曾濤玲 王洪睿

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361102）

謹(jǐn)以此文獻(xiàn)給鄒承魯先生百年誕辰，先生一生致力于科學(xué)研究，治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，堅持真理，展示了一代學(xué)術(shù)大師的領(lǐng)袖風(fēng)范，實為我等后輩之楷模。

Rho 家族小G 蛋白屬于Ras 超家族小GTP 酶，在細(xì)胞骨架重組、基因表達(dá)及細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要的開關(guān)作用［1-2］。目前已知Rho家族有20多個成員，其中RhoA、Rac1 和Cdc42 的研究最為廣泛和深入，特別是關(guān)于它們在細(xì)胞骨架、細(xì)胞極性以及細(xì)胞運動方面所起的關(guān)鍵調(diào)控作用方面的研究［3］。RhoA、RhoB 和RhoC 同屬Rho 亞家族，然而，盡管它們都參與了細(xì)胞骨架的動態(tài)調(diào)控過程，它們的細(xì)胞生物學(xué)功能和特性卻不盡相同，在包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用也有很大的不同［4］。近年來，關(guān)于RhoB的功能及其在疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用的研究也受到越來越多的關(guān)注。

與RhoA 促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用不同，過表達(dá)RhoB 的細(xì)胞生長更為緩慢，并易于發(fā)生凋亡。敲低內(nèi)源的RhoB后，癌細(xì)胞對抗癌藥物表現(xiàn)出不敏感性，凋亡比例明顯下降，并且小鼠腹腔注射RhoB-/-腫瘤細(xì)胞的成瘤效率明顯高于RhoB+/+細(xì)胞［5-6］。此外，在化學(xué)誘變劑處理的情況下，RhoB敲除型小鼠的皮膚癌癥發(fā)病率要明顯高于野生型小鼠［7］。同時，臨床樣本也顯示，隨著肺癌和頭頸癌等惡性程度的增加，RhoB 的蛋白質(zhì)水平呈逐漸下降的趨勢［8-9］，這些研究結(jié)果表明RhoB 是個重要的抑癌因子［10-12］。然而，隨著對RhoB研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，在一些類型的腫瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌中，RhoB 很可能起著促進(jìn)腫瘤生長的作用［13］。RhoB在不同類型的腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有不同作用的分子機制尚有待進(jìn)一步的深入研究，然而目前對RhoB調(diào)控的研究大都停留在其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控上，關(guān)于RhoB蛋白的翻譯后修飾，特別是除了脂化修飾以外的其他翻譯后修飾對其功能影響的研究仍然十分缺乏。

1 RhoB的脂化修飾

RhoA、RhoB 和RhoC 具有很高的同源性（~85%），與RhoA 和RhoC 的氨基酸序列相比，RhoB 最大的不同是其C 端的氨基酸序列。除了C端保守的CAAX 序列（其中C=Cys，A=aliphatic（脂肪族氨基酸），X=any amino acid（任意氨基酸））中的半胱氨酸殘基（Cys）可以被脂化修飾，相比于RhoA 和RhoC，RhoB 的C 端還有另外兩個半胱氨酸殘基（Cys189 和Cys192）也可以被脂化修飾。RhoA 和RhoC 的CAAX 序列中的半胱氨酸殘基只可以被香葉酰香葉酰化（geranylgeranyl）修飾，而RhoB 的CAAX 序列中的半胱氨酸殘基既可以被香葉酰香葉酰化修飾，也可以被法尼基（farnesyl）修飾。此外，RhoB 的Cys189 和Cys192 還可以被棕櫚?；╬almitoyl）修飾［4］（圖1）。

Fig. 1 Domain organization of Rho GTPases圖1 Rho家族蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖

RhoB的C端脂化修飾的可變性使得RhoB在細(xì)胞內(nèi)的定位與RhoA 和RhoC 有著很大的區(qū)別。RhoA 和RhoC 主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，而RhoB 分布于細(xì)胞膜、內(nèi)體（endosome）、多泡體（multivesicular body，MVB）以及細(xì)胞核上，并因此導(dǎo)致了其細(xì)胞和生理功能上的特異性［4，14-17］。內(nèi)體和多泡體是細(xì)胞囊泡運輸（endosome trafficking）的樞紐環(huán)節(jié)，有研究報道RhoB參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的囊泡運輸，在原癌基因酪氨酸蛋白激酶src（SRC）、蛋白激酶B（AKT）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的運輸囊泡運送到到細(xì)胞膜與之融合的過程中起著重要的調(diào)控作用［18-22］。有趣的是，人們發(fā)現(xiàn)用來靶向Ras蛋白的法尼基化修飾的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TIs）能夠顯著抑制RhoB 的法尼基化修飾，進(jìn)而導(dǎo)致RhoB 的香葉酰香葉?；揎椝缴险{(diào)［15］，并且RhoB香葉酰香葉?；揎椝降纳险{(diào)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長抑制和凋亡［15-16，23-24］。目前法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在臨床上并未取得預(yù)期效果的原因有很多，其中RhoB作為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的一個關(guān)鍵靶點，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機制有待更進(jìn)一步的深入研究和闡明，以期能夠推動法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在腫瘤臨床治療上的應(yīng)用。

2 RhoB的磷酸化修飾

雖然磷酸化修飾是細(xì)胞和機體內(nèi)蛋白質(zhì)分子最為普遍的翻譯后修飾方式，但相對于脂化修飾，Rho家族蛋白磷酸化修飾的研究卻非常有限，目前關(guān)于RhoB磷酸化修飾的研究也僅有少數(shù)幾篇文章報道。Tillement等［25］報道了酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）可以特異性地磷酸化RhoB 的185位絲氨酸殘基（Ser185）而不能磷酸化修飾RhoA和RhoC。抑制CK1 介導(dǎo)的RhoB Ser185 的磷酸化修飾會導(dǎo)致RhoB活性水平上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞骨架微絲的形成并抑制EGFR 的內(nèi)吞降解。因此，RhoB 的Ser185 的磷酸化修飾在抑制RhoB 的活性上可能起著重要的作用。另外，Ballif等［26］通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法鑒定出了RhoB的另一個磷酸化位點，154位的酪氨酸殘基（Tyr154），但是該位點磷酸化的生物學(xué)功能及介導(dǎo)該位點磷酸化的上游激酶都不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在單鏈DNA 損傷的情況下，激活的Chk1 激酶會磷酸化RhoB 的173 和175位的蘇氨酸殘基（Thr173 和Thr175），而Thr173和Thr175的磷酸化修飾會促進(jìn)RhoB從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中與催化SUMO 化修飾的SUMO E3 連接酶PIAS1（protein inhibitor of activated STAT1）結(jié)合進(jìn)而被進(jìn)一步SUMO化修飾。阻斷RhoB的Thr173和Thr175的磷酸化修飾會抑制單鏈DNA 損傷誘導(dǎo)的RhoB 從細(xì)胞質(zhì)膜上的解離，而將Thr173 和Thr175 突變成谷氨酸（Glu）模擬Thr173和Thr175的磷酸化修飾則會使RhoB 在細(xì)胞未受DNA 損傷的情況下就從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，充分說明Thr173和Thr175的磷酸化修飾在調(diào)控RhoB與細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)合中起著重要的作用［27］。

3 RhoB的泛素化修飾

與經(jīng)典的Ras超家族蛋白質(zhì)分子的活性調(diào)控方式一樣，RhoA、RhoB 和RhoC 的活性主要也是通過與GTP 或GDP 的結(jié)合來調(diào)控的［28］。但是，與RhoA 和RhoC 在細(xì)胞中屬于組成性表達(dá)不同，RhoB 的表達(dá)屬于誘導(dǎo)性表達(dá)，紫外線照射、抗癌藥物處理、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）以及血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等處理均可使RhoB的表達(dá)水平快速上調(diào)［5，29-31］。相應(yīng)地，RhoB 的mRNA 和蛋白質(zhì)的半衰期都非常短，分別只有20 min 和2.5 h，而RhoA 和RhoC 相對則要穩(wěn)定得多，RhoB因此被認(rèn)為是一個短壽蛋白［32］。

細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平的經(jīng)典途徑是泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白酶體或溶酶體的降解途徑。蛋白質(zhì)的泛素化修飾是通過一系列的酶促反應(yīng)來實現(xiàn)的。泛素蛋白經(jīng)過泛素活化酶（E1）的活化后，被轉(zhuǎn)移到泛素綴合酶（E2）上，再通過泛素連接酶（E3）共價連接到特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)上［33］。在人類細(xì)胞中，目前發(fā)現(xiàn)有2種E1、40種E2以及600多種E3。每一種E3 可以識別一定的目標(biāo)蛋白質(zhì)底物，從而決定了蛋白質(zhì)泛素化降解的特異性［34］。同時，一個蛋白質(zhì)底物可以有不同的E3 在不同的條件下對其進(jìn)行泛素化修飾，以達(dá)到精細(xì)調(diào)控的目的。

Nedd4 家 族 的Smurf1 （SMAD ubiquitination regulatory factor-1）是第一個被發(fā)現(xiàn)的能夠泛素化降解RhoB 的E3 泛素連接酶。Nedd4 家族屬于HECT 類型E3 泛素連接酶，都由1 個C2 結(jié)構(gòu)域、2~4個WW結(jié)構(gòu)域，以及一個具有保守序列的有催化活性的HECT 結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，因此又稱為C2-WW-HECT家族［35］。Smurf1最早是被鑒定為細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β信號途徑的下游分子Smad1的泛素調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控細(xì)胞生長和胚胎發(fā)育中起著重要的作用［36］。有趣的是，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，Smurf1 可以泛素化降解RhoA，在細(xì)胞極性、運動和上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起著重要的作用［37-38］，并且Smurf1是通過其C2結(jié)構(gòu)域來識別小G蛋白底物RhoA的［39］。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Smurf1可以同樣通過C2 結(jié)構(gòu)域識別RhoB，并對RhoB 進(jìn)行Lys48 位的泛素化修飾來介導(dǎo)RhoB 的降解。通常狀態(tài)下，細(xì)胞通過Smurf1泛素化降解RhoB使其蛋白質(zhì)水平處于一個相對較低的水平；當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激如紫外照射導(dǎo)致單鏈DNA 損傷時，細(xì)胞會激活A(yù)TM/ATR信號通路，其中ATR會激活其下游的蛋白激酶Chk1 以磷酸化Smurf1 的Thr145、Thr161 和Thr682，Smurf1 的磷酸化修飾會誘導(dǎo)其自身的泛素化降解，使得RhoB蛋白得以累積，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［40］（圖2）。

Fig. 2 Schematics of Smurf1-mediated RhoB ubiquitination圖2 Smurf1介導(dǎo)的RhoB泛素化降解

另外，其他研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RhoB還可以被RING類型Cullin家族的E3泛素連接酶復(fù)合體所泛素化修飾。Xu等［41］發(fā)現(xiàn)Cullin 2-RBX1 E3泛素連接酶復(fù)合體可以泛素化降解RhoB，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。Kovacevic 等［42］發(fā)現(xiàn)，Cullin 3-RBX1-KCTD10 E3 泛素連接酶復(fù)合體可以對RhoB 進(jìn)行K63 泛素化修飾，介導(dǎo)RhoB 通過溶酶體途徑降解來調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性，并且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Cullin 3-RBX1-KCTD10介導(dǎo)的RhoB 泛素化降解對于HER2 陽性的乳腺癌中的Rac1的激活是必需的［43］。此外，Liu等［44］發(fā)現(xiàn)，Cullin3-TNFAIP1 E3泛素連接酶復(fù)合體可以介導(dǎo)RhoB通過泛素蛋白酶體途徑降解來影響肝癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 RhoB的SUMO化修飾

前面提到細(xì)胞在紫外照射等刺激誘導(dǎo)單鏈DNA損傷的情況下，激活的Chk1激酶不僅會磷酸化修飾Smurf1 促進(jìn)Smurf1 的自身泛素化降解使得RhoB 蛋白得以累積［40］，而且還會直接磷酸化RhoB 以誘導(dǎo)RhoB 從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與PIAS1 結(jié)合［27］。PIAS1 對RhoB 進(jìn)行SUMO化修飾，而SUMO化修飾的RhoB則會與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1 （mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）抑制復(fù)合體中的結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白2（tuberous sclerosis 2 protein，TSC2）結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運至溶酶體以抑制mTORC1的活性，從而啟動細(xì)胞自噬。阻斷RhoB 的SUMO化修飾會抑制單鏈DNA 損傷引起的細(xì)胞自噬和進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡［27］（圖3）。

Fig. 3 Schematics of RhoB sumoylation and autophagy圖3 RhoB的SUMO化修飾與細(xì)胞自噬

綜上所述，RhoB 的泛素化修飾和SUMO 化修飾在調(diào)節(jié)RhoB的水平和活性上起著完全相反的作用。細(xì)胞在正常狀態(tài)下會通過Smurf1 泛素化降解RhoB 使RhoB 處于低水平狀態(tài)，使得細(xì)胞能夠正常生長；而當(dāng)細(xì)胞的DNA 受到損傷的情況下，DNA損傷應(yīng)答信號通路ATR/Chk1一方面通過磷酸化修飾Smurf1促進(jìn)Smurf1的自身降解來提高RhoB的蛋白質(zhì)水平，另一方面則通過磷酸化修飾RhoB使其從細(xì)胞質(zhì)膜上解離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)被SUMO 化修飾，從而將TSC2轉(zhuǎn)運至溶酶體抑制mTORC1的活性以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并且進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的死亡（圖4）。由此可見，RhoB 可以通過不同的翻譯后修飾來決定細(xì)胞的命運。

Fig. 4 RhoB determines cell fate by switching between ubiquitination and sumoylation圖4 RhoB泛素化修飾和SUMO化修飾之間的轉(zhuǎn)變與細(xì)胞命運

5 總結(jié)與展望

RhoB 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并且與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，RhoB 的研究將對于理解腫瘤的發(fā)病機理并探索特異的腫瘤治療方法具有重要的意義。但是，關(guān)于RhoB在不同類型的腫瘤中所起不同作用的分子機理還不完全清楚，不同類型的組織和細(xì)胞環(huán)境是否存在著特異性的修飾類型或修飾位點？除了DNA 損傷外，是否還存在其他生理性刺激來調(diào)控RhoB 的水平及活性？而目前RhoB 自身的水平和活性調(diào)控機制的研究也相當(dāng)缺乏，亟待進(jìn)一步的深入和完善。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)水平及活性的關(guān)鍵因素，目前已知的蛋白質(zhì)翻譯后修飾已達(dá)數(shù)百種，除了文中提到的已知的翻譯后修飾，RhoB很可能還有許多其他尚未發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾在不同的生理或病理情況下調(diào)節(jié)其水平、活性、細(xì)胞定位以及相互作用蛋白質(zhì)的改變等。因此，針對RhoB的翻譯后修飾進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究將會對了解其調(diào)控機制和生物學(xué)功能起到積極的促進(jìn)作用，也是全面闡明RhoB信號通路相關(guān)的分子機理不可或缺的一環(huán)。