滕澤， 張玉霞，2*， 陳衛(wèi)東， 叢百明， 田永雷，張慶昕， 張永亮， 王東儒

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028041； 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與綠色發(fā)展研究所，內(nèi)蒙古通遼 028000； 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000； 4.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010010； 5.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，呼和浩特 010010）

紫花苜蓿（Medicago sativaL．）是苜蓿屬多年生草本植物，是世界上種植最廣泛的豆科牧草，有“牧草之王”的美稱[1-2]，具有高產(chǎn)、營養(yǎng)價(jià)值高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。但在北方干旱地區(qū)種植存在越冬安全性不穩(wěn)的現(xiàn)象，尤其在科爾沁沙地由于冬季寒冷少雪，對紫花苜蓿越冬產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重時(shí)甚至可以引起紫花苜蓿死亡，對苜蓿持續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)效益造成嚴(yán)重影響,提高紫花苜蓿的抗寒能力是解決紫花苜蓿安全越冬的重要途徑[3-4]。

殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，又稱乙酰幾丁質(zhì)[5]，可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，將殼聚糖作為外源性物質(zhì)噴施于水稻[7]、棉花[8]、辣椒[9]、荔枝[10]等的葉片，能顯著提高其抗寒能力，但殼聚糖對提高紫花苜?？购缘难芯课从袌?bào)道。為此，本研究通過大田試驗(yàn)對紫花苜蓿進(jìn)行不同濃度殼聚糖處理，于越冬前期挖取紫花苜蓿越冬材料模擬低溫脅迫處理，檢測低溫處理下紫花苜蓿根頸的可溶性蛋白、蔗糖、果糖及脯氨酸含量變化，分析不同濃度殼聚糖處理對紫花苜?？购缘挠绊懀骄吭诳茽柷呱车刈匣ㄜ俎０踩蕉臍ぞ厶鞘┯昧?，以期為科爾沁沙地紫花苜?？购蕉峁├碚撘罁?jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技示范園區(qū)（43°36′N，122°22′E），海拔177 m。該地區(qū)屬于溫帶半干旱大陸性氣候，土壤為風(fēng)沙土，土壤含有機(jī) 質(zhì)4.86 g·kg-1，速 效 鉀94.65 mg·kg-1，速 效 磷10.46 mg·kg-1，堿解氮11.15 mg·kg-1，pH為8。

1.2 試驗(yàn)方法

采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，2018 年7 月3 日播種‘公農(nóng)1 號(hào)'紫花苜蓿，播種量 為22.5 kg·hm-2，行距為20 cm，小區(qū)面積為4 m×4 m=16 m2。2018年8月5日分枝期進(jìn)行噴施殼聚糖處理，共5 個(gè)處理，噴施量分別為0、50、100、150、200 μg·g-1，其中以不噴施（0 μg·g-1）為對照。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)，共15 個(gè)小區(qū)。試驗(yàn)田進(jìn)行指針式噴灌，病蟲防治等同正常田間管理。11 月13 日挖取長勢一致的紫花苜蓿越冬材料，進(jìn)行模擬低溫處理。

每個(gè)小區(qū)挖取50 株長勢均勻的紫花苜蓿，將植株地上部分剪去沖洗干凈，每個(gè)小區(qū)的材料平均分成2 份，并排列整齊地?cái)[放在厚度為3 mm。長×寬為30 cm×20 cm 的純棉布上,包裹好后均勻噴灑30 mL 蒸餾水,使棉布保持潮濕狀態(tài),然后用長×寬為30 cm×30 cm的錫箔紙包好。其中1份放入4 ℃恒溫冰箱進(jìn)行低溫冷藏處理，另1份放入可控式恒溫恒濕試驗(yàn)箱進(jìn)行-20 ℃低溫冷凍處理。可控式恒溫恒濕試驗(yàn)箱設(shè)置為：以4 ℃為起點(diǎn)，先以4 ℃·h-1的速率降溫，在-20 ℃下保持6 h，后以4 ℃·h-1的速度升溫至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，與冷藏處理材料同時(shí)測定根頸的相關(guān)性質(zhì)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

相對電導(dǎo)率采用DDS 電導(dǎo)率儀法測定，采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量，蔗糖和果糖采用間苯二酚法測定[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

用DPS 7.0 軟件進(jìn)行二因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)方法進(jìn)行新復(fù)極差多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施殼聚糖對苜蓿根頸相對電導(dǎo)率的影響

噴施殼聚糖對紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率的影響如表1 所示，隨著殼聚糖噴施量的增加，在低溫冷藏處理下，紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率呈下降的趨勢。經(jīng)過低溫冷凍處理，不同含量殼聚糖噴施處理下，紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率均較低溫冷藏處理顯著增加（P＜0.05）；殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)，紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率最低，為31.49%，且顯著低于其他處理。由此說明，噴施殼聚糖能夠減緩苜蓿在低溫脅迫下生物膜的傷害，且以100 μg·g-1處理下效果最好。

表1 不同噴施量下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率Table 1 Relative conductivity of alfalfa root neck under different spraying amount

2.2 噴施殼聚糖對苜蓿根頸可溶性蛋白含量的影響

由表2 可知，低溫冷藏處理下殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)，苜蓿根頸的可溶性蛋白含量顯著高于其他處理（P＜0.05）；低溫冷凍處理，殼聚糖施用量為150 μg·g-1時(shí)，紫花苜蓿根頸中可溶性蛋白含量達(dá)到最高，為27.19 mg·g-1，與殼聚糖噴施量100 μg·g-1處理差異不顯著，但均顯著高于其他處理（P＜0.05）。由此說明，噴施殼聚糖可提高苜蓿根頸的可溶性蛋白含量，且促進(jìn)在低溫冷凍脅迫下可溶性蛋白的轉(zhuǎn)化，在噴施量150 μg·g-1處理下效果最明顯。

表2 不同噴施量下苜蓿根頸可溶性蛋白含量Table 2 Content of soluble protein in alfalfa root neck under different spraying amount

2.3 噴施殼聚糖對苜蓿根頸脯氨酸含量的影響

如表3 所示，在低溫冷藏處理下，隨著殼聚糖噴施量的增加苜蓿根頸脯氨酸含量呈先上升后降低的趨勢，其中殼聚糖噴施量為100、150、200 μg·g-1時(shí)苜蓿根頸中脯氨酸含量均顯著高于對照（P＜0. 05），且噴施量為100 μg·g-1時(shí)脯氨酸含量達(dá)到最大。在低溫冷凍處理下，苜蓿根頸脯氨酸含量也是隨著殼聚糖噴施量的增加呈先增加后降低的趨勢，且殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)紫花苜蓿根頸中脯氨酸含量達(dá)到最大，為8.05 mg·g-1，與噴施150 μg·g-1處理間差異不顯著，但顯著高于其他處理（P＜0. 05）。說明在低溫脅迫下，噴施殼聚糖有助于脯氨酸合成，提高滲透調(diào)節(jié)能力，在100 μg·g-1下效果最明顯。

表3 不同噴施量下苜蓿根頸脯氨酸含量Table 3 Proline content of alfalfa root neck under different spraying amount

2.4 噴施殼聚糖對苜蓿根頸蔗糖含量的影響

如表4 所示，在低溫冷藏處理下，噴施不同量殼聚糖，苜蓿根頸的蔗糖含量顯著高于對照（P＜0.05），且隨著噴施量的增加呈先增加后降低的變化趨勢，在噴施100 μg·g-1時(shí)，苜蓿根頸的蔗糖含量最高，與150 μg·g-1處理差異不顯著，但顯著高于其他處理（P＜0.05）。除200 μg·g-1處理外，冷凍處理的蔗糖含量顯著高于冷藏處理，也是隨著處理量的增加呈先增加后降低的變化趨勢，100 μg·g-1處 理 的苜 蓿 根 頸 蔗 糖 含 量 最高，為88.17 μg·g-1，顯著高于其他處理（P＜0.05）。由此說明，噴施殼聚糖促進(jìn)苜蓿根頸在低溫處理下蔗糖的 合成 與轉(zhuǎn)化，在100 μg·g-1處理 下效 果最明顯。

表4 不同噴施量下苜蓿根頸蔗糖含量Table 4 Sucrose content of alfalfa root neck under different spraying amount

2.5 噴施殼聚糖對苜蓿根頸果糖含量的影響

如表5 所示，低溫冷藏處理，紫花苜蓿根頸果糖含量在殼聚糖噴施量為150 μg·g-1時(shí)最高，達(dá)69.86 μg·g-1。在低溫冷凍處理下，紫花苜蓿根頸的果糖含量顯著高于低溫冷藏處理（P＜0.05），隨著噴施量的增加呈先增加后降低的變化趨勢，殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)苜蓿根頸的果糖含量最高，為86.32 μg·g-1，且顯著高于除殼聚糖噴施量為50 μg·g-1外的其他處理（P＜0.05）。由此說明，噴施殼聚糖促進(jìn)苜蓿根頸果糖的合成及低溫脅迫下的轉(zhuǎn)化，在100～150 μg·g-1處理下轉(zhuǎn)化最明顯。

表5 不同噴施量下苜蓿根頸果糖含量Table 5 Fructose content in alfalfa root neck under different spraying amount

2.6 紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率含量與抗寒保護(hù)物質(zhì)含量的相關(guān)性

如表6 所示，不同溫度處理下紫花苜蓿根頸中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蔗糖含量、果糖含量與相對電導(dǎo)率均呈負(fù)相關(guān)。低溫冷藏處理下，紫花苜蓿根頸中脯氨酸含量與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。低溫冷凍處理下，紫花苜蓿根頸中脯氨酸含量與可溶性蛋白含量和蔗糖含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），果糖含量與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。由此說明，可溶性蛋白、脯氨酸、蔗糖、果糖是抗寒保護(hù)物質(zhì)。

表6 紫花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率含量與抗寒保護(hù)物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 6 Correlation between the content of relative electrical conductivity in root neck of alfalfa and content of cold-resistant protective substances

3 討論

當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞的質(zhì)膜透性會(huì)發(fā)生較大的改變，電解質(zhì)會(huì)有不同程度的外滲?？购栽綇?qiáng)或受寒害輕的細(xì)胞，外滲程度較輕，滲透性可逆，易于恢復(fù)正常，因此相對電導(dǎo)率可作為抗寒性的生理指標(biāo)[12]。本研究表明，噴施一定量的殼聚糖能降低紫花苜蓿根頸的相對電導(dǎo)率，提高苜蓿的抗寒能力，與辛慧慧等[13]研究結(jié)果一致，當(dāng)殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)，相對電導(dǎo)率最低，紫花苜蓿根頸受害程度較輕。

研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下植物能合成一些小分子有機(jī)物質(zhì)，以增強(qiáng)其抗寒性，可溶性蛋白含量與植物的抗寒性呈正相關(guān)[14]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高滲透壓，增強(qiáng)保水力，提高植物抗寒性，它還可以通過提高植物體內(nèi)的抗氧化酶活性來有效地清除活性氧，同時(shí)脯氨酸有維持生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能從而保護(hù)細(xì)胞免受低溫傷害的作用[15-16]。殼聚糖可以提高可溶性蛋白和脯氨酸等抗寒性物質(zhì)的含量,從而有效地抵御低溫對作物的傷害[17]。鄧拓等[18]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能夠顯著提升低溫脅迫后脯氨酸的含量，說明殼聚糖能增強(qiáng)核桃對低溫脅迫的抗寒能力。朱云林等[19]發(fā)現(xiàn)在水稻2葉期噴施殼聚糖溶液后遭受低溫脅迫,與對照相比殼聚糖處理能提高水稻幼苗體內(nèi)的脯氨酸等抗寒保護(hù)物質(zhì)含量,可以減輕低溫對水稻秧苗的危害。本研究表明，殼聚糖噴施量為100～150 μg·g-1時(shí)，低溫脅迫下紫花苜蓿根頸中可溶性蛋白和脯氨酸的含量最高。

研究表明，碳水化合物中蔗糖和果糖含量與苜蓿抗寒性有一定的相關(guān)性，在苜蓿抗寒性方面起著重要作用[20-21]。這些糖類不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，果糖還可以作為單糖發(fā)生磷酸化，從而引起糖信號(hào)傳遞使細(xì)胞對低溫做出反應(yīng)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫冷凍處理下隨著殼聚糖噴施濃度的增加，蔗糖、果糖含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中在殼聚糖噴施量為100 μg·g-1時(shí)達(dá)到最大值，說明蔗糖和果糖是抗寒保護(hù)物質(zhì)。