiàn)通過(guò)青貯甜高粱渣可有效抑制不良微生物，獲得穩(wěn)定保存并用于能源生產(chǎn)。WILK等[11]發(fā)現(xiàn)添加布氏乳桿菌能促進(jìn)青貯甜高粱渣的異型乳酸發(fā)酵，提高乙酸含量，改善有氧穩(wěn)定性，強(qiáng)化青貯效果。DONG等[12]認(rèn)為甜高粱渣青貯中添加植物乳桿菌、布氏乳桿菌和纖維素酶進(jìn)行聯(lián)合強(qiáng)化作用后，可獲得低pH值、高含量乳酸和可溶性碳水化合物。ZEGADA-LIZARAZU等[13]認(rèn)為聯(lián)合添加布氏乳桿菌和干酪乳桿菌能顯著降低青貯甜高粱渣的干物質(zhì)損失，提高乳酸、乙酸和丙酸含量及產(chǎn)甲烷潛力。但有關(guān)纖維復(fù)合酶、植乳乳桿菌對(duì)甜高粱渣青貯預(yù)處理效果評(píng)價(jià)的研究還鮮有報(bào)道。

本文以甜高粱渣的保質(zhì)貯存和強(qiáng)化生物降解為目標(biāo)，探討了甜高粱渣青貯預(yù)處理過(guò)程中添加植物乳桿菌、纖維復(fù)合酶（纖維素酶和木聚糖酶）對(duì)木質(zhì)纖維等有機(jī)組分、青貯發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響并通過(guò)HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)分析青貯過(guò)程中的細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)演繹進(jìn)程，通過(guò)酶解糖化試驗(yàn)比較不同添加劑對(duì)青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果，同時(shí)結(jié)合成本效益法綜合評(píng)價(jià)不同添加劑的經(jīng)濟(jì)合理性，進(jìn)而篩選適宜的添加劑，以期為甜高粱渣木質(zhì)纖維組分高效轉(zhuǎn)化和能源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

甜高粱（KFJT-3品系）原料來(lái)自中科院近代物理研究所白銀種植基地，榨汁后切短至1～2 cm備用。植物乳桿菌（ACCC11016）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

青貯預(yù)處理所用纖維復(fù)合酶（含纖維素酶和木聚糖酶，復(fù)合比4∶1）購(gòu)于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。依《飼用纖維素酶活性的測(cè)定：GB/T 23881-2009》和《飼料添加劑木聚糖酶活力的測(cè)定：GB/T 23874-2009》測(cè)得該復(fù)合酶的纖維素酶活力為60 000 U/g，木聚糖酶活力為20 000 U/g，綜合酶活力為52 000 U/g。酶活力定義：1 g酶粉于50 ℃、pH 值5.0條件下，1 min水解羧甲基纖維素或木聚糖產(chǎn)生1 μg葡萄糖或木糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

F800纖維分析儀和K9840 半自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技公司；SpectraMax M5酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司。

1.2 青貯發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量甜高粱渣原料（sweet sorghum bagasse，SSB），與不同添加劑充分混勻后立即裝入聚乙烯包裝袋，抽真空后迅速密封，常溫（20±2） ℃下避光青貯21 d。每隔7 d定期取樣分析有機(jī)組分、發(fā)酵品質(zhì)和微生物菌群多樣性。添加劑加入量均以原料鮮重（fresh weight，F(xiàn)W）為基礎(chǔ)，設(shè)置植物乳桿菌組（L組，添加量1×108CFU/g 以FW計(jì)，下同）、纖維復(fù)合酶組（E組，添加量3 g/kg）和菌酶聯(lián)合處理組（LE組，植物乳桿菌添加量1×108CFU/g，纖維復(fù)合酶添加量3 g/kg）3個(gè)添加劑處理組和1個(gè)空白對(duì)照組（CK組，青貯時(shí)添加等量蒸餾水），每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)平行[14]。

1.3 青貯質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.3.1 有機(jī)組分含量分析

干物質(zhì)（dry matter，DM）、水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、粗蛋白（crude protein，CP）、淀粉（starch，ST）、中性洗滌纖維NDF（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維ADF（acid detergent fiber，ADF）和酸性洗滌木質(zhì)素ADL（acid detergent lignin，ADL）等組分測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。纖維素CL（cellulose，CL）、半纖維素HC（hemicellulose，HC）和綜纖維素HoC（holocellulose，HoC）含量依式（1）～（3）計(jì)算[16]。

CL=ADF-ADL（1）

HC=NDF-ADF（2）

HoC=CL+HC（3）

1.3.2 青貯發(fā)酵品質(zhì)分析

pH值測(cè)定采用UB-7酸度計(jì)，氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，AN）分析采用苯酚-次氯酸鈉比色法，乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸產(chǎn)物分析采用安捷倫1 200高效液相色譜儀檢測(cè)，配置 KC-811 離子柱和 DAD 檢測(cè)器，柱溫50 ℃，流動(dòng)相3 mmol/L HClO4溶液，進(jìn)樣量 5 μL[6]。

1.3.3 青貯質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)有機(jī)組分和發(fā)酵特性等9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[17]，計(jì)算參考式（4）～（5）。以全部指標(biāo)隸屬函數(shù)值平均值大小進(jìn)行排序。

U（+）=（X-min）/（max-min）（4）

U（-）=1-（X-min）/（max-min）（5）

式中U（+）為各指標(biāo)正相關(guān)隸屬函數(shù)值；U（-）為各指標(biāo)負(fù)相關(guān)隸屬函數(shù)值；X為某指標(biāo)測(cè)定值；min和max分別為某指標(biāo)所有測(cè)定值的最小值和最大值。

1.3.4 青貯預(yù)處理前后的甜高粱渣生物降解性能評(píng)價(jià)

采用酶解糖化方法評(píng)價(jià)其生物降解性能。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g甜高粱渣原料或青貯21 d樣品，按照1∶20（g/mL）料液比加入檸檬酸緩沖液（pH 值為4.8，0.05 mol/L），然后依次添加購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司的纖維素酶（標(biāo)注酶活力3 000 U/g，加酶量1 000 U/g）、半纖維素酶（標(biāo)注酶活力1 500 U/g，加酶量500 U/g）和-葡聚糖苷酶（標(biāo)注酶活力3 300 U/mg加酶量1 U/g）進(jìn)行酶解反應(yīng)，對(duì)照組加入等量蒸餾水，恒溫振蕩酶解72 h，間隔12 h測(cè)定酶解液中的單糖組分。葡萄糖與木糖得率按式（6）～（7）計(jì)算，還原糖得率由各單糖得率相加[18]。

式中Y為葡萄糖得率，mg/g；Y為木糖得率，mg/g；為單糖濃度，g/mL；為上清液體積，mL；為稀釋倍數(shù)；為樣品質(zhì)量，g；0.9為葡萄糖與葡聚糖轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為木糖與木聚糖轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.4 青貯發(fā)酵過(guò)程的微生物菌群分析

依Water DNA試劑盒步驟提取微生物總DNA。PCR 擴(kuò)增區(qū)域16SrDNA V3-V4 區(qū)，選擇引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3'）。采用 PCR儀對(duì)細(xì)菌16SrDNA基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的 PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫；最后采用NaOH對(duì)PCR產(chǎn)物變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，用HiSeq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，按照97%相似性水平劃分操作分類(lèi)單元（OTU）。采用QIIME軟件計(jì)算Shannon和Chao1等Alpha多樣性指數(shù)，選取相對(duì)豐度高于0.1%的細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行門(mén)、屬水平分析，并基于屬水平相對(duì)豐度構(gòu)建主坐標(biāo)分析（PCA）[19]。

1.5 經(jīng)濟(jì)效益指標(biāo)分析

運(yùn)用成本收益法對(duì)甜高粱渣青貯預(yù)處理過(guò)程涉及的成本投入和綜合收益進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)成本收益理論構(gòu)建適宜的青貯預(yù)處理成本收益模型，計(jì)算式為

I=M·-W·-(E+1)（8）

M=W·R（9）

式中表示甜高粱渣（原料或青貯預(yù)處理）的純收益，元；表示每噸甜高粱渣（原料或青貯預(yù)處理）酶解糖化后的還原糖質(zhì)量，t；表示每噸甜高粱渣（原料或青貯預(yù)處理）的干基質(zhì)量，t；表示酶解糖化后的還原糖得率，mg/g；表示還原糖的市場(chǎng)收購(gòu)價(jià)格，4 520元/t，（參考99%葡萄糖售價(jià)）；表示纖維素酶解成本，1 300 元/t 以計(jì)[20]；表示每噸甜高粱渣的青貯成本，元/t（含添加劑成本）；1表示每噸甜高粱渣的收購(gòu)成本，元；表示原料或不同預(yù)處理方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)Excel 2019軟件整理原始數(shù)據(jù)，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析，單因子 ANOVO模型處理及Duncan方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 9.0軟件繪制圖表。<0.05 代表數(shù)據(jù)差異顯著，>0.05代表數(shù)據(jù)差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯預(yù)處理過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化

2.1.1 干物質(zhì)與干物質(zhì)損失率

甜高粱渣中的干物質(zhì)主要包括粗蛋白、淀粉和可溶性碳水化合物等，其含量高低能綜合反映青貯質(zhì)量?jī)?yōu)劣，這些組分的含量越高，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失越少，青貯品質(zhì)越好[21]。由圖1a可知，與原料相比，4個(gè)試驗(yàn)組在青貯7d時(shí)的干物質(zhì)含量顯著下降（<0.05），這是因?yàn)榍噘A初期原料附著的乳酸菌等微生物菌群利用WSC和淀粉等易降解組分發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、CO2和H2O所致[22]。青貯14和21 d時(shí)，4個(gè)試驗(yàn)組的DM含量總體保持穩(wěn)定，其中E組在14和21 d呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，說(shuō)明添加纖維復(fù)合酶有助于減緩干物質(zhì)損失?？芙瓭萚23]也認(rèn)為纖維素酶和木聚糖酶能減少青貯過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗，提高青貯DM含量。原因在于纖維復(fù)合酶的添加有效分解了植物細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物，為有益乳酸菌等微生物活動(dòng)提供了充足的發(fā)酵底物，促進(jìn)了發(fā)酵進(jìn)程。同時(shí)，隨著乳酸等有機(jī)酸積累和pH值降低，也抑制了其他不良微生物活性，進(jìn)而減少干物質(zhì)損耗。這與E組在21 d青貯期間的干物質(zhì)含量顯著高于CK組（<0.05），干物質(zhì)損失率顯著低于CK組（<0.05）結(jié)果相吻合。

注：CK，對(duì)照組；L，植物乳桿菌處理組；E，纖維復(fù)合酶處理組；LE，菌酶聯(lián)合處理組。不同大寫(xiě)字母表示相同處理組不同時(shí)間差異顯著（P<0.05）；不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間不同處理組差異顯著（P<0.05）。下同。

2.1.2 粗蛋白

粗蛋白含量是反應(yīng)青貯質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。由圖 2a可知，青貯甜高粱渣的CP含量均顯著高于原料（<0.05），且青貯21 d時(shí)，3個(gè)添加劑組均顯著高于CK組（<0.05），說(shuō)明青貯發(fā)酵有利于減少CP損失，尤其加入植物乳桿菌和纖維復(fù)合酶等添加劑對(duì)保存CP均能起到積極作用。L組的CP含量在21 d青貯期間始終處于最高值，顯著高于其他試驗(yàn)組（<0.05）。這是因?yàn)橹参锶闂U菌的加入能使青貯發(fā)酵過(guò)程中的乳酸菌等有益微生物迅速繁殖，代謝產(chǎn)生大量乳酸并使pH值下降，從而抑制有害微生物對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解[24]。另一方面，植物蛋白水解酶的最適pH值為5.5，低pH的酸性青貯環(huán)境也會(huì)抑制植物蛋白水解酶活性，從而減少CP分解[25]。XING等[7]也認(rèn)為添加植物乳桿菌有利于保存青貯甜高粱的蛋白組分。

2.1.3 淀粉

淀粉是甜高粱渣中重要的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物。從圖2b可以看出，青貯7 d時(shí)甜高粱渣的淀粉含量均顯著高于原料（<0.05），其中CK組的淀粉含量隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而其余3個(gè)添加劑組則呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，使得L組、E組和LE組的淀粉含量在7 d時(shí)均顯著高于CK組（<0.05），在14和21 d時(shí)顯著低于CK組（<0.05）。原因可能是因?yàn)榍噘A前期植物乳桿菌和纖維復(fù)合酶添加劑能強(qiáng)化青貯發(fā)酵進(jìn)程，加快體系中的乳酸和乙酸等有機(jī)酸積累，進(jìn)一步使pH值快速下降，并有效抑制芽孢桿菌等可降解淀粉微生物的活性，減少了青貯初期的淀粉消耗[26]。但隨著青貯過(guò)程的繼續(xù)，青貯微生物菌群不斷發(fā)生變化，可能會(huì)形成具有能分泌淀粉酶的微生物菌群，并使之發(fā)生降解，導(dǎo)致3個(gè)添加劑組在14和21 d時(shí)的淀粉含量明顯低于CK組。申瑞瑞等[24]報(bào)道的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖2 青貯預(yù)處理過(guò)程中粗蛋白、淀粉和可溶性碳水化合物含量的動(dòng)態(tài)變化

2.1.4 可溶性碳水化合物

WSC是青貯發(fā)酵微生物菌群繁殖代謝的重要底物，WSC≥7%（DM）是青貯pH值能否快速下降的關(guān)鍵[27]。試驗(yàn)中，甜高粱渣原料的WSC含量能完全滿(mǎn)足青貯啟動(dòng)之必要條件。青貯7 d時(shí)，4個(gè)試驗(yàn)組的WSC含量均明顯下降（<0.05），原因在于青貯發(fā)酵初期體系中的微生物菌群活動(dòng)頻繁，WSC作為代謝底物被優(yōu)先消耗[28]。青貯21 d時(shí)，3個(gè)添加劑組的WSC含量顯著高于CK組（<0.05）。這是因?yàn)榈蚿H值的青貯環(huán)境抑制了體系內(nèi)不良微生物菌群的代謝活性，使3個(gè)添加劑組中WSC的消耗量低于CK組；同時(shí)青貯體系中加入的植物乳桿菌和纖維復(fù)合酶等添加劑在一定程度上也促進(jìn)了纖維素、半纖維素、淀粉等碳水化合物的分解，使之相較于CK組而言形成了更多的WSC[9,23]。DONG等[12]認(rèn)為添加商業(yè)乳酸菌和菌酶制劑（植物乳桿菌、布氏乳桿菌和纖維素酶）有利于保存青貯甜高粱渣中的WSC組分。FOSTER等[29]也認(rèn)為在甜高粱青貯中添加纖維素酶和木聚糖酶能提高WSC含量?？傊?，甜高粱渣青貯預(yù)處理過(guò)程中加入添加劑有利于甜高粱渣WSC含量保存。

2.2 青貯預(yù)處理過(guò)程中木質(zhì)纖維組分變化

木質(zhì)纖維組分主要包括NDF、ADF、ADL、CL和HC等，這些組分既是甜高粱渣的重要能量組分，也對(duì)其降解性能有很大影響。由表1可知，發(fā)酵時(shí)間、添加劑和其交互作用對(duì)青貯甜高粱渣的木質(zhì)纖維組分含量均有極顯著影響（<0.001）。具體地，青貯7 d時(shí)，4個(gè)試驗(yàn)組的ADF和NDF含量均顯著高于原料（<0.05），且NDF含量隨時(shí)間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，3個(gè)添加劑組的ADF含量則呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，分別在7 d和14 d時(shí)達(dá)到最高值。這是因?yàn)槟举|(zhì)纖維組分因其致密的抗降解屏障網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)，較難被青貯微生物菌群利用，這與ZHANG等[5]研究結(jié)果一致。然而，DONG等[12]發(fā)現(xiàn)甜高粱渣在青貯60 d時(shí)的NDF和ADF含量均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明較長(zhǎng)時(shí)間的青貯預(yù)處理能顯著降低NDF和ADF含量。本試驗(yàn)的青貯周期相對(duì)較短（21 d），使得青貯發(fā)酵過(guò)程中蘊(yùn)藏的生物預(yù)處理作用尚未能充分發(fā)揮效果。

ADF是生物質(zhì)經(jīng)過(guò)酸性處理后，不溶于酸性洗滌劑的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，主要包含纖維素和木質(zhì)素等。與CK組和E組相比，L組和LE組的ADF含量在整個(gè)青貯期間顯著增加（<0.05）。有報(bào)道認(rèn)為，植物乳桿菌自身降解CL的能力較弱，而且在植物乳桿菌的影響下纖維素酶不能有效發(fā)揮對(duì)CL的降解作用，致使L組和LE組中的ADF含量升高[30]。NDF包括酸性洗滌木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等組分，其中半纖維素（HC）是較容易降解的組分之一，在酸性青貯條件下更易被降解[31]。L組和LE組在添加植物乳桿菌后，乳酸協(xié)同其他有機(jī)酸形成的低pH環(huán)境強(qiáng)化了對(duì)HC的降解作用，使L組和LE組的NDF和HC含量顯著低于CK組和E組（<0.05）。青貯21 d時(shí)，E組在纖維素酶和木聚糖酶的共同作用下有效破壞了木質(zhì)纖維的致密結(jié)構(gòu)，強(qiáng)化了CL的降解效果，使其CL含量顯著低于CK組（<0.05）。HC和CL組分含量的同時(shí)下降，使3個(gè)添加劑組在14 和21 d時(shí)的NDF和HoC含量顯著低于CK組（<0.05）。ADL組分一般通過(guò)共價(jià)鍵、酯鍵和氫鍵與纖維素、半纖維素緊密結(jié)合，不僅自身較難被降解，而且也是結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解的主要屏障。整個(gè)青貯期間，4個(gè)試驗(yàn)組中的ADL含量均顯著高于未青貯原料（<0.05），且CK組和LE組中ADL含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，二者在14 d時(shí)達(dá)到最高值，而L組和E組則呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，這種變化趨勢(shì)致使青貯21 d時(shí)的L組中ADL含量顯著高于CK組（<0.05），但LE組和E組與CK組之間沒(méi)有顯著差異（>0.05）。這與GUO等[32]報(bào)道在玉米/青稞混合青貯中添加酶制劑（纖維素酶和木聚糖酶）和菌酶（植物乳桿菌、纖維素酶和木聚糖酶）之后的ADL含量顯著上升結(jié)果相一致。總之，添加植物乳桿菌和纖維復(fù)合酶有利于HC的降解，并有效保存CL含量，青貯預(yù)處理能為后續(xù)的酶解糖化反應(yīng)提供充足的能量組分。

表1 青貯預(yù)處理過(guò)程中木質(zhì)纖維組分的變化

注：不同大寫(xiě)字母表示相同處理組不同時(shí)間差異顯著（<0.05）；不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間不同處理組差異顯著（<0.05）。*<0.05，影響顯著；**<0.01，影響高度顯著；***<0.001，影響極顯著。下同。

Note: Different capital letters indicated significant difference between the same treatments at different time (<0.05); Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments at the same time (<0.05). *<0.05, significant effects; **<0.01，very significant effects; ***<0.001, extremely significant effects. The same below.

2.3 青貯預(yù)處理過(guò)程的發(fā)酵品質(zhì)變化

2.3.1 pH值

pH 值是衡量青貯發(fā)酵質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)，pH值介于3.8～4.2范圍說(shuō)明發(fā)酵品質(zhì)相對(duì)較好。從圖3可知，由于青貯初期原料表面附著的乳酸菌等有益微生物利用WSC組分大量繁殖并代謝產(chǎn)生乳酸（pKa=3.86）和乙酸（pKa= 4.75）等有機(jī)酸[33]，使得4個(gè)試驗(yàn)組在7 d時(shí)的pH值均快速下降至4.2以下（3.83～4.15）。尤其乳酸對(duì)pH值的影響強(qiáng)度是乙酸的12倍，是pH值下降的主要驅(qū)動(dòng)因素[33]。青貯7 d時(shí)，L組和LE組的pH值明顯低于CK組和E組（<0.05），說(shuō)明植物乳桿菌添加后強(qiáng)化了青貯體系中的乳酸發(fā)酵，使青貯pH值低于其它試驗(yàn)組，這一點(diǎn)與表2中乳酸含量變化趨勢(shì)相一致。青貯14和21 d時(shí)，盡管L組和LE組的pH值均高于CK對(duì)照組，但仍低于優(yōu)良青貯范圍（<4.2）。這可能是因?yàn)榍噘A體系中的腸桿菌等微生物菌群能將乳酸代謝轉(zhuǎn)化為乙酸；而且LE組在21 d時(shí)有較高含量的氨氮物質(zhì)（圖4），對(duì)體系pH值下降也有一定的緩沖能力，這些因素都可能是造成其較高pH值的原因[34]。

圖3 青貯預(yù)處理過(guò)程中的pH值變化

2.3.2 氨態(tài)氮含量

氨態(tài)氮含量反映了青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)和氨基酸的分解程度，氨態(tài)氮含量越高說(shuō)明分解越多，意味著發(fā)酵品質(zhì)變差，當(dāng)超出閾值7%時(shí)即認(rèn)為腐敗變質(zhì)[35]。由圖4可知，青貯甜高粱渣中的氨氮含量均顯著高于原料（<0.05），且CK組、L組和E組隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，在14 d時(shí)達(dá)到最高值；LE組則總體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在21 d時(shí)達(dá)到最高。所有試驗(yàn)組的氨態(tài)氮含量均低于腐敗變質(zhì)的閾值7%，說(shuō)明本試驗(yàn)中甜高粱渣青貯過(guò)程中的蛋白質(zhì)分解程度較低，青貯品質(zhì)良好。這可能是因?yàn)榍噘A發(fā)酵進(jìn)程使體系pH值快速下降，有效抑制了植物蛋白酶或有害微生物活性所致[9,33]。青貯21 d時(shí)，L組和E組的AN含量顯著低于CK組（<0.05），說(shuō)明纖維復(fù)合酶和植物乳桿菌的添加有助于減少蛋白分解。同時(shí)，E組的氨態(tài)氮含量在整個(gè)青貯期間均顯著低于CK組（<0.05），L組在14和21 d時(shí)也顯著低于CK組（<0.05）。說(shuō)明青貯過(guò)程中加入纖維素酶或植物乳桿菌能不同程度地促進(jìn)青貯乳酸發(fā)酵，強(qiáng)化對(duì)梭狀芽孢桿菌等腐敗菌和植物蛋白酶活性的抑制作用，進(jìn)而減少蛋白質(zhì)的分解[36]。

2.3.3 青貯微生物菌群的代謝產(chǎn)物

小分子有機(jī)酸是青貯微生物菌群的主要代謝產(chǎn)物。由表2可知，發(fā)酵時(shí)間、添加劑及其交互作用對(duì)青貯發(fā)酵產(chǎn)物的構(gòu)成及其含量均有極顯著影響（<0.001）。具體地，4個(gè)試驗(yàn)組LA含量均顯著高于原料（<0.05），且隨著青貯周期延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，其中L組和LE組在7 d時(shí)達(dá)到最高值，CK組和E組在14 d達(dá)到最高值。說(shuō)明青貯預(yù)處理過(guò)程中的微生物菌群代謝產(chǎn)生了一定量的乳酸[5]，而且加入植物乳桿菌作為添加劑更有助于乳酸菌群的快速繁殖和乳酸生成，進(jìn)而促進(jìn)乳酸含量快速累積[28]。另一方面，3個(gè)添加劑組的LA含量在整個(gè)青貯過(guò)程中均顯著高于CK組（<0.05），這與XU等[37]研究結(jié)果一致。說(shuō)明不僅植物乳桿菌能有效促進(jìn)乳酸積累，添加纖維復(fù)合酶也有同樣效果，因?yàn)樘鸶吡辉诶w維復(fù)合酶的作用下，纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物組分會(huì)發(fā)生一定程度地降解，從而釋放更多可溶性糖，為青貯過(guò)程中的乳酸菌發(fā)酵提供了充足底物，促進(jìn)了乳酸菌群代謝[6]。

圖4 青貯預(yù)處理過(guò)程中氨態(tài)氮含量動(dòng)態(tài)變化

表2 青貯預(yù)處理過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化

注：有機(jī)酸為乳酸、乙酸和丙酸之和。

ote: Total organic acids are the sum of lactic acid, acetic acid and propionic acid.

乙酸是青貯過(guò)程中常見(jiàn)的有機(jī)酸，是一種良好的酸化劑和防腐劑，可以有效抑制霉菌和酵母菌生長(zhǎng)，提高有氧穩(wěn)定性。優(yōu)質(zhì)青貯的乙酸含量（DM）一般為1～3%[33]。由表2可知，CK組和E組的乙酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，二者均在14 d達(dá)到最高值；L組和LE組的乙酸含量則隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，且L組在整個(gè)青貯期間始終高于CK組（<0.05）。青貯7 d時(shí)體系中的乙酸含量迅速增加，原因可能是明串珠菌、魏斯氏菌等異型乳酸發(fā)酵菌的相對(duì)豐度顯著增加，代謝產(chǎn)生乙酸所致[38]，這與圖9結(jié)果相吻合。青貯21 d時(shí)，L組和LE組在青貯后期的高乙酸含量可能與厭氧環(huán)境中腸桿菌群將體系中的WSC和LA轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸等物質(zhì)有關(guān)[34]。丙酸也是一種短鏈脂肪酸，有助于提高青貯有氧穩(wěn)定性。試驗(yàn)中的丙酸含量均很低，最高含量?jī)H為0.54 g/kg DM，處于良好青貯范圍（<0.1%DM）[33]。整個(gè)青貯過(guò)程中均未檢測(cè)出丁酸，說(shuō)明沒(méi)有梭狀芽孢桿菌等典型的丁酸腐敗菌[14]。

乳酸、乙酸等有機(jī)酸的聯(lián)動(dòng)變化使4個(gè)試驗(yàn)組的乳酸/乙酸（LA/AA）和乳酸/總有機(jī)酸（LA/TOA）比值均顯著高于原料（<0.05），且呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并在7 d時(shí)均達(dá)到最高值。研究表明，LA/AA比值反映了青貯過(guò)程的乳酸發(fā)酵模式，LA/AA比值高于2.0一般被認(rèn)為是同型乳酸發(fā)酵[39]。4個(gè)試驗(yàn)組在21 d青貯期間的LA/AA值始終大于2.0，LA/TOA值始終高于0.65，說(shuō)明4個(gè)試驗(yàn)組均以同型乳酸發(fā)酵為主，具有良好的乳酸發(fā)酵強(qiáng)度，也達(dá)到了優(yōu)良青貯范疇[40]。這與USMAN等[9]報(bào)道的甜高粱青貯中添加植物乳桿菌的作用效果一致。尤其E組的LA/AA和LA/TOA比值在21 d青貯期間始終明顯高于其他試驗(yàn)組（<0.05），說(shuō)明纖維復(fù)合酶的加入強(qiáng)化了青貯過(guò)程的乳酸發(fā)酵強(qiáng)度。FOSTER等[29]在高粱青貯中添加纖維復(fù)合酶（纖維素酶和木聚糖酶）也發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似效果。

2.3.4 青貯預(yù)處理過(guò)程中各指標(biāo)參數(shù)的相關(guān)性分析

由圖5可知，青貯7 d時(shí)，甜高粱渣中的WSC含量與CP含量呈顯著正相關(guān)（<0.05），與ADL含量呈顯著負(fù)相關(guān)（<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.95、0.96。青貯pH值與ADF和CL含量呈顯著負(fù)相關(guān)（<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.99、0.98。青貯14 d時(shí)，甜高粱渣中的NDF含量與HC含量呈顯著正相關(guān)（<0.05），CL含量與ADF含量呈顯著正相關(guān)（<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.88、0.99。青貯21 d時(shí)，甜高粱渣中的NDF含量和Hoc含量呈顯著正相關(guān)（<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.99，Hoc含量與ST、NDF呈顯著正相關(guān)關(guān)系（<0.05）相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.99，與CP、ADL呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.96和0.97。在青貯前期，原料附著乳酸菌利用豐富的WSC作為代謝底物，大量繁殖并產(chǎn)生LA等有機(jī)酸，降低青貯pH值，抑制了植物蛋白酶和梭菌等蛋白分解菌，有效保存了CP組分（圖2 a）。隨著青貯發(fā)酵的正向發(fā)展，青貯過(guò)程蘊(yùn)藏的生化預(yù)處理作用進(jìn)一步促進(jìn)了木質(zhì)纖維組分的優(yōu)化重組，這些變化將對(duì)甜高粱渣的降解性能起到積極促進(jìn)作用[12,41]。

圖5 青貯預(yù)處理過(guò)程中各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.3.5 基于隸屬函數(shù)法的青貯質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)

利用隸屬函數(shù)法對(duì)甜高粱渣的青貯質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其中DM、CP、LA、ST、NDF為正向指標(biāo)，pH值、ADF和AN含量為負(fù)向指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)值越高說(shuō)明質(zhì)量越好。由圖6可知，青貯21 d時(shí)E組的平均隸屬值為0.78，其次是CK組（0.62）、L組（0.56）和LE組（0.39）；在7和14 d時(shí)E組的平均隸屬函數(shù)值也相對(duì)較高。綜合判定，青貯過(guò)程中單獨(dú)添加纖維復(fù)合酶有利于提高甜高粱渣的青貯質(zhì)量。

2.4 青貯預(yù)處理過(guò)程中的細(xì)菌菌群多樣性分析

2.4.1 Alpha 多樣性指數(shù)

青貯過(guò)程中的細(xì)菌菌群變化與發(fā)酵產(chǎn)物的生成以及有機(jī)組分變化息息相關(guān)，特別是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群將直接影響青貯品質(zhì)。覆蓋率數(shù)值反映樣本檢測(cè)質(zhì)量，數(shù)值越高說(shuō)明樣本中物種被測(cè)出的概率越高。試驗(yàn)中，所有青貯樣本Reads范圍60 909～76 467，覆蓋率均大于0.99，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能充分反映細(xì)菌菌群的真實(shí)情況。

注：綜合價(jià)值為各正負(fù)隸屬函數(shù)值和的平均值。

Chao1和ACE指數(shù)表示群落物種的豐富度，其值隨著群落物種豐富度的升高而增大；Shannon指數(shù)表示群落物種的多樣性，其值隨著菌群多樣性的上升而增加[14]。由圖7可知，在青貯7 和14 d時(shí)，CK組和E組的Chao1和ACE指數(shù)與CK組相比無(wú)顯著性差異（>0.05）；青貯21 d時(shí)，3個(gè)添加劑組均顯著低于CK組（<0.05）。就Shannon指數(shù)而言，隨著青貯周期的延長(zhǎng)CK組呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，L組和CK組則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，LE組呈現(xiàn)“上升-下降-上升”趨勢(shì)?？梢?jiàn)，3個(gè)添加劑青貯組中的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性均顯著下降，說(shuō)明添加劑能有效調(diào)控青貯發(fā)酵體系中的細(xì)菌菌群豐富度，通過(guò)有益乳酸菌群的發(fā)酵繁殖降低pH值，抑制梭狀芽胞桿菌等不良微生物繁殖，降低細(xì)菌多樣性，對(duì)獲得良好青貯品質(zhì)起到重要作用。PUNTILLO等[42]發(fā)現(xiàn)在高粱青貯過(guò)程中加入包含植物乳桿菌的復(fù)合乳酸菌劑能顯著降低細(xì)菌種群的豐富度和多樣性。DONG等[12]在甜高粱渣青貯過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似結(jié)果。

總之，相較于CK組而言，添加植物乳桿菌、纖維復(fù)合酶或二者聯(lián)合添加均能有效降低青貯體系中的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性。

a. ACE 指數(shù) a. ACE indexb. Chao1指數(shù) b. Chao1 indexc. Shannon 指數(shù) c. Shannon index

2.4.2 主坐標(biāo)分析

PCA分析是一種探索和可視化細(xì)菌菌群異同性的方法，2個(gè)樣本點(diǎn)之間的距離越近，說(shuō)明細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似度越高[28]。由圖 8所示，新鮮甜高粱渣樣品與青貯樣品之間分離明顯，這與ZHANG等[5]報(bào)道的青貯高粱稈的細(xì)菌聚類(lèi)與原料顯著分離結(jié)果一致。另一方面，隨著青貯時(shí)間的變化，不同添加劑對(duì)細(xì)菌菌群構(gòu)成的影響也存在差異。其中，不同青貯時(shí)期的CK組樣品聚集較為明顯，L組（14和21 d）和LE組（7和14 d）的青貯樣品也存在明顯聚集，E組的青貯樣品則較為分散。青貯21 d時(shí)E組和LE組樣品的細(xì)菌菌群與CK組相近。

注：SSB為甜高粱渣。

2.4.3 門(mén)分類(lèi)水平細(xì)菌群落組成

由圖9a可知，甜高粱渣原料表面附著的門(mén)水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要是變形菌（Proteobacteria，90.87%）和少量厚壁菌（Firmicutes，4.48%）、擬桿菌（Bacteroidetes，1.55%）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria，0.89%）。青貯發(fā)酵后，4個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)菌群落仍以變形菌為主，但厚壁菌相對(duì)豐度有明顯提升，說(shuō)明在厭氧酸性青貯環(huán)境中厚壁菌能快速適應(yīng)并生長(zhǎng)繁殖[5]。其中，L組的厚壁菌相對(duì)豐度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，E組和LE組則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并維持較高水平。說(shuō)明添加纖維復(fù)合酶能形成有利于維持厚壁菌生長(zhǎng)代謝的微生態(tài)環(huán)境[28]。

2.4.4 屬分類(lèi)水平細(xì)菌群落組成

如圖9b所示，甜高粱渣原料表面附著的屬水平細(xì)菌主要有泛菌（，48.72%）、腸桿菌（，37.65%）和少量拉恩氏菌（，3.34%）、葡糖桿菌（，1.44%）、明串珠菌（，1.24%）、乳桿菌（，1.18%）等。DONG等[12]也報(bào)道發(fā)現(xiàn)甜高粱渣原料中的優(yōu)勢(shì)菌群為泛菌（39%）。青貯21 d時(shí)，4個(gè)試驗(yàn)組的乳酸細(xì)菌（以明串珠菌為主）總豐度從原料的2.86%分別升至13.28%（CK組）、11.58%（L組）、12.54%（E組）和13.56%（LE組），但仍未占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。這可能是因?yàn)樵媳砻孀陨砀街娜樗峒?xì)菌較少，且青貯時(shí)間相對(duì)較短，乳酸菌群尚未能充分生長(zhǎng)繁殖。與此同時(shí)，4個(gè)青貯組在21 d時(shí)的泛菌相對(duì)豐度分別降至22.14%（CK組）、21.61%（L組）、19.14%（E組）和24.1%（LE組），這與DONG等[12]的研究結(jié)果類(lèi)似。OGUNADE等[43]認(rèn)為泛菌能抑制梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)，進(jìn)而降低青貯中的氨氮含量，這也可能是4個(gè)試驗(yàn)組中氨氮含量維持在良好閾值范圍的原因之一。

圖9 青貯預(yù)處理過(guò)程中的門(mén)水平和屬水平的細(xì)菌菌群多樣性

就腸桿菌群而言，CK組在青貯21 d時(shí)的相對(duì)豐度降至36.26%，3個(gè)添加劑組則分別升至60.64%（L組）、46.18%（E組）和44.24%（LE組）。DONG等[12]也發(fā)現(xiàn)青貯甜高粱渣的腸桿菌相對(duì)豐度由原料中不足5%增至20%以上。研究表明，腸桿菌群可以在厭氧和弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，并與乳酸細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)發(fā)酵底物，將乳酸和WSC轉(zhuǎn)化為乙酸、琥珀酸、乙醇或2,3-丁二醇，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失[34]。相較于CK組，3個(gè)添加劑組中的腸桿菌相對(duì)豐度均顯著升高，其原因可能是在植物乳桿菌和纖維復(fù)合酶的作用下，體系內(nèi)可利用的WSC含量升高，進(jìn)而促進(jìn)了腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，使其相對(duì)豐度提高。但由于腸桿菌也能代謝產(chǎn)生一定量的有機(jī)酸，故尚未對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)形成不良影響。

2.5 添加劑對(duì)甜高粱渣青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果

由圖10可知，4個(gè)青貯組的甜高粱渣還原糖得率均顯著高于原料（<0.05），酶解糖化72 h的還原糖得率分別比原料提高了116%（CK組）、77%（L組）、117%（E組）和107%（LE組）。其中E組的青貯預(yù)處理效果最好，還原糖得率高達(dá)888.56 mg/g，明顯高于MISHRA等[44]報(bào)道的使用多種真菌混合預(yù)處理甜高粱渣后的還原糖得率750 mg/g，也高于CAO等[45]使用20%的NaOH溶液預(yù)處理甜高粱渣后的還原糖得率696.1 mg/g。說(shuō)明青貯發(fā)酵能有效強(qiáng)化甜高粱渣的生物降解效果，這可能是因?yàn)榍噘A過(guò)程的酸性環(huán)境和有機(jī)酸組分能打破木質(zhì)素和半纖維素的屏障作用，增加纖維素對(duì)水解酶的可及面積，進(jìn)而釋放出較多的可發(fā)酵糖[6]。青貯過(guò)程中微生物菌群的協(xié)同作用也是促進(jìn)木質(zhì)纖維組分降解的原因之一。另一方面，添加纖維復(fù)合酶有助于解聚原先緊密的木質(zhì)纖維抗降解屏障結(jié)構(gòu)，促進(jìn)纖維素和半纖維素分解，進(jìn)而提高纖維素可及面積和降解機(jī)率，使其更容易在糖化過(guò)程中被生物酶作用分解，強(qiáng)化青貯過(guò)程中的預(yù)處理作用，提高甜高粱渣的生物降解性能[46]。

注：CK、L、E和LE為青貯21 d樣品。各組從左至右酶解時(shí)間分別為12、24、36、48、60和72 h。

2.6 不同添加劑強(qiáng)化青貯預(yù)處理的經(jīng)濟(jì)效益分析

由表3可知，甜高粱渣經(jīng)過(guò)青貯預(yù)處理后獲得還原糖的綜合理論經(jīng)濟(jì)收益遠(yuǎn)高于原料（SSB組212元/t），說(shuō)明青貯預(yù)處理能有效提高甜高粱渣的利用效率，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)收益。而且，不同預(yù)處理方式的純收益差異也較為明顯，由高到低順序依次為E組836元/t、CK組818元/t、LE組686元/t和L組575元/t。其中，采用纖維復(fù)合酶進(jìn)行強(qiáng)化青貯預(yù)處理的還原糖收益最高。結(jié)合圖10中的酶解糖化降解效果分析，建議實(shí)際生產(chǎn)中選擇添加纖維復(fù)合酶進(jìn)行青貯預(yù)處理，該方法具有成本收益和技術(shù)高效的雙重優(yōu)勢(shì)。

表3 青貯預(yù)處理前后的經(jīng)濟(jì)收益分析

注：計(jì)算基準(zhǔn)為1 t甜高粱渣原料，還原糖售價(jià)參考99%純度葡萄糖（4 520元/t），總收益=還原糖質(zhì)量×還原糖售價(jià)，單位糖化成本為1 300元/t，糖化成本=干基質(zhì)量×單位糖化成本，總成本=原料成本+青貯成本+糖化成本，純收益=總收益-總成本[20]。

Note: The calculation basis was 1 t of sweet sorghum bagasse. The selling price of reducing sugar was based on 99% pure glucose (4 520 Yuan·t-1). Gross income = reducing sugar mass×reducing sugar price. Unit saccharification cost is 1 300 Yuan·t-1. Saccharification cost = dry base mass × unit saccharification cost. Total cost = SSB cost +ensiling cost+ saccharification cost. Net income= gross income-total cost.

3 結(jié) 論

1）單獨(dú)或復(fù)合添加植物乳桿菌、纖維復(fù)合酶，不僅能有效促進(jìn)青貯預(yù)處理過(guò)程的乳酸發(fā)酵，提高乳酸和乙酸含量，使青貯pH值降至4.2以下，乳酸/乙酸比值>2.0，乳酸占/總有機(jī)酸>0.65，而且有助于保存粗蛋白、可溶性碳水化合物等能量組分，優(yōu)化重組木質(zhì)纖維組分，瓦解生物降解結(jié)構(gòu)屏障，起到一定的青貯預(yù)處理作用。

2）青貯21 d時(shí)，3個(gè)添加劑青貯組的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon數(shù)值均顯著低于CK組（<0.05）。說(shuō)明加入添加劑有利于降低細(xì)菌群落豐富度和多樣性，優(yōu)化青貯微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控青貯發(fā)酵品質(zhì)和預(yù)處理效果。

3）甜高粱渣經(jīng)過(guò)21 d的青貯預(yù)處理作用后，酶解糖化的還原糖得率明顯高于未青貯原料，且3種添加劑的青貯預(yù)處理作用都得到不同程度地強(qiáng)化。尤其添加纖維復(fù)合酶的青貯甜高粱渣的糖化得率高達(dá)888.56 mg/g，青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果最佳。

4）添加纖維復(fù)合酶能明顯降低甜高粱渣青貯預(yù)處理過(guò)程中的干物質(zhì)損耗，強(qiáng)化生物酶解糖化效果。每噸甜高粱渣的可發(fā)酵糖純收益與未青貯原料相比有所提高，也遠(yuǎn)高于其他預(yù)處理添加劑。

綜合青貯發(fā)酵質(zhì)量、酶解糖化結(jié)果和成本收益等分析結(jié)果，推薦選擇纖維復(fù)合酶作為甜高粱渣青貯預(yù)處理過(guò)程的強(qiáng)化劑，這種通過(guò)添加劑來(lái)強(qiáng)化青貯預(yù)處理的策略可以應(yīng)用于甜高粱渣的能源化利用工程實(shí)際中。

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Improvement for the ensiling pretreatment effectiveness of sweet sorghum bagasse by fortified withand cellulolytic enzymes

REN Haiwei1,2,3, SHI Ruifeng1, WEI Huiyuan1, WANG Li1, GUO Xiaopeng1, LU Dong4, LIU Ruiyuan4, LI Jinping2,3※

(1.,,730050,;2.,,730050,;3.-,730050,; 4.,,730050,)

Sweet sorghum bagasse (SSB) is the resultant waste after extraction of sugar-rich juice from the stalks during bioethanol production. As a typical biomass, the SSB consists of moisture, unspent soluble sugar, and abundant lignocellulosic component (cellulose, hemicelluloses and lignin). Theundisposed SSB can inevitably cause the environmental pollution and resource waste. Hence, the effective storage of SSB is necessary for the year-round stable operation of biofuel plants. Among them, ensiling (wet storage) can be an efficient technology available for the SSB preservation and utilization, which enable the SSB to be processed all year around. Moreover, ensiling can also act as a pretreatment strategy, due to the benefits for the cell wall degradation and the improvement of biomass bioconversion for subsequent processing. In this study, the potential of ensiling pretreatment was investigated to fortify withinoculant and cellulolytic enzymes on the improvement of ensiling quality to modulate the performance of enzymatic saccharification of SSB. The SSB were ensiled with no additives (CK),(L), cellulolytic enzyme (E), and a combination of L and E (LE) for 21 days. The dynamic changes of nutrient composition, lignocellulosic components, and ensiling fermentation characteristics were investigated, and then dynamic evolution of the bacterial community structure was analyzed by high-throughput sequencing at HiSeq2500 platform. Ensiling quality was comprehensively evaluated by membership function method, in order to screen the suitable silages additives in consideration of enzymatic hydrolysis performance. The results showed that the addition ofinoculant and cellulolytic enzymes either alone or in combination was facilitated the lactic acid fermentation to reduce the fermentation losses, as evidenced by the higher content of crude protein, starch, neutral detergent fiber, acid detergent fiber, hemicellulose and cellulose components than that of un-ensiled SSB. The content of dry matter, crude protein and water-soluble carbohydrates in silages with additives were higher than those in the CK, but the content of holocellulose lower. Furthermore, the content of dry matter in the E silages, the content of crude protein in the L silages, and the content of water-soluble carbohydrates in the LE silages were the highest in all silages, respectively. The pH value of all silages significantly decreased to below 4.2, accompanied by the ratio of lactic Acid (LA) and total organic acids (TOA) higher than 0.65 and the ratio of lactic acid (LA) and acetic acid (AA) higher than 2 during the whole ensiling for 21 days. The content of LA and AA in the L silages were significantly higher than those of silages at the CK (<0.05), the ratio of LA/TOA and LA/AA in the E silages were significantly higher than those of silages at the CK(<0.05). The membership function analysis indicated that the silages at the E group shared the highest comprehensive scores at 21 days. The bacterial community structure showed that thewas the main bacteria in all silages during ensiling fermentation. At 21 days of ensilage,andwere the main species in the silages at genus level. ACE, Chao1 and Shannon index in the E, L and LE silages were significantly lower than those of CK group (<0.05). It infers that the ensiling pretreatment with the additives was effectively reduced the microbial richness and diversity. Principal Coordinate Analysis (PCA) was constructed using the relative abundance of bacteria at the genus level, indicating the outstanding separation in the SSB before and after ensiling pretreatment. After ensiling pretreatment, the yield of reducing sugar in all SSB silages significantly increased, compared with the un-ensiled SSB. Consequently, the reducing sugar yield in the E silages increased by 117%. The highest net income of E silages fortified with cellulolytic enzyme was almost three-fold that of un-ensiled SSB using cost-benefit analysis. In conclusion, the ensiling pretreatment fortified by cellulolytic enzymes can be expected to serve as a cost-effective, eco-friendly and tech-feasible strategy for the preservation and pretreatment of SSB biomass. Especially, cellulolytic enzyme can be used to modulate the ensiling pretreatment performance. Therefore, the ensiling quality and the biodegradation performance of SSB silage can be effectively improved for the bioenergy utilization of sweet sorghum bagasse.

ensiling； fermentation;; cellulolytic enzyme; sweet sorghum bagasse; microbial community; enzymatic saccharification

10.11975/j.issn.1002-6819.202211017

S21；S126.4

A

1002-6819(2023)-06-0224-13

任海偉，石瑞鋒，魏慧元，等. 菌/酶添加對(duì)甜高粱渣青貯預(yù)處理作用的強(qiáng)化效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2023，39(6)：224-236.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202211017 http://www.tcsae.org

REN Haiwei, SHI Ruifeng, WEI Huiyuan, et al. Improvement for the ensiling pretreatment effectiveness of sweet sorghum bagasse by fortified withand cellulolytic enzymes[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(6): 224-236. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202211017 http://www.tcsae.org

2022-11-02

2022-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（5166010）；甘肅省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（21JR7RA203）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2019T120961）；蘭州理工大學(xué)紅柳杰出青年支持計(jì)劃（JQ2020）；蘭州理工大學(xué)紅柳一流交叉學(xué)科計(jì)劃（0807J1）和甘肅省研究生“創(chuàng)新之星”項(xiàng)目（2023CXZX-500）資助

任海偉，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源轉(zhuǎn)化。Email：rhw52571119@163.com

李金平，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橄冗M(jìn)可再生能源系統(tǒng)。Email：lijinpijng77@163.com

中國(guó)農(nóng)業(yè)工程學(xué)會(huì)高級(jí)會(huì)員: 任海偉（E041200735S）