彭桂鑫 王恩多** 周小龍

（1）中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200031；2）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100864；3）上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210）

轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）是蛋白質(zhì)合成的接頭分子，攜帶對(duì)應(yīng)的氨基酸，在核糖體上其反密碼子與信使RNA（mRNA）上的密碼子精確配對(duì)，按mRNA 的序列合成蛋白質(zhì)，在基因信息傳遞過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1］。tRNA 通常由70~90 個(gè)核苷酸組成，具有三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)和倒L型的三級(jí)結(jié)構(gòu)，包括氨基酸接受莖、二氫尿嘧啶莖/環(huán)（D莖/環(huán)）、反密碼子莖/環(huán)、可變莖/環(huán)、TΨC莖/環(huán)和CCA 3'端［2-3］（圖1）。tRNA 分子上各個(gè)堿基有一套固定的命名規(guī)則，例如，反密碼子統(tǒng)一標(biāo)注為34-35-36 位，CCA 末端統(tǒng)一標(biāo)注為74-75-76 位。tRNA 的成熟過程包括一系列的轉(zhuǎn)錄后加工，并且在核苷酸上添加多種化學(xué)修飾。截至目前，RNA上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約150 種修飾，其中tRNA 修飾占約80%［4］。這些tRNA修飾大多位于D莖/環(huán)、反密碼子莖/環(huán)、可變莖/環(huán)和TΨC 莖/環(huán)，各自具有不同的作用。其中位于D 莖/環(huán)、可變莖/環(huán)和TΨC 莖/環(huán)的修飾，可以穩(wěn)定tRNA 結(jié)構(gòu)和促進(jìn)正確折疊，并增強(qiáng)tRNA與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。位于反密碼子莖/環(huán)上的修飾最多，大多數(shù)集中在34 和37位，其中擺動(dòng)（Wobble）位34 位的修飾在穩(wěn)定密碼子和反密碼子的配對(duì)、擴(kuò)展tRNA 的解碼能力、確保蛋白質(zhì)合成的精確性方面起著關(guān)鍵作用［5-6］，37位的修飾具有增強(qiáng)堿基堆疊和防止U33∶A37的環(huán)內(nèi)堿基配對(duì)的作用，以提高翻譯的保真性［7-8］，維持tRNA反密碼子莖和環(huán)結(jié)構(gòu)［9］。

線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞提供能量［10］。線粒體有自己獨(dú)立的基因組。哺乳動(dòng)物的線粒體DNA（mtDNA）有37 個(gè)基因，編碼2 種核糖體RNA（rRNA）和22 種tRNA，用于解碼mtDNA編碼的11種mRNA，產(chǎn)生13種負(fù)責(zé)呼吸鏈復(fù)合物功能和組裝的蛋白質(zhì)亞基［11］。哺乳動(dòng)物線粒體的解碼系統(tǒng)有別于經(jīng)典的遺傳學(xué)密碼，AUA密碼子編碼甲硫氨酸（Met），UGA 密碼子編碼色氨酸（Trp），AGA和AGG是終止密碼子［12］。線粒體蛋白質(zhì)合成是線粒體中最重要的生命活動(dòng)之一，調(diào)控氧化磷酸化和呼吸鏈復(fù)合物活性，影響細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)。

Fig. 1 Secondary and tertiary structures of canonical tRNA圖1 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

已經(jīng)報(bào)道人類22種mt-tRNA的137個(gè)位點(diǎn)存在18 種tRNA 修飾，牛mt-tRNA 的118 個(gè)位點(diǎn)存在15種tRNA 修飾［13-14］。雖然mt-tRNA 存在諸多修飾，但只有2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲?；佘眨?-methylthio-N6-isopentenyl adenosine， ms2i6A）、5-甲酰胞苷（5-formylcytidine，f5C）、5-牛磺酸甲基-2-硫 尿 苷 （5-taurinomethyl-2-thiouridine，τm5s2U）和5-?；撬峒谆蜍眨é觤5U）4 種修飾特異地存在于mt-tRNA 上。τm5U 和τm5s2U 修飾（統(tǒng)稱為?；撬嵝揎棧┌l(fā)生在mt-tRNA 的U34 位（圖2），其中τm5U 在亮氨酸t(yī)RNA UUR（mt-tRNALeu（UUR））和色氨酸t(yī)RNA（mt-tRNATrp），τm5s2U在賴 氨 酸t(yī)RNA （mt-tRNALys）、 谷 氨 酸t(yī)RNA（mt-tRNAGlu）和谷氨酰胺tRNA （mt-tRNAGln）（表1）［13，15］。這兩種修飾在21 世紀(jì)初通過質(zhì)譜法已經(jīng)被鑒定［16-17］。有趣的是，真海鞘mt-tRNAMet（AUR）和mt-tRNAGly（AGR）（R 為嘌呤核苷酸A或G） 上也發(fā)現(xiàn)了τm5U 修飾［18］，而長槍烏賊mt-tRNALeu（UUR）存在τm5s2U 修飾（表1）［19］。在細(xì)菌和酵母中，具有與哺乳動(dòng)物τm5U和τm5s2U高度相似的修飾，分別稱為5-羧甲基氨甲基尿苷（5-carboxymethylaminomethyluridine，cmnm5U） 和5-羧甲基氨甲基2-硫尿苷（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine， cmnm5s2U）修飾［20］（圖2）。

Fig. 2 The biosynthesis of τm5（s2）U and cmnm5（s2）U圖2 τm5（s2）U和cmnm5（s2）U的生物合成過程

Table 1 Taurine modifications and its similar modifications表1 ?；撬嵝揎椉捌漕愃菩揎?/p>

研究表明，?；撬嵝揎椌哂兄匾纳飳W(xué)意義，并且與線粒體疾病的發(fā)生密切相關(guān)。τm5U 和τm5s2U 修飾可以促進(jìn)對(duì)NNR （N 為4 種核苷酸U、C、A或G；R為嘌呤核苷酸A或G）密碼子的精確解碼，防止NNY（Y為嘧啶核苷酸U或C）密碼子的錯(cuò)誤識(shí)別。mt-tRNALeu（UUR）上的A3243G 突變導(dǎo)致τm5U 修飾缺乏，引起線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作（mitochondial encephalomyopathy with lactic acidosis and strokelike episode，MELAS）［21-22］（圖3）；類似的情況是，mt-tRNALys上的A8344G 突變導(dǎo)致τm5s2U 修飾缺乏，引起肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維綜合征（myoclonic epilepsy associated with ragged red fiber，MERRF）［16，23］（圖3）。雖然上述疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多年，但是潛在的致病分子機(jī)制依然未知。研究?；撬嵝揎椉捌湫揎椕福兄诟玫乩斫馄渖飳W(xué)功能，為后續(xù)闡述?；撬嵝揎椚毕輰?dǎo)致相關(guān)疾病的潛在機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

Fig. 3 Pathogenic point mutations associated with MELAS and MERRF on human mitochondrial tRNAs圖3 人mt-tRNA上與MELAS和MERRF相關(guān)的致病點(diǎn)突變

1 ?；撬嵝揎椉捌漕愃菩问叫揎?/h2>

1.1 τm5U

2002 年，日本學(xué)者Kimitsuna Watanabe 發(fā)現(xiàn)了牛mt-tRNA 的τm5U 修飾，揭示牛磺酸（taurine）作為生物大分子參與τm5基團(tuán)的形成（圖2）。哺乳動(dòng)物中，GTP 結(jié)合蛋白質(zhì)3（GTP binding protein 3， GTPBP3） 和線粒體翻譯優(yōu)化蛋白1（mitochondrial tRNA translation optimization 1，MTO1）高度保守并催化τm5U 的修飾。在細(xì)菌和酵母中同源蛋白質(zhì)分別是MnmE 和MSS1（對(duì)應(yīng)GTPBP3）、MnmG 和MTO1（對(duì)應(yīng)MTO1）［24-26］。在哺乳動(dòng)物線粒體中，GTPBP3和MTO1形成復(fù)合物，利用牛磺酸、5,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-CH2-THF）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、鳥苷三磷酸（GTP）作為反應(yīng)底物和其他輔因子共同催化τm5U修飾［15］（圖2）。在這個(gè)過程中，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（serine hydroxymethyltransferase，SHMT2）首先將絲氨酸（serine）轉(zhuǎn)化成甘氨酸（glycine），然后絲氨酸的β-C 轉(zhuǎn)移至四氫葉酸THF，以此合成5,10-CH2-THF［27］，然后5,10-CH2-THF 在反應(yīng)中為τm5U第5位的甲基提供1C來源。雖然催化τm5U修飾的底物及修飾酶已經(jīng)明確，但是具體的生物合成過程以及催化步驟依然不清楚，且體外重組τm5U 修飾效率極低（3.3%）。有趣的是，大腸桿菌MnmE 和MnmG可以利用?；撬岷推渌牡孜?，在體外有限地合成τm5U［15］，暗示隨著線粒體不斷進(jìn)化，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物逐漸能夠特異性識(shí)別?；撬?。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞時(shí)去掉培養(yǎng)基中的?；撬?，τm5U 修飾的豐度會(huì)急劇下降，隨后添加高濃度的?；撬幔觤5U 修飾的豐度有一定程度的恢復(fù)［15］，這說明細(xì)胞內(nèi)的牛磺酸濃度可以動(dòng)態(tài)調(diào)控體內(nèi)τm5U 修飾的豐度。在貓和比目魚的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也觀察到類似的結(jié)果，進(jìn)一步證明從細(xì)胞外攝入的?；撬峥梢宰?duì)觤5U修飾維持在較高的豐度，揭示了牛磺酸在生理上的重要性。τm5U 修飾調(diào)控核糖體A位點(diǎn)密碼子和反密碼子的配對(duì)，通過穩(wěn)定U∶G 的擺動(dòng)配對(duì)，促進(jìn)對(duì)UUG 密碼子的有效解碼［21，28］。

1.2 τm5s2U

τm5s2U 是在τm5U 的基礎(chǔ)上，34 位核苷酸尿嘧啶的第二位氧被硫取代而成（圖2）。τm5s2U的τm5和s2修飾是相互獨(dú)立的，沒有修飾的先后之分。線粒體tRNA 特異性2-硫代尿苷酶1（mitochondrial tRNA-specific 2-thiouridylase 1，MTU1）特異性催化mt-tRNA 的s2修飾［29］，其在細(xì)菌和酵母中的同源蛋白質(zhì)分別是MnmA 和MTU1；細(xì)胞質(zhì)tRNA 的s2修飾由Urm1/Uba4/NCS2/NCS6/TUM1 催化［30-31］，但是這些過程的具體底物和反應(yīng)步驟尚不清楚。在酵 母 中， 敲 除MTU1會(huì) 引 起mt-tRNALys、mt-tRNAGlu、mt-tRNAGln的s2修飾缺陷以及這些tRNA 穩(wěn)態(tài)水平降低，進(jìn)而影響線粒體翻譯和酵母生長［29，32］。人MTU1基因突變會(huì)引起可逆性嬰兒肝衰竭（reversible infantile liver failure，RILF），導(dǎo)致mt-tRNA 的s2修飾水平顯著降低［33-34］。MTU1純合敲除小鼠在胚胎發(fā)育的第8 天前后就會(huì)死亡。另外，特異性敲除MTU1小鼠，其肝細(xì)胞線粒體翻譯和呼吸鏈復(fù)合物活性受到嚴(yán)重?fù)p傷［35］，證明s2修飾缺失導(dǎo)致的線粒體功能障礙是引起RILF 的主要原因。

1.3 cmnm5U和cmnm5s2U

1981 年，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）tRNALys反密碼子環(huán)的34 位上發(fā)現(xiàn)了cmnm5U 和cmnm5s2U修飾（圖2）［36］，這兩種修飾廣泛存在于各類細(xì)菌、酵母和古菌中。cmnm5U修飾存在于細(xì)菌tRNALeu（UAA）、tRNAArg（UCU） 和tRNAGly（UCC）（表1）；cmnm5s2U修飾存在于細(xì)菌 tRNALys（UUU）、 tRNAGlu（UUC）、tRNAGln（UUG），酵母mt-tRNALys、mt-tRNAGlu和mt-tRNAGln，以及古菌甲 烷 球 菌（Methanococcus maripaludis） tRNALys（UUU）（表1）［20，37-39］。對(duì)古菌和酵母細(xì)胞質(zhì)的tRNA 修飾圖譜了解不多，它們的其他tRNA 上或許也存在cmnm5U 修飾。cmnm5U 相較于τm5U，甘氨酸參與cmnm5基團(tuán)的形成，而不是?；撬幔▓D2）。在大腸桿菌中，MnmE和MnmG形成α2β2異源四聚體復(fù)合物，利用與τm5U 修飾反應(yīng)過程中相似的底物和輔因子，催化cmnm5U 形成［20，40］（圖2）。在大腸桿菌中，MnmA、IscS和TusA-E共同負(fù)責(zé)cmnm5s2U中s2修飾的生成［41-42］；在酵母中，MTU1 催化cmnm5s2U 中s2修飾的生成［29］。然而，MnmE/MnmG 復(fù)合物和MnmA 在催化過程中發(fā)揮的作用，以及反應(yīng)過程中的關(guān)鍵步驟還不清楚。此外，MnmE 和MnmG 是某些人類病原體毒性的重要調(diào)控元件［43-44］，暗示cmnm5U修飾對(duì)它們的生存至關(guān)重要。有趣的是，當(dāng)培養(yǎng)基不含?；撬崤囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí)，cmnm5U 出現(xiàn)在人mt-tRNALeu（UUR） 和mt-tRNATrp上，cmnm5s2U出現(xiàn)在人mt-tRNAGlu和mt-tRNAGln上，后續(xù)回補(bǔ)?；撬幔琧mnm5U 和cmnm5s2U則完全檢測不到，而τm5U和τm5s2U的豐度會(huì)逐漸增加［15］，表明在?；撬崛狈Φ沫h(huán)境下，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物會(huì)利用甘氨酸合成微量的cmnm5U。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，cmnm5U 和cmnm5s2U分別天然存在于人mt-tRNATrp和mt-tRNAGln上（表1）［14］。從某種程度上說，cmnm5U和cmnm5s2U修飾是哺乳動(dòng)物線粒體翻譯的一個(gè)替代修飾，但是哺乳動(dòng)物mt-tRNA 中cmnm5U 和cmnm5s2U 修飾的生物學(xué)功能和意義尚不清楚，猜測可能與τm5U、τm5s2U功能類似。

2 τm5U修飾酶與線粒體疾病

2.1 GTPBP3

2.1.1人類GTPBP3（hGTPBP3）的GTPase活性根據(jù)序列比對(duì)和海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）MnmE 的 結(jié) 構(gòu)，hGTPBP3 有3 個(gè) 結(jié) 構(gòu)域，分別是N 端結(jié)構(gòu)域、G 結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域。其中，N 端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與5,10-CH2-THF 結(jié)合以及蛋白質(zhì)二聚化；G 結(jié)構(gòu)域有G1、G2、G3 和G4 四個(gè)基序，能夠結(jié)合和水解GTP，行使催化功能。最近本課題組［45］鑒定了hGTPBP3的成熟形式，確定其進(jìn)入線粒體的信號(hào)肽序列為N 端前20 個(gè)氨基酸殘基，揭示hGTPBP3 是一個(gè)有活力的GTPase，確定其以同源二聚體的形式行使GTP 水解功能。大腸桿菌MnmE 的G 結(jié)構(gòu)域擁有和全長MnmE 一樣高的GTPase 活力［46］，然而hGTPBP3 的G 結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出極低的GTPase 活力。研究表明，失去GTP 水解功能的MnmE 突變體無法對(duì)體內(nèi)的tRNA進(jìn)行修飾，證明MnmE 的GTPase 活力對(duì)cmnm5U的形成是必要的［20］。在MSS1基因敲除的酵母中回補(bǔ)hGTPBP3，可以拯救酵母生長［47］，回補(bǔ)GTPase活力缺陷的hGTPBP3突變體卻無法拯救酵母生長，表明hGTPBP3的GTP水解能力對(duì)τm5U修飾的功能很重要。

2.1.2hGTPBP3基因突變與線粒體疾病

全外顯子組測序鑒定到hGTPBP3基因上存在純合或者復(fù)合雜合的單點(diǎn)突變、雙點(diǎn)突變或者刪除突變，這些突變會(huì)引起線粒體缺陷相關(guān)疾病，病人表現(xiàn)為肥厚性心肌病、乳酸血癥及腦?。?3］，但是潛在的致病分子機(jī)制未知。大部分的突變是錯(cuò)義單點(diǎn)突變，遍布hGTPBP3 的N 端到C 端，以G 結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域最為集中。研究發(fā)現(xiàn)，在hGTPBP3 致病突變細(xì)胞系中，線粒體翻譯和氧氣消耗能力受損進(jìn)而造成線粒體功能障礙［48］。本課題組［45］的研究結(jié)果顯示，一些hGTPBP3致病突變體的體外GTPase活力和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平顯著降低，而這些不穩(wěn)定的突變體通過泛素-蛋白酶體途徑降解。該研究還揭示hGTPBP3 的R3L 突變會(huì)影響其線粒體定位，E142-R136 和E159-R431 的相互作用對(duì)于維持hGTPBP3 結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要，而hGTPBP3-E142K和hGTPBP3-E159V的突變破壞了這種相互作用，可能是引發(fā)疾病的主要原因［45］。盡管hGTPBP3基因上一系列致病點(diǎn)突變導(dǎo)致線粒體疾病的生化與細(xì)胞基礎(chǔ)已經(jīng)建立，但是這些突變是否影響τm5U修飾尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。在HEK293T中敲除hGTPBP3會(huì)導(dǎo)致τm5U修飾缺陷，線粒體翻譯受損以及氧化磷酸化效率降低［15］。令人意外的是，gtpbp3敲除的斑馬魚卻表現(xiàn)出mt-tRNA氨基酰化效率總體升高，而這種mt-tRNA 的異常代謝，顯著減少了ATP 的生成，造成氧化磷酸化失衡，最終可能導(dǎo)致心臟發(fā)育缺陷［49］。

2.1.3hGTPBP3的新蛋白質(zhì)同源異構(gòu)體

NCBI 和UniProt 數(shù)據(jù)庫顯示hGTPBP3 有4 個(gè)同源異構(gòu)體，其中前3個(gè)同源異構(gòu)體在N端有一段進(jìn)入線粒體的信號(hào)肽，而第4 個(gè)hGTPBP3 同源異構(gòu)體7（hGTPBP3-Iso7）的N 端則完全與它們不同。本課題組［45］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的hGTPBP3-Iso7，與數(shù)據(jù)庫的相比，它僅少了1個(gè)外顯子，其他序列都一致，并且確定它在人的諸多細(xì)胞系里都存在。有趣的是，該hGTPBP3-Iso7 以同源二聚體的形式在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在，說明它并不參與τm5U 的生成，暗示其有未知的新功能，有可能在信號(hào)通路中起GTP水解的作用。

2.2 MTO1

人類MTO1（hMTO1）是高度保守的mt-tRNA修飾酶，根據(jù)超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）MnmG的晶體結(jié)構(gòu)［50］，hMTO1 可能在修飾τm5U 過程中結(jié)合FAD，負(fù)責(zé)與tRNA結(jié)合，但這些都需要進(jìn)一步驗(yàn)證。在酵母中敲除MTO1基因，會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸和翻譯受損，而回補(bǔ)hMTO1，可以拯救酵母生長［26］，表明hMTO1 可以代償酵母MTO1 的功能。hMTO1基因突變會(huì)引起多種病變，包括視神經(jīng)病變、認(rèn)知障礙、乳酸中毒和肥厚型心肌病［51-52］。很多病人會(huì)在出生后第1 年表現(xiàn)出癥狀，而有些病人則在出生后不久由于急性心臟功能障礙而死亡。這些致病性突變大部分是錯(cuò)義單點(diǎn)突變，遍布hMTO1 的N 端到C 端，在人類基因組數(shù)據(jù)庫中罕見。在hMTO1基因突變病人的成纖維細(xì)胞中，呼吸鏈復(fù)合物I和IV活力下降，線粒體翻譯受到抑制以及線粒體內(nèi)蛋白酶激活［52］。小鼠細(xì)胞敲除Mto1，導(dǎo)致τm5U 修飾完全消失，嚴(yán)重影響氧化磷酸化復(fù)合物II 的組裝及其穩(wěn)定性［15，52］，同時(shí)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)以及出現(xiàn)線粒體非折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt）［53］。純合Mto1敲除的小鼠由于線粒體翻譯的嚴(yán)重?fù)p傷會(huì)在胚胎發(fā)育早期死亡，心臟特異性敲除的Mto1新生小鼠會(huì)在24 h內(nèi)死亡［53］，證明τm5U修飾對(duì)動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要。

2.3 MELAS和MERRF

核基因和線粒體基因組的基因突變都可以導(dǎo)致線粒體功能障礙和代謝紊亂，造成人類疾?。ㄖ饕X病、肌病、腦肌?。y(tǒng)稱為線粒體疾?。?2］。已發(fā)現(xiàn)約400種基因突變導(dǎo)致的線粒體病，而 超 過200 種 定位 于22 種mt-tRNA 基 因中［54-55］。這些致病突變的致病機(jī)理不盡相同，包括影響tRNA 三級(jí)結(jié)構(gòu)、tRNA 修飾、tRNA 氨基?；?、核糖體解碼等多方面［56］。MELAS 和MERRF 是研究比較多的線粒體疾病。大約80%的MELAS病人攜帶mtDNA 上A3243G 的突變，導(dǎo)致mt-tRNALeu（UUR） 上的τm5U 缺失（圖3）。研究表明，mt-tRNALeu（UUR）因缺乏τm5U 修飾，無法解碼UUG密碼子，導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物I和IV活力下降，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能障礙［21］。在A8344G突變導(dǎo)致MERRF的患者中，mt-tRNALys缺 乏τm5s2U 修 飾（圖3），無法解碼AAA 和AAG 密碼子，造成線粒體翻譯缺陷和呼吸鏈復(fù)合物活性下降［21］。目前認(rèn)為s2修飾在MERRF 患者中對(duì)解碼效率起著關(guān)鍵作用，但是具體的分子機(jī)制有待研究。雖然A3243G（D 環(huán)）和A8344G（TΨC 環(huán)）位于不同tRNA基因的不同位置，但它們對(duì)tRNA的影響相似，充分說明了?；撬嵝揎棇?duì)于維持正常生命活動(dòng)的重要性。

3 治療?；撬嵝揎椚毕輰?dǎo)致線粒體疾病的潛在方法

MELAS 和MERRF 是比較嚴(yán)重且典型的線粒體疾病，潛在的分子致病機(jī)制依然不完全清楚。迄今為止，線粒體疾病尚無有效藥物，僅有一些候選藥物可以潛在地減輕由?；撬嵝揎椚毕菀鸬木€粒體功能障礙。針對(duì)MELAS病人，?；撬崾悄壳白钚卵邪l(fā)的藥物。補(bǔ)充高濃度的?；撬幔梢蕴岣擀觤5U修飾的豐度［57］。臨床試驗(yàn)表明，口服?；撬釙?huì)提高τm5U修飾的豐度［58］。另一種藥物為?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA），它是一種?；撬崤悸?lián)的膽酸，可以作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊和預(yù)防蛋白質(zhì)的聚集［59］。研究表明，用TUDCA 處理小鼠Mto1敲除的細(xì)胞，會(huì)阻礙錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集，進(jìn)而抑制UPR 的細(xì)胞毒性和提高呼吸鏈復(fù)合物的活性［53］。在人體中已經(jīng)證明了TUDCA的安全性，同時(shí)該藥物在神經(jīng)疾病的臨床試驗(yàn)中也取得了不錯(cuò)的效果［60］。

除了藥物治療，遺傳學(xué)方法清除mtDNA 突變?nèi)諠u成為主流?；诙ㄎ挥诰€粒體的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）基因編輯技術(shù)可以靶向mtDNA［61］。研究發(fā)現(xiàn)，TALEN可以特異性地結(jié)合和切割帶有致病突變的mtDNA［62］，造成DNA 雙鏈斷裂。由于mtDNA的修復(fù)不像細(xì)胞核DNA那樣高效，雙鏈造成的斷裂會(huì)消除整個(gè)突變的DNA［63］。從理論上講，若TALEN可以應(yīng)用到人類卵母細(xì)胞，將可能預(yù)防線粒體疾病傳播到子代?？紤]到安全性，應(yīng)嚴(yán)格檢測TALEN在其他mtDNA區(qū)域的脫靶效應(yīng)。

傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)需要將RNA 引入線粒體，一直被認(rèn)為不適合治療線粒體疾病。最近新研發(fā)的單堿基編輯工具DddAderived cytosine base editor（DdCBE）可以在不產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂的情況下對(duì)mtDNA 進(jìn)行精確編輯。具體來說，介導(dǎo)雙鏈DNA 胞苷脫氨基化的細(xì)菌毒素DddA，它可以把胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。將DddA 與TALEN 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合，構(gòu)建出RNA 非依賴的胞嘧啶堿基編輯器DdCBE，催化mtDNA 中C·G 到T·A 的高效特異性轉(zhuǎn)化［64-65］。DdCBE 不僅在人細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)線粒體的成功編輯，更在人類早期胚胎中實(shí)現(xiàn)了高效的線粒體堿基編輯［66-67］。不過，DdCBE 依然有幾方面的缺陷：a. DddA 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒；b. 尿嘧啶很容易從DNA 上切下來；c. 有非常嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)?？偟膩碚f，DdCBE 為線粒體疾病的機(jī)制研究和治療提供了十分有效的工具，是線粒體研究里程碑式的突破，不過后續(xù)需要繼續(xù)優(yōu)化，盡量減輕其副作用帶來的影響。此外，最近的研究提示，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)也可以在線粒體中發(fā)揮作用，但是其編輯效率尚需進(jìn)一步優(yōu)化［68］。

4 總結(jié)與展望

tRNA 作為接頭分子，精確解碼mRNA 的密碼子，為蛋白質(zhì)的生物合成提供原料。約10%~20%的 tRNA 堿基或核糖攜帶修飾，而大量的tRNA 修飾都集中在反密碼子環(huán)的擺動(dòng)位34，保證翻譯精確性。至今為止，已經(jīng)鑒定超過30 種擺動(dòng)位的修飾，它們調(diào)控tRNA解碼能力。哺乳動(dòng)物線粒體的tRNA修飾圖譜已經(jīng)建立，而目前只發(fā)現(xiàn)了39種細(xì)胞質(zhì)tRNA修飾［69］。相比于高等真核生物，大腸桿菌tRNA有31種修飾，以及釀酒酵母tRNA有26種修飾已經(jīng)被鑒定，兩者tRNA修飾的功能得到了廣泛的研究［4］。此外，tRNA的修飾酶和催化機(jī)制還有諸多未知，這些修飾酶的功能也需進(jìn)一步探索。

有研究認(rèn)為，在MELAS或者M(jìn)ERRF病人中，GTPBP3/MTO1 復(fù)合物無法識(shí)別突變的tRNA，進(jìn)而導(dǎo)致?；撬嵝揎椚毕?。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口服?；撬釙?huì)輕微提高mt-tRNALeu（UUR）上τm5U 修飾的豐度，有效減少病人中風(fēng)的再次發(fā)生［58］。tRNA修飾為動(dòng)態(tài)調(diào)控，tRNA 修飾豐度會(huì)隨細(xì)胞環(huán)境的變化而變化。最近興起的基因編輯技術(shù)有望從基因水平治療疾病，但其效率、編輯種類、脫靶效應(yīng)、安全性等都需要進(jìn)一步優(yōu)化。

本課題組［45］的研究表明，不穩(wěn)定的hGTPBP3致病突變體，在人細(xì)胞中通過泛素-蛋白酶體途徑降解，而在酵母中能夠穩(wěn)定存在，這可能是由于酵母缺乏相應(yīng)的E3 連接酶所致。未來需進(jìn)一步尋找hGTPBP3 的E3 連接酶，通過添加小分子抑制劑，抑制E3連接酶活性，RNA干擾或蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)下調(diào)E3 連接酶蛋白質(zhì)含量等手段，讓不穩(wěn)定的hGTPBP3 致病突變體在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，或許可以緩解hGTPBP3基因突變?cè)斐傻木€粒體疾病。

雖然體外重組τm5U 修飾已經(jīng)成功，但是重組效率太低。需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，如純化出高純度的酶，以及添加合適的輔因子，來提升τm5U 修飾重組的效率。深入研究高等真核生物的GTPBP3和MTO1，有利于加深對(duì)τm5U修飾生物合成途徑和生物學(xué)功能的理解，為揭示tRNA基因突變導(dǎo)致MELAS的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。