付家偉，丁 丁，岳艷玲

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201)

大白菜(Brassica rapaL.ssp.pekinensis)為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)大宗葉用蔬菜作物，原產(chǎn)中國(guó)，分布廣泛，類型豐富，在調(diào)節(jié)蔬菜市場(chǎng)供應(yīng)和穩(wěn)定菜價(jià)中起著重要作用。黃芽白菜屬于大白菜類型，質(zhì)地脆嫩，品質(zhì)極佳，是云南省外銷和出口的重要品類。黃芽白菜主要以常規(guī)種為主，品種混雜嚴(yán)重，種子純度不高。隨著栽培面積的擴(kuò)大，黃芽白菜品種也逐漸受到關(guān)注，一些利用自交不親和系配制的F1代雜交種子進(jìn)入市場(chǎng)，母本系自交親和能力偏高，制種管理技術(shù)不高，雜種純度仍然無(wú)法保證，給生產(chǎn)帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。

雄性不育系是實(shí)現(xiàn)大白菜雜種優(yōu)勢(shì)的重要途徑，以不育系做母本配制雜交種可以保證雜交種子純度為100%[1]。目前，廣泛應(yīng)用的大白菜雄性不育系有胞質(zhì)雄性不育和細(xì)胞核雄性不育[2]。課題組前期育成的KAB5 是一類快菜核基因雄性不育兩用系，不育株花藥敗育徹底，不育性穩(wěn)定，雌蕊發(fā)育正常，無(wú)不良性狀伴生。本研究根據(jù)復(fù)等位基因遺傳假說(shuō)[3]及定向轉(zhuǎn)育雄性不育基因的方法[4]，將雄性不育基因向黃芽白菜中進(jìn)行轉(zhuǎn)育，以期育成黃芽白菜核基因雄性不育系，為快速培育高純度黃芽白菜F1雜交種提供材料支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性不育源：快菜核不育兩用系KAB5，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜研究室選育，不育株與可育株1∶1 分離，基因型分別為MsMs 和MsfMs，系統(tǒng)內(nèi)兄妹交，后代可育株和不育株保持1∶1 分離；可育株自交，后代中可育株與不育株3∶1 分離。

待轉(zhuǎn)育品系：黃芽白菜自交系H249，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜研究室選育。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)交

以 KAB5 不育株為母本、自交系H249 為父本系進(jìn)行測(cè)交，測(cè)交種子于2 ℃冰箱中通過(guò)春化后播種育苗，花期鑒定育性，移栽環(huán)境溫度小于28 ℃，常規(guī)水肥管理。其他轉(zhuǎn)育各世代栽培管理方法與上述測(cè)交后代相同。

1.2.2 轉(zhuǎn)育方法

根據(jù)測(cè)交鑒定結(jié)果，按照待轉(zhuǎn)育材料與不育源基因互補(bǔ)原則，湊齊復(fù)等位基因Msf、Ms 和ms，在各世代中選擇與待轉(zhuǎn)育品系性狀一致且含有Msf和Ms 基因的個(gè)體，并與待轉(zhuǎn)育品系進(jìn)行連續(xù)回交，直至性狀穩(wěn)定(圖1)。

圖1 黃芽白菜核基因雄性不育系轉(zhuǎn)育方法Fig.1 Transferring and breeding method of genic male sterile line in Huangya Chinese cabbage

采用常規(guī)有性雜交、自交、回交和測(cè)交方法實(shí)施轉(zhuǎn)育，育性與園藝性狀同時(shí)選育，套袋隔離，常規(guī)手工授粉。樣本容量(n)按公式n≥lg0.01/lg(1-P)[5]計(jì)算，式中：P為目標(biāo)基因發(fā)生概率。X2適合性檢驗(yàn)按公式X2=∑(|A-E|-0.5)2/E[6]計(jì)算，式中：A為實(shí)際觀察數(shù)；E為理論期望數(shù)；|A-E|為實(shí)際觀察數(shù)與理論期望數(shù)之差的絕對(duì)值。自由度df=1 時(shí)，X20.05,1=3.84。

1.2.3 花器表型測(cè)定

黃芽白菜H249 及其雄性不育系HA1 于2 ℃冰箱春化15 d，播種40 d 始花，于盛花期隨機(jī)選取5 株，取其花序用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量不同發(fā)育時(shí)期花蕾的縱徑和橫徑；取剛開放的花測(cè)定花瓣、萼片、雄蕊和雌蕊的長(zhǎng)度。將已經(jīng)測(cè)量的花蕾用鑷子小心剝?nèi)ポ嗥突ò?，取出花藥置于載玻片上，用鑷子擠壓釋放小孢子或花粉，經(jīng)蘇木素染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉發(fā)育過(guò)程。

2 結(jié)果與分析

2.1 H249 基因型鑒定結(jié)果

分別以3 株KAB5 不育株為母本、3 株黃芽白菜自交系H249 為父本進(jìn)行測(cè)交，測(cè)交后代鑒定72 株，全為不育株(表1)，說(shuō)明待轉(zhuǎn)育品系H249 的基因型為msms，即MsMs×msms→Msms。

2.2 黃芽白菜核基因雄性不育系轉(zhuǎn)育結(jié)果

由于待轉(zhuǎn)育品系中缺少M(fèi)sf和Ms 基因，因此可用KAB5 可育株(基因型MsfMs)為不育源與待轉(zhuǎn)育品系H249 進(jìn)行雜交，即：msms×MsfMs→Msfms,Msms，雜交后代可育株與不育株1∶1 分離(表1)。在雜交后代不育株中選擇3 株分別與待轉(zhuǎn)育品系H249 進(jìn)行回交，回交后代有50%不育株分離(表2)，即Msms×msms→Msms,msms。每代選3 株不育株與待轉(zhuǎn)育品系進(jìn)行回交，H249 作為輪回親本，各回交后代均有50%不育株分離(表2)。

表1 H249 與KAB5 雜交后代育性分離結(jié)果Tab.1 Results of fertility segregation of hybrid progeny of crossing H249 and KAB5

KAB5 可育株與H249 雜交后代的可育株各選擇3 株與H249 進(jìn)行回交，后代均為可育株(表2)，在其中選擇7 株與H249 進(jìn)行回交，H249作為輪回親本，同時(shí)7 株可育株分別與KAB5 不育株進(jìn)行測(cè)交，以區(qū)分Msfms 和msms 基因型，結(jié)果(表3)顯示：((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-4、-5、-7 及(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-1、-3 與KAB5 不育株進(jìn)行測(cè)交，測(cè)交后代可育株與不育株表現(xiàn)為1∶1 分離，說(shuō)明((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-4、-5、-7 及(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-1、-3 的基因型是Msfms，選擇其與H249 進(jìn)行回交，后代基因型為Msfms 和msms。

表2 H249 各回交后代育性表現(xiàn)Tab.2 Fertility expression of progenies from H249 backcrossing

表3 各世代Msfms 基因型測(cè)交結(jié)果Tab.3 Test cross results of genotyping of Msfms in different generations

將回交3 代(((H249-1×KAB5-1B)-1A×H249)-2A×H249)-1A×H249 不育株(基因型Msms)與(((H-249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-1×H249的Msfms 基因型植株進(jìn)行雜交，后代可育株與不育株3∶1 分離，選擇可育株進(jìn)行自交，自交后代育性分離結(jié)果(表4)顯示：12 個(gè)自交處理中，有8 個(gè)處理自交后代全為可育株，4 個(gè)處理自交后代出現(xiàn)可育株與不育株3∶1 分離，說(shuō)明這4 個(gè)處理自交產(chǎn)生MsfMsf、MsfMs 和MsMs；選5 株可育株分別與同系不育株雜交，后代出現(xiàn)全可育或1∶1 分離，1∶1 分離的HAB1、HAB2和HAB6 即為新的甲型兩用系(表5)。將新甲型兩用系不育株與H249 雜交，后代100%不育株，即HA1、HA2 和HA3 為新的黃芽白菜雄性不育系。

表4 BC3Msms×BC3Msfms 自交后代育性分離比率Tab.4 Fertility segregation ratio of selfing offspring from BC3Msms×BC3Msfms

表5 黃芽白菜新甲型兩用系及新不育系測(cè)配結(jié)果Tab.5 Results of the test crosses for breeding new genic male sterile line and AB lines in Huangya Chinese cabbage

2.3 黃芽白菜核基因雄性不育系的敗育特征

黃芽白菜不育系花器表型檢測(cè)結(jié)果(表6)發(fā)現(xiàn)：不育花瓣長(zhǎng)、花瓣寬、長(zhǎng)雄蕊高和柱頭高極顯著低于H249 (P＜0.01)，萼片長(zhǎng)與H249 差異不顯著。不育花變小，花絲和花藥顏色變白，花絲縮短，花藥變小(圖2)。

圖2 黃芽白菜核基因雄性不育系HA1 和可育系H249 的花Fig.2 Flower of genic male sterile line HA1 and fertile line H249 of Huangya Chinese cabbage

表6 HAB2 可育和不育的花器官形態(tài)Tab.6 Flower organ form between fertile and sterile plants of HAB2 mm

可育品系H249 花藥和花粉均能正常發(fā)育，花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)正常的減數(shù)分裂(圖3a)形成四分體，呈飽滿球形(圖3b)；包裹四分體的胼胝質(zhì)降解后，釋放單核小孢子，球形，染色深，可見(jiàn)表面有外壁物質(zhì)形成(圖3c)；至花粉成熟期，形成成熟的花粉粒和花粉外壁，染色極深(圖3d)。同一發(fā)育時(shí)期，黃芽白菜不育系HA1 的花蕾均小于H249；HA1 花粉母細(xì)胞可完成減數(shù)分裂形成四分體(圖3e)，但四分體形狀不規(guī)則 (圖3f)，說(shuō)明此時(shí)小孢子已經(jīng)開始敗育；到單核期可觀察到HA1 皺縮的小孢子(圖3g)，但之后再觀察不到完整的小孢子細(xì)胞，小孢子發(fā)生完全敗育。

圖3 黃芽白菜不育系HA1 及可育品系H249 花藥發(fā)育時(shí)期的小孢子Fig.3 Microspores of genic male sterile line HA1 and fertile line H249 of Huangya Chinese cabbage during the development of anther

3 討論

云南省地處中國(guó)西南邊陲，境內(nèi)溝壑縱橫，形成了立體氣候條件，可實(shí)現(xiàn)大白菜周年生產(chǎn)和供應(yīng)。黃芽白菜在外銷批發(fā)市場(chǎng)及電商平臺(tái)上均占有較大比重，其雜種優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)利用及保障生產(chǎn)和品質(zhì)的重要前提。目前，市場(chǎng)上部分黃芽白菜是采用自交不親和系配制而成的F1雜交種，雜種純度80%，母本種子混雜嚴(yán)重。分析其純度低的原因可能為：一方面，用于配制雜交種的自交不親和系自交親和指數(shù)高，致使制種時(shí)母本自交結(jié)種量較高；另一方面，制種條件控制較差，制種后期采種量占比較高，導(dǎo)致假雜種比例升高。因此，在使用自交不親和系制種時(shí)，很難控制雜種純度為100%。復(fù)等位核基因雄性不育系雄蕊敗育徹底，無(wú)環(huán)境敏感性，無(wú)胞質(zhì)副效應(yīng)[6]，應(yīng)用具有100%不育株率的復(fù)等位核基因雄性不育系進(jìn)行制種，其成本低、過(guò)程安全、管理簡(jiǎn)單、雜種純度100%，是較理想的雄性不育源[1]。黃芽白菜雄性不育系的育成，使利用雄性不育系生產(chǎn)黃芽白菜雜交種成為可能，將解決黃芽白菜雜種純度低的難題，對(duì)提高黃芽白菜育種水平和保障其生產(chǎn)供應(yīng)具有重要意義。

根據(jù)植株育性的改變，植物雄性不育系花器官的結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)形式也發(fā)生改變，大致可分為以下4 類：雄蕊退化或變形或發(fā)生瓣化[7-8]；小孢子母細(xì)胞發(fā)育異?；蛐℃咦影l(fā)育異常，不能產(chǎn)生正?；ǚ郏ǚ刍位驍∮?；花藥畸形不能正常開裂，可產(chǎn)生部分?jǐn)∮ǚ酆蜕倭空；ǚ踇9]；花粉形態(tài)正常，但不能正常萌發(fā)[10]。植物育性的改變會(huì)使雄性不育植株形態(tài)發(fā)生變化，其中，花蕾、花瓣、雄蕊和雌蕊等變化較大。有研究發(fā)現(xiàn)：小孢子的發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)指標(biāo)(如花蕾長(zhǎng)、花藥長(zhǎng)和花瓣長(zhǎng))密切相關(guān)[11]。黃芽白菜轉(zhuǎn)入不育基因后，不育系花小，花絲和花藥變白，花絲縮短，花藥變小，徹底敗育，在顯微鏡下無(wú)法看見(jiàn)完整的小孢子，說(shuō)明黃芽白菜育性改變伴隨著花形態(tài)的變化。

對(duì)150 種植物敗育的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：70%以上的植物敗育發(fā)生在四分體時(shí)期到單核時(shí)期[12]。孫日飛等[13]認(rèn)為：大白菜細(xì)胞核雄性不育系敗育發(fā)生在小孢子四分體時(shí)期，由于絨氈層細(xì)胞異常膨大，擠壓四分體，使四分體不能分開，不能形成正常的花粉粒，從而導(dǎo)致敗育。葉紈芝等[14]也觀察到同樣的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)四分體不分離后，小孢子內(nèi)不斷有顆粒狀的物質(zhì)流出，最終使小孢子萎縮變空，不能形成花粉。謝潮添等[15]則認(rèn)為：大白菜發(fā)生雄性不育，小孢子母細(xì)胞及小孢子首先出現(xiàn)異常，而后絨氈層細(xì)胞才出現(xiàn)異常；花藥形成早期的造孢細(xì)胞核仁分布不均，減數(shù)分裂后四分體細(xì)胞核分布異常；包裹小孢子的胼胝質(zhì)壁降解后，小孢子外壁不均勻，導(dǎo)致小孢子收縮敗育。韓玉珠等[16]對(duì)大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育兩用系花藥的研究發(fā)現(xiàn)：不育系花藥發(fā)育受阻于孢原細(xì)胞階段，不形成藥室，屬無(wú)花粉型。花藥發(fā)育受阻于孢原細(xì)胞分化期，沒(méi)有孢原細(xì)胞的分化，不能形成藥室。王福青等[17]研究發(fā)現(xiàn)：大白菜雄性不育兩用系88-3 的小孢子母細(xì)胞不能進(jìn)行減數(shù)分裂，從而導(dǎo)致小孢子不能正常發(fā)育直至敗育?？梢?jiàn)，不同大白菜不育材料的敗育時(shí)期不盡相同。黃芽白菜核基因雄性不育表型發(fā)生在四分體時(shí)期，四分體不能進(jìn)一步發(fā)育成單核小孢子，之后的敗育過(guò)程中不能檢測(cè)到完整的小孢子，是育種應(yīng)用中比較可靠的一類雄性不育源，其敗育機(jī)制的深入研究將有利于該優(yōu)良不育源的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究采用定向轉(zhuǎn)育方法成功將不育基因轉(zhuǎn)入黃芽白菜，育成黃芽白菜核基因雄性不育系。該不育系雌蕊發(fā)育正常，雄蕊敗育徹底，不育度高，不育株率100%，敗育發(fā)生在四分體時(shí)期，不能形成花粉。