汪居安，王居義，蔡葉，，李幸蓉，，吳凌，4，伊艷敏，4，檀嘯，王繼洲

作者單位：1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，安徽 合肥 241002；2皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 230001；3安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038；4安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南232001

肝纖維化（liver fibrosis，LF）是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過度異常增生的病理過程，是多種慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)［1-2］。郁金配伍丁香屬中藥“十九畏”之一（丁香莫與郁金見），然而長期以來，“十九畏”同方配伍的禁忌爭議不斷，團(tuán)隊(duì)通過文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)郁金配伍丁香常用于治療消化系統(tǒng)疾病，多有奇效［3］，中藥郁金具有疏肝利膽、活血止痛的功效，其抗肝損傷、抗纖維化的確切作用已得到驗(yàn)證［4-6］，然而二藥配伍治療肝臟疾病卻罕見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)組前期通過初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：郁金單用或合用丁香均能通過消除自由基和減輕炎癥反應(yīng)干預(yù)纖維化，且丁香能夠增強(qiáng)郁金抗炎和抗纖維化的能力。為進(jìn)一步深入挖掘郁金-丁香藥對(duì)抗肝纖維化的分子機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)二藥合用抗肝纖維化的可能機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，以期為十九畏內(nèi)涵的豐富及二藥臨床同用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 郁金-丁香藥對(duì)活性成分及靶點(diǎn)的獲取于2022 年1 月8 日基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http：∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫篩選郁金和丁香的活性成分，通用篩選條件為口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18［7］，因本研究所選中藥僅兩味，且按前述條件進(jìn)行篩選所得活性成分過少，不利于研究，故適當(dāng)降低篩選條件，以O(shè)B≥15%和DL≥0.15 進(jìn)行成分篩選。去除重復(fù)后，即得到主要活性成分。同時(shí)通過TCMSP 平臺(tái)對(duì)篩選出的活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，去重后得到相關(guān)靶蛋白，將相關(guān)靶蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.uniprot.or-g），以“Organism=Homo sapiens（Human）、Reviewed”為前提，并剔除無對(duì)應(yīng)基因名的靶蛋白，獲取對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化潛在靶點(diǎn)與活性成分獲取以“l(fā)iver fibrosis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：∕∕www.genecards.org∕），NCBI 基因數(shù)據(jù)（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）以 及OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：∕∕www.omim.org∕）進(jìn)行人類基因檢索。其中，GeneCards 數(shù)據(jù)庫所獲得的靶點(diǎn)依據(jù)中位值進(jìn)行得分的篩選，以獲得更加相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。將篩選得到的郁金、丁香活性成分候選基因靶點(diǎn)與LF候選基因靶點(diǎn)輸入作圖軟件Venny 2.1 中，繪制郁金、丁香候選靶點(diǎn)與LF候選靶點(diǎn)的韋恩圖，兩者交集部分即為治療郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)，潛在靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的活性成分即郁金-丁香藥治療肝纖維化的潛在活性成分。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了更好的理解成分、疾病以及相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜作用關(guān)系，將藥物、疾病、潛在活性成分以及潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)應(yīng)用軟件自帶的“Network analyzer”插件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行拓?fù)浞治?，其度值越大提示該?jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.4 靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕string-db.org∕cgi∕input.pl∕）的Multiple proteins 中，將Organism選擇為Homo Sapiens，最小交互打分值設(shè)置為0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中離散的節(jié)點(diǎn)。最后將得到的數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)出并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小及顏色反應(yīng)度值，最終得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選度值靠前的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)功能通路分析及靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將潛在靶點(diǎn)輸入Metascape（http：∕∕metascape.org∕）數(shù)據(jù)庫，選擇個(gè)性化分析，設(shè)置P＜0.05，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子＞1.5，進(jìn)行基因本體（Gene-Ontology，GO）富集分析，選擇生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）3個(gè)部分。利用David 數(shù)據(jù)庫（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

1.6 分子對(duì)接采用PubChem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）數(shù)據(jù)庫確定活性成分的化合物名稱、分子量和2D 結(jié)構(gòu)，采用RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.rcsb.org∕）下載靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。利用AutoDock軟件（http：∕∕vina.scripps.edu∕），準(zhǔn)備分子對(duì)接所需的化合物配體和蛋白質(zhì)，對(duì)于目標(biāo)蛋白，其晶體結(jié)構(gòu)需預(yù)處理，包括去除原配體與水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場參數(shù)，最后將處理后的靶點(diǎn)蛋白與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，并對(duì)結(jié)合力高的組別使用PYMOL軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果二藥去除重復(fù)活性成分后，得到主要活性成分44 個(gè)，其治療肝纖維化潛在活性成分12 個(gè)，詳見表1。同時(shí)通過TCMSP平臺(tái)對(duì)篩選出的44個(gè)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，去重后共得到209個(gè)相關(guān)靶蛋白，將相關(guān)靶蛋白通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲取對(duì)應(yīng)基因，剔除無對(duì)應(yīng)基因名的靶蛋白，共獲取對(duì)應(yīng)基因200個(gè)。

表1 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的潛在活性成分

2.2 抗肝纖維化靶點(diǎn)篩選結(jié)果經(jīng)檢索，Gene-Cards數(shù)據(jù)庫獲得3 888個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)；NCBI數(shù)據(jù)庫獲得369 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)；OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得54 個(gè)靶點(diǎn)。將這3個(gè)數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后，得到3 951個(gè)疾病相關(guān)基因。與郁金-丁香藥對(duì)活性成分的200個(gè)基因取交集，得到共同靶點(diǎn)155 個(gè)，即郁金-丁香藥對(duì)主要通過作用于這些共同靶點(diǎn)起到抗肝纖維化的作用。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析將中藥、中藥活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1，其中黃色代表中藥，藍(lán)色代表成分，綠色代表疾病，紅色代表靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)有169個(gè)節(jié)點(diǎn)，433 條邊，其中，槲皮素、山柰酚、柚皮素、β-谷甾醇4種活性成分度值最高，分別為125，46，31，22，在郁金-丁香藥治療LF 中，推測上述成分可能發(fā)揮主要作用。

圖1 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)健靶點(diǎn)獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。節(jié)點(diǎn)為靶蛋白，邊為兩個(gè)蛋白相連，該網(wǎng)絡(luò)中共有155 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 689 條邊，平均度值為34.7。節(jié)點(diǎn)顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，度值越大，顏色越紅，連線越粗。其中度值排名前十的分別為蛋白激酶B1（AKT1）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、牛胱天蛋白酶3（CASP3）、肉瘤病毒17 癌基因（JUN）、絲裂源活化蛋白激酶3（MAPK3）、人表皮生長因子受體（EGFR）、缺氧誘導(dǎo)因子1A（HIF1A）、過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）、前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2），推測主要通過影響這些靶點(diǎn)起到抗LF作用。

圖2 郁金-丁香藥對(duì)靶蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證分子對(duì)接是用以評(píng)價(jià)關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能力的方法，Binding Affinity（kJ∕mol）值代表接配體與受體結(jié)合的能力，結(jié)合能小于0 提示二者可能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于-5 kJ∕mol 時(shí)提示二者可較穩(wěn)定結(jié)合，且結(jié)合能數(shù)值越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，小分子化合物越易與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。對(duì)4個(gè)關(guān)鍵活性成分槲皮素、山柰酚、柚皮素、β-谷甾醇和4 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、IL-6、IL-1β、CASP3 進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)果見表2。對(duì)接結(jié)果表明上述成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能均明顯低于-5 kJ∕mol，對(duì)接緊密，證明了篩選結(jié)果可靠。使用PYMOL 軟件對(duì)結(jié)合力最高的前四組作圖，其結(jié)合模型見圖3。

圖3 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的活性成分與靶點(diǎn)相互作用的分子對(duì)接示意圖：A為蛋白激酶B1與β-甾谷醇；B為蛋白激酶B1與山奈酚；C為蛋白激酶B1與柚皮素；D為蛋白激酶B1與槲皮素

表2 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)關(guān)鍵活性成分分子對(duì)接結(jié)果∕（kJ∕mol）

2.6 GO 富集與KEGG 通路富集結(jié)果155個(gè)潛在靶點(diǎn)經(jīng)GO 富集至1 889條生物學(xué)過程、44條細(xì)胞組分表達(dá)和94 個(gè)分子功能相關(guān)的過程（P＜0.05）中，GO 富集見圖4（每組分選擇P值排名前十）。KEGG信號(hào)通路分析富集獲取信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路143 條（P＜0.05），包括乙肝通路、癌癥通路、腫瘤壞死因子通路等，取P值排名前20的通路繪制成氣泡圖見圖5。

圖4 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)基因本體（GO）富集分析

圖5 郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路

3 討論

3.1 中醫(yī)學(xué)分析丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾［8］，性辛、溫，歸脾、胃、肺、腎經(jīng)，溫中降逆，補(bǔ)腎助陽，主治脾胃虛寒、嘔吐呃逆、食少吐瀉［8］。郁金性辛、苦、寒，歸肝、心、肺經(jīng)，行氣化瘀，清心解郁，利膽退黃，主治胸腹脹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、黃疸癲狂［9］。丁香、郁金二藥相畏使用首見于明代劉純《醫(yī)經(jīng)小學(xué)》“十九畏”［10］，因其藥性乖違，一寒一熱，一走一守，有奪彼功效，相互拮抗之嫌，故被選列為相畏的配伍禁忌。然而，考?xì)v代本草方書，明以前的重要著作如《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草拾遺》《經(jīng)史證類備急本草》《千金要方》《太平惠民合劑局方》《普濟(jì)方》等均無“十九畏”和丁香、郁金二藥相畏的記載。胡方媛等通過數(shù)據(jù)挖掘檢索中國知網(wǎng)（CNKI）和《中醫(yī)方劑大辭典》發(fā)現(xiàn)，丁香-郁金同方配伍的古代方劑有41首，現(xiàn)代方劑更是有231首［11］。如清代孟文瑞《春腳集》中十香返魂丹［12］主治痰厥中風(fēng)方中丁香溫腎化痰，郁金開竅醒神，又加之二藥芳香，同蘇合香、沉香、安息香等十味芳香藥物共奏芳香醒神、開竅救昧之功。再如清代孟河名醫(yī)費(fèi)伯雄《醫(yī)醇剩義》中桂樸湯［13］亦以丁香、郁金同伍，郁金下氣止痛以寬中，丁香溫中散寒以止嘔，共治胃氣虛寒之嘔吐作痛。由此可見，郁金-丁香的配伍古皆有之，無論是從古代文獻(xiàn)還是現(xiàn)代臨床應(yīng)用方面，均可以發(fā)現(xiàn)丁香、郁金同方配伍深具中醫(yī)學(xué)“相反相成”“辨證論治”“法隨證立”“反激逆從”的配伍特點(diǎn)。

肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“肝積”“瘕積”“脅痛”等范疇，氣滯血瘀、肝脾失調(diào)是重要的臨床病機(jī)［14］。從功效上來說，丁香治冷氣腹痛（《藥性論》），止心腹痛（《海藥本草》），溫中快氣，除上焦呃逆，七情五郁（《本草正》）；郁金主血積（《唐本草》），治陽毒入胃（《蘭室秘藏》），治冷氣血積，結(jié)聚氣滯，心腹作痛（《本草正》），故二藥均可治療心腹疼痛、氣血郁結(jié)之證。從氣味理論來說，丁香偏溫偏補(bǔ)偏守，郁金偏寒偏泄偏走，二藥通過合理的配伍，使得寒熱并用，瀉補(bǔ)相合。從“苦欲補(bǔ)瀉”來看，《素問·藏氣法時(shí)論》言“肝欲散，急食辛以散之，用辛補(bǔ)之”“脾苦濕，急食苦以燥之……脾欲緩，……用苦瀉之”，郁金味苦以瀉脾燥濕，丁香味辛以散肝補(bǔ)肝，二藥性味以適肝、脾二臟之性，故而郁金-丁香藥對(duì)的配伍，即可調(diào)和肝脾，以郁金為主藥，丁香發(fā)揮佐使藥“向?qū)ё糁敝Γ孕袣庋鰷?，并溫脾胃元陽，從而達(dá)到較好的助陽化瘀，疏肝行氣之效。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究共納入活性成分12種，根據(jù)藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，郁金-丁香藥對(duì)治療肝纖維化的核心成分為槲皮素、山柰酚、柚皮素、β-谷甾醇。槲皮素能降低血清炎性因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-1 水平，抑制α-肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)起到阻止肝纖維化進(jìn)展和保肝的作用［15］；山柰酚可下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1∕Smads 通路，并在體內(nèi)外抑制肝星狀細(xì)胞活化和膠原合成，有效減輕肝纖維化形成［16］；柚皮素可顯著逆轉(zhuǎn)大鼠血液中的肝酶和促炎細(xì)胞因子，減輕肝損傷和肝纖維化［17］；β-谷甾醇可減輕四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的急慢性肝損傷［18］。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和拓?fù)浞治?，本研究預(yù)測AKT1、IL-6、IL-1、JUN、MAPK3、EGFR、HIF1A 等為郁金-丁香藥對(duì)抗肝纖維化的潛在核心靶點(diǎn)。AKT1是一種絲氨酸∕蘇氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活和增殖［19］，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞中的AKT1 活化，抑制AKT1 可減少TGF-β 1 誘導(dǎo)的纖維化［20］。IL-6 是趨化因子家族中的一種細(xì)胞因子，在人群中發(fā)現(xiàn)其與肝硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［21］。IL-1已被認(rèn)為是慢性肝病炎癥和組織損傷的重要介質(zhì)［22］，與脂肪變性轉(zhuǎn)化為脂肪性肝炎和肝纖維化密切相關(guān)［23］。激活蛋白1（AP-1）是一種二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由JUN和FOS組成［24］，與肝纖維化密切相關(guān)，TGF-β1 的基因轉(zhuǎn)錄是AP-1 依賴性的，抑制AP-1可有效抑制肝纖維化［25-26］。實(shí)驗(yàn)已證明靶向抑制MAPK3 可減弱四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化［27］。表皮生長因子受體EGFR 是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其高表達(dá)與肝損傷、肝纖維化和肝細(xì)胞肝癌密切相關(guān)［28］。通過GO 富集分析可推測，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)主要在脂筏、受體復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等部位發(fā)揮作用，并通過對(duì)營養(yǎng)和脂質(zhì)的應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、氧水平應(yīng)答等生物過程，發(fā)揮RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合特異性DNA 轉(zhuǎn)錄因子、蛋白磷酸酶2A 結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等分子功能。

KEGG 通路富集分析表明，郁金-丁香藥對(duì)可能通過影響TNF 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路等干預(yù)肝纖維化的發(fā)生。TNF-α 是LF 重要的介質(zhì)之一，可作為直接刺激源使HSC 活化并激活腫瘤壞死因子1∕2 型受體（TNFR1∕2），啟 動(dòng)TNF 通路的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活MAPK、核因子κB 等其他促LF 途徑啟動(dòng)或加速LF的進(jìn)程［29］，本研究顯示，郁金-丁香藥對(duì)可能通過靶向作用于AP-1、核因子κB、JNK、AKT 等蛋白調(diào)控TNF 通路干預(yù)肝纖維化的過程。在肝臟受損時(shí)，核因子κB的抑制蛋白IKB磷酸化后被降解，通過經(jīng)典與非經(jīng)典途徑啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在LF 的免疫、炎癥以及氧化應(yīng)激等病理生理過程中起明顯作用［30］，本研究顯示，郁金-丁香藥對(duì)可能通過靶向作用于IL-1、IKB、KB抑制因子激酶（IKK）等靶蛋白，抑制轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生。Toll 樣受體（TLRs）屬于模式識(shí)別受體家族，TLR2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與肝臟炎癥、LF 和肝硬化的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)［31］，本研究顯示，郁金-丁香藥對(duì)可能通過靶向作用于AKT、ERK、JUK 等靶蛋白達(dá)到干預(yù)肝纖維化的作用。HIF-1α 在缺氧與代謝紊亂時(shí)可過表達(dá)，通過調(diào)節(jié)TGF-β1、VEGF、核因子κB 等HSC活化介質(zhì)，參與肝纖維化的形成［32］，本研究顯示，郁金-丁香藥對(duì)可能通過靶向作用于HIF-1α 等靶蛋白，影響活化介質(zhì)的信號(hào)調(diào)控過程，達(dá)到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，本研究從中醫(yī)理論和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方面對(duì)郁金-丁香藥對(duì)治療LF 的可能機(jī)制進(jìn)行了闡述，郁金-丁香藥對(duì)是通過多種活性成分作用于多靶點(diǎn)、多途徑、多通路起到干預(yù)LF的功效，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)，也為郁金丁香同方配伍內(nèi)涵的進(jìn)一步探索及其臨床應(yīng)用提供了參考和思路。未來團(tuán)隊(duì)將從上述關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分的結(jié)合以及關(guān)鍵療效通路出發(fā)，對(duì)二者治療肝纖維化的作用進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究。

（本文圖1，2見插圖6-1；圖3～5見插圖6-2）