久西加 王玉輝 陳紅剛，2 王惠珍，2 曾翠云，2 杜 弢，2*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，和政 731200；2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，蘭州 730000）

桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）為小檗科（Berberidaceae）桃兒七屬（Sinopodophyllum）多年生草本植物，主要分布于我國陜西、甘肅、青海、云南、四川和西藏等地［1］，其果實及根莖均能入藥，具有祛風除濕、調(diào)經(jīng)活血功效［2］。但近年來由于原生生境的破壞及市場需求量的增多導(dǎo)致其資源匱乏，目前被列為國家二級瀕危保護植物［3］。當前利用種子進行繁殖是解決桃兒七資源問題的有效方法之一，但其種子容易失活，不易保存，嚴重制約了擴繁生產(chǎn)。

超低溫冷凍技術(shù)可以安全地保存許多植物的種子、花粉、胚及其繁殖體［4］。而針對種子的超低溫保存同樣是珍稀瀕危植物離位保存的重要方式，也是實現(xiàn)種質(zhì)資源長期保存的重要手段。在種子的超低溫保存中，種子含水量是影響保存效果的關(guān)鍵因素。種子含水量過高時，超低溫保存會在細胞中形成冰晶體，導(dǎo)致凍結(jié)危害，而含水量過低時，又會導(dǎo)致細胞水分大量流失，從而降低種子活力［5］。馬尾松（Pinus massoniana）種子的含水量在6.1%時，其細胞抗氧化能力強，膜系統(tǒng)損傷小，細胞代謝旺盛，超低溫保存效果較好［6］。而九里香（Murraya exotica）種子含水量在7%時最適宜進行超低溫冷凍保存［7］。另外，適宜的冷凍方式也是決定超低溫保存是否有效的關(guān)鍵因素，緩慢冷凍法具有良好的脫水效果，直接冷凍法則可以極大地避免迅速降溫帶來的細胞傷害，而玻璃化冷凍法則可以使材料進入玻璃態(tài)，從而對材料起到保護作用［8］。如快速冷凍法是羯布羅香（Dipterocarpus turbinatus）種子進行超低溫保存的最佳冷凍方式［9］，而高良姜（Alpinia officinarum）種子則最適宜玻璃化冷凍保存［10］，目前桃兒七主要通過種子進行擴繁生產(chǎn)，且前人對于桃兒七種子的研究主要集中于其休眠機理的探索，對于其種子超低溫保存條件的研究鮮見報道，研究桃兒七種子的超低溫保存條件具有一定的現(xiàn)實意義。因此本研究通過測定不同含水量的桃兒七種子經(jīng)3 種不同冷凍方式冷凍前后的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性，丙二醛（MDA）、總蛋白（TP）、可溶性淀粉、可溶性糖含量以及種子生活力等的變化，并利用熵權(quán)TOPSIS 法進行綜合評價，旨在從生理生化的角度探索適宜桃兒七種子的超低溫保存條件，為實現(xiàn)其種質(zhì)資源的長期保存提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

桃兒七種子采于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園（35°15′48″N，103°24′21″E），并由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杜弢教授鑒定確認。種子經(jīng)清水浸泡揉搓，去掉果肉，過篩剔除癟粒和缺損的壞粒，自然陰干，置于冰箱中4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 浸泡法和硅膠干燥法處理桃兒七種子

將桃兒七種子分為4組，每組10～15 g，分別采用硅膠干燥2 h、自然陰干及浸泡2 h 和5 h 等方式獲得含水量分別為1.6%、9.6%、20.9%和30.5%的桃兒七種子。含水量的測定依據(jù)國家農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T 3543.6 進行。各含水量種子設(shè)對照組和處理組，對照組直接進行指標測定，處理組經(jīng)超低溫保存后進行指標測定。

1.3 種子超低溫冷凍處理

冷凍處理分為3 組，分別為直接冷凍組、緩慢冷凍組和玻璃化冷凍組。

直接冷凍組：將放有桃兒七種子的冷凍保存管不經(jīng)過任何試劑處理直接投入-196 ℃液氮冷凍保存7 d后取出待測。

緩慢冷凍組：將桃兒七種子放入加有冷凍保護劑PVS2 的凍存管中，先置于冰箱中4 ℃處理30 min，取出后立即放入冰箱中-20 ℃冷凍60 min，而后迅速投入液氮罐內(nèi)保存7 d后取出待測。

玻璃化冷凍組：將桃兒七種子放入加有裝載液LS 的凍存管中，常溫下處理20 min 后，傾倒裝載液LS，加入冷凍保護劑PVS2并放置于冰上冷凍30 min，而后更換成新鮮的預(yù)冷過的PVS2（0 ℃），并迅速投入至液氮罐中保存7 d后取出待測。

冷凍保護劑（PVS2）為30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol·L-1蔗糖的Murashige-Skoog（MS）液體培養(yǎng)基，裝載液LS 為2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。

1.4 解凍處理

將經(jīng)過超低溫保存的桃兒七種子從液氮（-196 ℃）中取出，迅速投入水浴中40 ℃解凍10 min，其中玻璃化冷凍組和緩慢冷凍組用洗滌溶液US（含1.2 mol·L-1蔗糖的MS 溶液）洗滌10 min，蒸餾水清洗浸泡種子3次，每次2 min，用濾紙擦干種子表面的水分后待測。

1.5 種子生活力的測定

選取對照組和處理組種子各50粒進行種子生活力的測定，3次重復(fù)。采用TTC 染色法測定種子生活力。

1.6 相關(guān)生理指標的測定

對照組和處理組種子經(jīng)液氮研磨后，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒對可溶性糖、淀粉、總蛋白、過氧化物酶、超氧化物歧化酶及丙二醛的含量進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS26.0 軟件進行方差分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，并用Duncan 法進行多重比較；利用SPSSAU 平臺對數(shù)據(jù)進行正/逆向化和標準化處理，再進行熵權(quán)TOPSIS 分析；采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水量及超低溫冷凍方式對種子生活力的影響

由圖1 可知，4 種含水量的桃兒七種子經(jīng)不同的超低溫冷凍方式保存后，其種子生活力均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中含水量為1.6%、9.6%和20.9%的桃兒七種子經(jīng)緩慢冷凍后其種子生活力相較對照組無顯著變化（P＞0.05），生活力均在82%以上。而含水量為30.5%的桃兒七種子不論經(jīng)過何種超低溫冷凍方式保存后，其種子生活力均呈現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），且降幅明顯。

2.2 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)可溶性糖含量的影響

由圖2 可知，4 種含水量的桃兒七種子經(jīng)不同的超低溫冷凍方式保存后，種子內(nèi)可溶性糖含量均顯著上升（P＜0.05），其中含水量為9.6%的種子經(jīng)直接冷凍后，可溶性糖含量較對照組增幅最大，而含水量為1.6%、20.9%、30.5%的種子經(jīng)玻璃化冷凍后可溶性糖含量增幅最大。

圖2 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)可溶性糖的含量變化Fig.2 Changes of soluble sugar content in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.3 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)淀粉含量的影響

圖3顯示，除含水量為20.9%的桃兒七種子經(jīng)直接冷凍后，淀粉含量顯著上升（P＜0.05）外，其余各處理組種子內(nèi)淀粉含量較對照組均顯著下降（P＜0.05）；含水量為1.6%的種子總體降幅最大，其中經(jīng)直接冷凍后的種子內(nèi)淀粉質(zhì)量分數(shù)降至172.71 mg·g-1；而含水量為9.6%和30.5%經(jīng)玻璃化冷凍后，其降幅較其他處理組較小。

圖3 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)淀粉的含量變化Fig.3 Changes of starch content in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.4 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)總蛋白含量的影響

圖4 顯示，含水量為9.6%、20.9%的桃兒七種子經(jīng)超低溫保存后，種子內(nèi)總蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)均較對照顯著升高（P＜0.05），且均以緩慢冷凍組增幅最大，分別增至12.10、16.16 mg·g-1；而含水量為1.6%和30.5%的種子隨冷凍方式的不同，蛋白質(zhì)含量變化呈現(xiàn)不同的趨勢，其中含水量為1.6%的種子經(jīng)玻璃化冷凍后較對照顯著上升（P＜0.05），增幅達179.65%。而含水量為30.5%的種子經(jīng)直接冷凍后，蛋白質(zhì)含量較對照顯著上升（P＜0.05），經(jīng)玻璃化冷凍后顯著下降（P＜0.05），但緩慢冷凍組較對照無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)總蛋白的含量變化Fig.4 Changes of total protein content in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.5 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)過氧化物酶活性的影響

如圖5 所示，除含水量為1.6%的桃兒七種子外，其余各含水量的桃兒七種子經(jīng)超低溫保存后，種子內(nèi)POD 活性均呈現(xiàn)下降趨勢；其中含水量為20.9%的種子經(jīng)緩慢冷凍后降幅最大，為251.23%（P＜0.05）；含水量為30.5%的種子經(jīng)玻璃化冷凍后，種子內(nèi)POD 活性較對照無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)POD 的活性變化Fig.5 Changes of POD activity in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.6 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響

由圖6 可知，含水量為20.9%的桃兒七種子，各處理間的SOD 活性較對照均無顯著差異（P＞0.05）；其余含水量的種子經(jīng)超低溫冷凍保存后，SOD 活性較對照總體均呈下降趨勢；含水量為1.6%的種子經(jīng)玻璃化冷凍后，SOD 活性較對照無顯著變化；而含水量為9.6%以及30.5%的種子在3種冷凍方式下均較對照顯著下降，其中含水量為30.5%的種子經(jīng)玻璃化冷凍后降幅最大。

圖6 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)SOD 的活性變化Fig.6 Changes of SOD activity in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.7 含水量及超低溫冷凍方式對種子內(nèi)丙二醛含量的影響

圖7 顯示含水量為9.6%、20.9%的桃兒七種子，各處理組的MDA 含量較對照組均呈現(xiàn)下降趨勢，且均以緩慢冷凍組降幅最大；含水量為1.6%的種子經(jīng)直接冷凍或者緩慢冷凍后，種子內(nèi)MDA含量顯著上升，而經(jīng)玻璃化冷凍后又顯著下降；含水量為30.5%的種子經(jīng)緩慢冷凍或者玻璃化冷凍后，MDA含量顯著上升，其中玻璃化冷凍組種子內(nèi)的MAD質(zhì)量摩爾濃度增至27.56 nmol·mg-1。

圖7 不同含水量及超低溫冷凍方式下種子內(nèi)MDA 的含量變化Fig.7 Changes of MDA content in seeds under different water content and ultra-low temperature freezing methods

2.8 熵權(quán)TOPSIS分析

由于單一指標無法較好地衡量最佳的種子含水量和超低溫冷凍方式，故引入熵權(quán)TOPSIS 模型對各處理組進行綜合評價。以不同處理方式為組別，以7個相關(guān)指標與其對照組的差值建立評價不同含水量及不同冷凍方式下桃兒七種子的初始化決策矩陣。其中種子內(nèi)可溶性糖含量、淀粉含量、總蛋白質(zhì)含量3種營養(yǎng)物質(zhì)，POD 和SOD 2種抗氧化系統(tǒng)酶，其指標為越大越優(yōu)型，而種子生活力及MDA則為越小越優(yōu)型指標。需先對變量進行逆向化處理，最后通過歸一化處理計算分析得到權(quán)重（見表1）及評價結(jié)果（見表2）。表2 結(jié)果表明，本試驗中不同處理組綜合排序靠前的分別是含水量為1.6%的玻璃化冷凍組種子，含水量為9.6%的直接冷凍組和緩慢冷凍組的種子。

表1 熵值法計算權(quán)重結(jié)果Table 1 Results of weight calculation by entropy method

表2 TOPSIS評價計算結(jié)果Table 2 Calculation results of TOPSIS evaluation

3 討論

3.1 基于種子生活力的桃兒七種子超低溫保存條件篩選

種子生活力是種子潛在萌發(fā)能力的體現(xiàn)，研究表明，超低溫保存能使一些短命性種質(zhì)資源（蔥韭類種子）［11］和具有休眠特性的種質(zhì)資源——紅豆杉（Taxus wallichianavar.chinensis）種子［12］長期保持種子生活力。然而在利用超低溫保存技術(shù)保存種子的過程中，含水量會對保存后的種子生活力產(chǎn)生極大的影響，如不同含水量的樟樹（Cinnamomum camphora）種子經(jīng)超低溫保存后，種子內(nèi)的脫氫酶活性及相對電導(dǎo)率均呈現(xiàn)極顯著的差異［13］。肉豆蔻（Myristica fragrans）種子在含水量為27.15%時經(jīng)超低溫保存后，種子生活力降幅最?。?4］。本研究結(jié)果表明，含水量為1.6%、9.6%和20.9%的桃兒七種子經(jīng)緩慢冷凍后，種子生活力保持較好，較對照無顯著差異（P＜0.05），說明1.6%～20.9%的種子含水量以及緩慢冷凍方式是桃兒七種子適宜的超低溫保存條件。

3.2 基于營養(yǎng)物質(zhì)的桃兒七種子超低溫保存條件篩選

可溶性糖、淀粉及蛋白質(zhì)都是種子內(nèi)重要的原料物質(zhì)，為種子的萌發(fā)提供能量［15］。種子經(jīng)超低溫保存后，仍具有充足的營養(yǎng)物質(zhì)是其再次恢復(fù)活性的關(guān)鍵。同時，在植物細胞中，可溶性糖和蛋白質(zhì)是保護性物質(zhì)之一，在植物遭受高溫或者低溫脅迫時大量積累，并通過增加細胞液濃度，降低細胞滲透勢等方式提高環(huán)境耐性［16-17］。研究表明［18］，含水量3.6%玉蟬花（Iris ensata）種子經(jīng)超低溫保存后種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)顯著高于其他處理組；馬尾松種子在含水量為6.1%時，經(jīng)超低溫保存后可溶性糖、可溶性蛋白含量均達到最大［6］。本研究結(jié)果表明4 種含水量的桃兒七種子經(jīng)超低溫保存后種子內(nèi)可溶性糖和總蛋白質(zhì)含量總體呈上升趨勢，且含水量為9.6%的桃兒七種子，經(jīng)直接冷凍后，可溶性糖含量較對照顯著升高，經(jīng)緩慢冷凍后其總蛋白質(zhì)含量增幅最大，但各含水量種子經(jīng)超低溫保存后種子內(nèi)淀粉含量總體呈下降趨勢。這可能是由于種子遭遇低溫環(huán)境后，促使淀粉在α-淀粉酶的作用下分解為可溶性糖，用以提高種子抗逆性的結(jié)果。就種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的變化而言，含水量為9.6%的桃兒七種子經(jīng)直接冷凍或緩慢冷凍為最佳的超低溫保存條件。

3.3 基于抗氧化系統(tǒng)的桃兒七種子超低溫保存條件篩選

SOD 和POD 在種子中的功能多樣，能夠參與生長素的代謝、細胞壁的延伸和加厚、活性氧和活性氮的代謝以及植物的抗病作用等各種生理活動［19］。同時，SOD 和POD 也能清除在迅速降溫過程中由活性氧導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和細胞毒害作用，而丙二醛是脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，能抑制細胞保護酶的活性，從而降低抗氧化物的含量，其含量經(jīng)常被看作是植物遭受逆境傷害的指標［20］，SOD、POD活性與MDA含量之間的平衡關(guān)系直接決定著植物細胞內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能。研究表明［21］，益智（Alpinia oxyphylla）種子中MDA 及SOD 的含量隨超低溫冷凍時間的延長呈上升趨勢，SOD 含量的增加減輕了低溫帶來的膜質(zhì)過氧化作用；高山栲（Castanopsis delavayi）種子中MDA 含量經(jīng)超低溫冷凍保存后呈上升趨勢，但在含水量為20.36%的種子中增幅最?。?2］，MDA 所造成的毒害作用也最弱；同樣，胡楊（Populus euphratica）種子經(jīng)超低溫保存后MDA 含量也呈上升趨勢，但含水量為4.30%時，種子中SOD 活性最高，從而抑制了MDA 的產(chǎn)生［23］。本研究結(jié)果表明，除含水量為1.6%的桃兒七種子經(jīng)緩慢冷凍后，POD活性顯著上升（P＜0.05）外，其余各處理組種子中SOD及POD活性均呈下降趨勢。說明各含水量桃兒七種子在超低溫保存后均受到一定程度的冷害損傷，使種子內(nèi)活性氧水平升高，抗氧化酶活性降低。但MDA含量除在含水量為30.5%的種子中上升外，在其余各含水量種子中均保持平穩(wěn)或下降趨勢。這可能是桃兒七種子經(jīng)超低溫保存后，可溶性糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)和過氧化物系統(tǒng)以互補的方式共同發(fā)揮作用，從而維持植物細胞中的活性氧穩(wěn)態(tài)，抵抗低溫導(dǎo)致的細胞損害的結(jié)果。

4 結(jié)論

為了綜合衡量出適宜桃兒七種子的超低溫保存條件，本試驗引入TOPSIS模型對各處理組的7個指標進行分析。結(jié)果表明，含水量為1.6%的桃兒七種子經(jīng)玻璃化冷凍或含水量為9.6%的種子經(jīng)直接冷凍或緩慢冷凍為桃兒七種子最佳的超低溫保存條件。但含水量為9.6%的種子為自然陰干，且直接冷凍法和緩慢冷凍法較玻璃化冷凍法在實際操作中更為便捷。綜上，桃兒七種子液氮超低溫保存技術(shù)是可行的，且種子經(jīng)自然陰干后采用直接冷凍法或緩慢冷凍法是最適宜的超低溫冷凍保存條件。