謝永廣,魏朝宇,魏秀英,羅華輝,陳敦學(xué)

( 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州大學(xué)漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心,貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025 )

作為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,目前兩棲類養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大,水產(chǎn)消毒劑的使用已不可避免。為確保水產(chǎn)消毒劑僅具有消毒效果,而對(duì)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物和自然環(huán)境呈低毒或無毒作用,首先應(yīng)該優(yōu)化消毒劑的使用劑量[1]。蝌蚪長(zhǎng)期生活在水中,其鰓和皮膚具有較好的滲透性,對(duì)藥物較為敏感[2],利用蝌蚪進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。目前對(duì)蝌蚪的急性毒性試驗(yàn)主要集中在重金屬類,如評(píng)價(jià)Cu2+和Cd2+對(duì)中華蟾蜍(Bufogargarizans)[4-5]、澤陸蛙(Fejervaryamultistriata)[6]、海陸蛙(F.cancrivora)[7]的影響,以及Cr6+對(duì)中國林蛙(Ranachensinensis)的急性毒性試驗(yàn)等[8]。

關(guān)于氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘等常見水產(chǎn)消毒劑對(duì)兩棲類急性毒性的研究尚較少。目前僅有:程劍等[9]分析了4種消毒劑對(duì)黑斑蛙(R.nigromaculata)毒性的影響,認(rèn)為黑斑蛙蝌蚪對(duì)高錳酸鉀敏感性最強(qiáng),而除氯化鈉屬于低毒性消毒劑外,硫酸銅、高錳酸鉀、聚維酮碘等均屬于中毒性消毒劑,使用過程中要控制好用量;梁成斌等[10]分析了高錳酸鉀和氯化鈉對(duì)東北林蛙(R.dybowskii)蝌蚪的急性毒性影響;Langhans等[11]研究表明,氯化鈉質(zhì)量濃度為5600 mg/L時(shí),東北林蛙蝌蚪大量死亡;Santana等[12]發(fā)現(xiàn),甲醛對(duì)牛蛙(Lithobatescatesbeianus)蝌蚪的96 h半致死質(zhì)量濃度為10.53 mg/L。

不同種類蝌蚪在生物學(xué)特性上的種屬差異導(dǎo)致對(duì)化學(xué)品的敏感性也存在差異[12],因此實(shí)際操作中,一般依托本地兩棲類模式生物進(jìn)行研究,棘胸蛙(Quasipaaspinosa)作為我國特有的一種大型食用蛙類,主要分布在我國南方八省,具有良好的養(yǎng)殖前景,目前養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,從業(yè)人數(shù)較多。同時(shí),棘胸蛙對(duì)生存環(huán)境要求苛刻,被稱為生態(tài)環(huán)境的晴雨表,對(duì)環(huán)境變化非常敏感,是進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)的優(yōu)質(zhì)材料[13]。因此,筆者以棘胸蛙蝌蚪為試驗(yàn)材料,采用水生生物急性毒性試驗(yàn)方法,研究4種常見水產(chǎn)消毒劑氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀和聚維酮碘對(duì)其的急性毒性作用,以期為棘胸蛙的規(guī)范養(yǎng)殖和安全用藥提供依據(jù),并為常用水產(chǎn)消毒劑對(duì)兩棲類急性毒性的評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用棘胸蛙蝌蚪采自貴州省黔東南州臺(tái)江縣,試驗(yàn)前將蝌蚪培養(yǎng)至38～39期(Gosner分期[11]),約50日齡,在室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d后,選出規(guī)格相近、活動(dòng)性好的健康蝌蚪進(jìn)行毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)蝌蚪的平均體質(zhì)量為(0.79±0.22) g,平均體長(zhǎng)(吻端至尾端)為(43.00±0.81) mm。試驗(yàn)用水為充分曝氣3 d以上的自來水,水溫(20±1) ℃、pH 7.2、溶解氧≥5.5 mg/L,自然光周期條件下培養(yǎng)。

試驗(yàn)所用試劑氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)和高錳酸鉀(廣東航鑫科技股份公司)均為分析純,聚維酮碘(PVP-I)(湖北五湖漁業(yè)股份有限公司)有效含量≥99%,有效碘含量為10%。并按照使用說明采用雙蒸水配制成母液,試驗(yàn)時(shí)稀釋到使用質(zhì)量濃度即可。

1.2 試驗(yàn)方法

通過預(yù)試驗(yàn)確定棘胸蛙蝌蚪24 h致死質(zhì)量濃度下限值及96 h無死亡質(zhì)量濃度上限值,確定正式試驗(yàn)的藥物質(zhì)量濃度。開始試驗(yàn)時(shí),氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘4種藥物按等對(duì)數(shù)間距分別設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度組,同時(shí)再設(shè)定1個(gè)空白對(duì)照組。4種藥物的質(zhì)量濃度梯度見表1。每個(gè)試驗(yàn)容器中有藥液10 L,每個(gè)質(zhì)量濃度處理隨機(jī)放置20尾蝌蚪,并設(shè)置3個(gè)平行。采取靜態(tài)-更新的方法[14],每12 h換水50%,并加入不同質(zhì)量濃度的相應(yīng)藥物,試驗(yàn)前1 d及試驗(yàn)期間禁食[15]。試驗(yàn)開始后的前8 h連續(xù)觀察供試蝌蚪的中毒癥狀,然后每隔12 h為時(shí)間點(diǎn),觀察記錄蝌蚪在24、48、72、96 h死亡的數(shù)量,并及時(shí)清除死亡個(gè)體。判斷蝌蚪死亡的標(biāo)準(zhǔn)是用鑷子輕夾蝌蚪尾部,連續(xù)觀察30 s,若蝌蚪無反應(yīng),即認(rèn)為蝌蚪已死亡[15]。

表1 4種水產(chǎn)消毒劑的試驗(yàn)質(zhì)量濃度Tab.1 Concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用改良寇式法計(jì)算各試驗(yàn)組的半致死質(zhì)量濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間,并以試驗(yàn)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、死亡率為縱坐標(biāo)做直線回歸方程。藥物毒性蓄積程度系數(shù)參照文獻(xiàn)[9]方法計(jì)算,安全質(zhì)量濃度(SC)按下式計(jì)算:

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

2 結(jié) 果

2.1 蝌蚪中毒癥狀描述

隨著消毒劑質(zhì)量濃度增加,蝌蚪中毒癥狀逐漸明顯,高質(zhì)量濃度氯化鈉處理后,蝌蚪反應(yīng)劇烈,在水里狂游不止,并隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),蝌蚪開始出現(xiàn)身體側(cè)翻或尾末端不自然彎曲,皮膚變暗,且死亡個(gè)體均呈現(xiàn)尾梢上翹癥狀;甲醛和高錳酸鉀處理后,蝌蚪死亡后體表黏液明顯增多;而聚維酮碘處理蝌蚪后,蝌蚪游動(dòng)加快、反應(yīng)劇烈,并不時(shí)出現(xiàn)身體顫抖,隨后便死亡,且隨著藥物質(zhì)量濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),蝌蚪的致死效應(yīng)加劇。

2.2 急性毒性特征分析

試驗(yàn)期間,對(duì)照組棘胸蛙蝌蚪表現(xiàn)正常,無死亡現(xiàn)象;試驗(yàn)組中,隨藥物質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),蝌蚪死亡率逐漸上升(表2)。氯化鈉質(zhì)量濃度為8659.28 mg/L時(shí),48 h蝌蚪死亡率超過50%[(57.67±0.94)%];當(dāng)質(zhì)量濃度為15 000 mg/L時(shí),蝌蚪在48 h時(shí)即全部死亡。甲醛質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時(shí),蝌蚪72 h開始出現(xiàn)死亡,死亡率為(6.67 ± 0.47)%;質(zhì)量濃度為22.36 mg/L時(shí),72 h的死亡率超過50%[(56.67±1.25)%];質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí),48 h即全部死亡。高錳酸鉀質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí),96 h開始出現(xiàn)死亡;質(zhì)量濃度為4.47 mg/L時(shí),72 h死亡率超過50%[(55.00±0.82)%];質(zhì)量濃度為10.00 mg/L時(shí),48 h即全部死亡。聚維酮碘質(zhì)量濃度為3.74 mg/L時(shí),72 h的死亡率超過50% [(50.00±2.45)%];質(zhì)量濃度為7.00 mg/L時(shí),24 h即全部死亡。

表2 4種水產(chǎn)消毒劑對(duì)棘胸蛙蝌蚪的致死率Tab.2 The mortality of frog Q. spinosa tadpoles exposed to four aquaculture disinfectants

2.3 半致死質(zhì)量濃度和毒性蓄積效應(yīng)

氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀和聚維酮碘對(duì)棘胸蛙蝌蚪半致死質(zhì)量濃度和毒性蓄積效應(yīng)見表3。半致死質(zhì)量濃度隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)所需消毒劑質(zhì)量濃度逐漸下降,其中4種消毒劑24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度排列均為:氯化鈉>甲醛>高錳酸鉀>聚維酮碘。氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘4種藥物對(duì)棘胸蛙蝌蚪96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為7145.53、16.32、3.61、2.93 mg/L。依據(jù)安全質(zhì)量濃度計(jì)算方法,得到4種消毒劑安全質(zhì)量濃度分別為1949.01、4.80、0.88、1.85 mg/L。藥物毒性蓄積程度系數(shù)呈現(xiàn)較大的差異,其中氯化鈉和甲醛處理組隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),藥物毒性蓄積程度系數(shù)呈下降趨勢(shì),且氯化鈉處理下降較快,藥物蓄積效應(yīng)差,而高錳酸鉀和聚維酮碘處理組的藥物毒性蓄積程度系數(shù)在96 h內(nèi)呈現(xiàn)先降后升的現(xiàn)象。通過回歸分析得到棘胸蛙蝌蚪死亡率(y)與消毒劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)的回歸方程(表4),所有回歸方程均呈上升趨勢(shì),說明隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),死亡率會(huì)逐漸上升。

表3 4種消毒劑對(duì)棘胸蛙蝌蚪急性毒性特征分析Tab.3 Acute toxicity characteristics of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

表4 4種水產(chǎn)消毒劑對(duì)棘胸蛙蝌蚪毒性的回歸分析Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

3 討 論

3.1 棘胸蛙蝌蚪消毒劑敏感性分析

目前利用本土兩棲類作為化學(xué)品毒性的生物測(cè)試方法已成為共識(shí)[3],如蘇紅巧等[16]建立了利用蝌蚪進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。然而我國本土的兩棲類種類較多,包括黑斑蛙[10]、海陸蛙[7]、中華蟾蜍[5]、棘胸蛙[13]等,且不同的物種存在生物學(xué)上的種屬特異性,對(duì)化學(xué)品的敏感性也存在差異。隨著我國生態(tài)文明建設(shè)的進(jìn)一步深入,選擇一種對(duì)化學(xué)品敏感且容易獲得的本土蛙類進(jìn)行相關(guān)急性毒性試驗(yàn),對(duì)進(jìn)行生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)具有重要意義。本試驗(yàn)中的棘胸蛙蝌蚪對(duì)聚維酮碘的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑斑蛙[9];對(duì)高錳酸鉀的敏感性略低于黑斑蛙[9]和東北林蛙[10];對(duì)氯化鈉的敏感性與黑斑蛙[9]基本相同,而高于東北林蛙[11];對(duì)甲醛的敏感性低于東北林蛙[11]和牛蛙[12],但高于黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)[17]和花鰻鱺(Anguillamarmorata)幼魚[18]。以上結(jié)果說明棘胸蛙蝌蚪可以作為環(huán)境毒性的監(jiān)測(cè)生物。此外,高錳酸鉀的使用具有溫度依賴性[19-20],在實(shí)際生產(chǎn)中養(yǎng)殖戶很難把握合適的使用劑量,因此建議使用聚維酮碘作為消毒劑。

3.2 4種消毒劑的毒性特征與用藥安全

正確合理地使用消毒劑可以有效控制許多細(xì)菌、寄生蟲和真菌的暴發(fā),減少抗生素的使用。半致死質(zhì)量濃度是評(píng)價(jià)藥物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物急性毒性的重要指標(biāo),試驗(yàn)結(jié)果顯示,氯化鈉和甲醛對(duì)棘胸蛙蝌蚪的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為7145.53、16.32 mg/L,大于10.0 mg/L,屬于低毒消毒劑;高錳酸鉀和聚維酮碘的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.61、2.91 mg/L,介于1.0～10.0 mg/L內(nèi),屬于中毒消毒劑[21]。類似的結(jié)果在其他蛙類中也有報(bào)道,如:高錳酸鉀對(duì)東北林蛙蝌蚪[10]和黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為1.098、1.803 mg/L,遠(yuǎn)低于一般養(yǎng)殖魚類[18,22];甲醛對(duì)牛蛙蝌蚪[12]的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為16.32、10.53 mg /L,遠(yuǎn)低于花鰻鱺幼魚(88.78 mg/L)[18]和黃尾鲴(72.30 mg/L)[17];氯化鈉對(duì)黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死質(zhì)量濃度為7348.56 mg/L,同時(shí)在氯化鈉質(zhì)量濃度為5600 mg/L時(shí),東北林蛙[11]出現(xiàn)大量死亡,均低于黃尾鲴(9664.36 mg/L)[17]、西雜鱘幼魚(8.17 mg/L)[23]和花鰻鱺幼魚(22 278 mg/L)[18]的96 h半致死質(zhì)量濃度。由此推斷,兩棲類蝌蚪對(duì)消毒劑的敏感性通常高于魚類,利用兩棲類檢測(cè)環(huán)境中的微量毒物及環(huán)境污染情況,具有重要的應(yīng)用價(jià)值和參考作用。

本試驗(yàn)中,高錳酸鉀對(duì)棘胸蛙蝌蚪的安全質(zhì)量濃度為0.88 mg/L,高于黑斑蛙[9]的0.27 mg/L,也高于東北林蛙[10]的0.534 mg/L,然而卻遠(yuǎn)低于生產(chǎn)使用量10 mg/L,同時(shí)已有研究證明,高錳酸鉀的消毒效果不存在劑量依耐性[1],因此如采用高錳酸鉀作為消毒劑,建議通過降低使用劑量和延長(zhǎng)消毒時(shí)間的方式進(jìn)行。聚維酮碘對(duì)棘胸蛙蝌蚪的安全質(zhì)量濃度為1.85 mg/L,低于黑斑蛙蝌蚪[9]的安全質(zhì)量濃度2.71 mg/L,也低于西雜鱘幼魚[23]的安全質(zhì)量濃度2.37 mg/L,甚至低于生產(chǎn)上使用的劑量2～4 mg/L,因此在棘胸蛙蝌蚪養(yǎng)殖過程中,使用聚維酮碘作為消毒劑時(shí)使用要減少用量,以免造成損失。氯化鈉對(duì)棘胸蛙蝌蚪安全質(zhì)量濃度為1949.01 mg/L,低于黑斑蛙[9]的安全質(zhì)量濃度2204.6 mg/L,通常生產(chǎn)上僅用氯化鈉下塘前浸泡消毒苗種,而少用于水體潑灑。甲醛對(duì)棘胸蛙蝌蚪的安全質(zhì)量濃度為4.8 mg/L,遠(yuǎn)低于常用消毒劑量30 mg/L,因此,使用甲醛作為消毒劑時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格控制其使用劑量,或者及時(shí)換水。綜上,為發(fā)揮消毒劑最優(yōu)消毒效果以及避免在養(yǎng)殖過程中對(duì)棘胸蛙等兩棲類造成較大傷害,消毒劑的使用可選擇減少劑量和適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間這種方式。

3.3 消毒劑的殺菌原理分析

高錳酸鉀作為一種強(qiáng)效氧化劑,主要通過產(chǎn)生抑制性化合物和增強(qiáng)免疫反應(yīng)來保護(hù)宿主[24]。過量的高錳酸鉀通過改變魚體表面微生物菌群的群落組成,將消滅對(duì)高錳酸鉀較為敏感的革蘭氏陰性菌,進(jìn)而降低致病菌感染難度[1]。一些水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)高錳酸鉀具有較好的降毒解毒能力,在48～72 h內(nèi),高錳酸鉀的藥物毒性蓄積程度系數(shù)下降一半以上,具有較低的藥物蓄積效應(yīng)。因此在高錳酸鉀消毒后,只要魚類沒有死亡則可以很快恢復(fù),如高錳酸鉀處理斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)后使其鰓輕度肥大并產(chǎn)生海綿狀增生,但是經(jīng)過48 h治療后,即可恢復(fù)正常[24]。氯化鈉是比較安全的魚類養(yǎng)殖常規(guī)消毒殺菌藥物,通過改變機(jī)體的滲透壓來殺滅一些寄生蟲和病原微生物,對(duì)治療魚類的水霉病、寄生蟲病和細(xì)菌性疾病有一定的效果,但是生產(chǎn)上主要用于魚苗下塘消毒[25]。聚維酮碘與有機(jī)物相互作用后,將具有殺菌作用的游離碘還原為碘化物,因此聚維酮碘消毒效果具有劑量依耐性,Silas等[26]發(fā)現(xiàn),通過連續(xù)多次添加較低劑量的聚維酮碘可以取得與較高劑量聚維酮碘相似的消毒效果,可以避免高劑量的聚維酮碘引起水產(chǎn)動(dòng)物中毒。甲醛主要通過烷基化反應(yīng)使菌體蛋白變性,進(jìn)而起到殺菌作用,主要用于對(duì)硫酸銅等藥物敏感的魚類[17]。

4 結(jié) 論

在4種水產(chǎn)消毒劑中,氯化鈉和甲醛屬于低毒消毒劑,而高錳酸鉀和聚維酮碘屬于中毒消毒劑。充分考慮劑量敏感性和使用方便性,推薦使用聚維酮碘作為消毒劑。此外蝌蚪對(duì)消毒劑的敏感性通常高于魚類,因此在棘胸蛙等兩棲類養(yǎng)殖過程中,消毒劑的使用需要減少劑量。