張亞利 楊耐英 宋 垚 李湘鵬 郭衛(wèi)珍 蔡友銘*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201403；2.上海師范大學(xué)，上海 200231；3.上海植物園，上海 200231；4.湖南省森林植物園，長沙 410116）

連蕊茶組（CamelliaSect.Theopsis）和毛蕊茶組（CamelliaSect.Eriandria）隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），2 組植物具有開花繁密、芳香、抗花腐病等觀賞性及適應(yīng)性，隨著其在種質(zhì)創(chuàng)新等應(yīng)用中的不斷發(fā)展，逐漸受到研究者及應(yīng)用者的關(guān)注［1-3］。在已有的分類系統(tǒng)中，根據(jù)Sealy［4］的分類系統(tǒng)，連蕊茶組29 種，毛蕊茶組6 種；按照張宏達(dá)［5］分類系統(tǒng)，連蕊茶組植物48 種，毛蕊茶組15 種；閔天祿［6］分類學(xué)系統(tǒng)，連蕊茶組19 種，毛蕊茶組9 種。由此可見3 個(gè)分類系統(tǒng)在種類劃分等方面存在分歧，給2組植物的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究造成困擾。因此，除了利用常規(guī)形態(tài)學(xué)等分類手段外，可增加更細(xì)微的形態(tài)特征觀測，有助于解決現(xiàn)有的分類學(xué)問題。

花粉形態(tài)可以為植物分類鑒定提供依據(jù)，同時(shí)也為植物系統(tǒng)發(fā)育研究提供信息。目前，已有山茶屬（Sect.Camellia）、山茶屬短柱茶組（Sect.Paracamellia）、紅山茶組（Sect.Camellia）、油茶組（Sect.Oleifera）、金花茶組（Sect.Chrysantha）等組植物的花粉形態(tài)在分類、演化關(guān)系等方面的報(bào)道［7-11］。在山茶屬連蕊茶組和毛蕊茶組的研究中［7，12-16］，韋仲新、薛曉明等報(bào)道了連蕊茶組13 種、毛蕊茶組3 種，但鮮見關(guān)于2 組植物花粉形態(tài)在系統(tǒng)演化等方面的研究報(bào)道。

本研究以20種連蕊茶組和毛蕊茶組植物的花粉為試驗(yàn)材料，觀察其形態(tài)特征，并對(duì)其在系統(tǒng)演化、分類鑒定等方面進(jìn)行探討，為進(jìn)一步的種質(zhì)創(chuàng)新等應(yīng)用研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料于2017—2022年野外采集并遷地栽培于上海植物園或上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室，栽培環(huán)境和養(yǎng)護(hù)條件一致。憑證標(biāo)本保存于上海辰山植物園標(biāo)本館（CSH）。試驗(yàn)材料信息見表1。

表1 20種（變種）連蕊茶組和毛蕊茶組植物信息Table 1 Information of 20 species of Sect.Theopsis and Sect. Eriandria

1.2 方法

1.2.1 花粉采集與處理

在晴天的09：00—10：00 采集初開的花朵，每次取樣標(biāo)注采集時(shí)間和采集花朵數(shù)量，每種采集花粉的總花朵數(shù)量在15 朵以上。將每次采集的花粉用硫酸紙包裝好并做標(biāo)記放入硅膠進(jìn)行干燥，干燥過程中檢查硅膠狀態(tài)并在硅膠50%以上變色時(shí)及時(shí)更換。測試前將同一樣品的干燥花粉裝入1.5 mL離心管混勻，加入丙酮漂洗30～60 s，然后靜止1～2 min，待花粉沉淀后，棄上清，將離心管蓋子打開置于恒溫干燥箱中（溫度25 ℃）干燥1 h，取出后蓋好蓋子放于干燥劑中，然后進(jìn)行上機(jī)前處理。

1.2.2 掃描電鏡樣品制樣

用牙簽將花粉均勻地鋪于樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹掉粘貼不甚牢固的花粉，使用日立離子濺射儀（E1045，日本）進(jìn)行噴金（參數(shù)設(shè)置為Sputter Current：15 mA；Sputter Time：120 s；Tooling Factor：2.3），噴金后在日立場發(fā)式掃描電子顯微鏡（SU8010，日本）下觀察并拍照。

觀察內(nèi)容主要包括花粉群體、花粉個(gè)體和花粉外壁紋飾?；ǚ廴后w：400 倍鏡下拍攝，用于統(tǒng)計(jì)花粉的極軸長（P值）與赤道軸長（E值）。花粉個(gè)體：1 500 倍鏡下拍攝赤道面，2 000 倍鏡下拍攝極軸面，用于描述花粉赤道面觀和極面觀的花粉形態(tài)?；ǚ弁獗诩y飾：1 5000 倍下拍攝，用于描述花粉的外壁紋飾，及統(tǒng)計(jì)顆粒狀附屬物的分布密度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

花粉極軸和赤道軸長度采用Karyotype Analysis 2.0 進(jìn)行測量，每個(gè)樣本隨機(jī)采集50 粒花粉的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析；花粉外壁紋飾的顆粒密度隨機(jī)統(tǒng)計(jì)15 處1 μm2內(nèi)的顆粒數(shù)量用于分析，＜10粒/μm2為稀疏，10～20粒/μm2為中等，＞20/μm2為密集；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel 2007、R4.1.3 進(jìn)行差異顯著性分析及UPGMA聚類分析。

花粉形態(tài)描述主要參考王開發(fā)等［17］的《孢粉學(xué)概論》，及《圖解花粉術(shù)語》［18］中的名詞術(shù)語和定義。

2 結(jié)果與分析

2.1 連蕊茶組和毛蕊茶組植物的花粉形狀和大小

根據(jù)王開發(fā)等［17］對(duì)花粉形狀的描述標(biāo)準(zhǔn)，連蕊茶組和毛蕊茶組20 種植物花粉的P/E值為1.14～2.00（表2），花粉形狀為長球形；其萌發(fā)孔類型均為3 孔溝型，花粉溝長達(dá)極且深裂，極面觀為三裂圓形（圖版Ⅰ）。從表2可見，20種植物的花粉極軸長和赤道軸長為（44.16～61.46）μm×（27.09～38.89）μm，按照花粉大小的等級(jí)劃分屬于中型（25～50 μm）或大型花粉（50～100 μm）［17］。

圖版Ⅰ 20種連蕊茶組和毛蕊茶組植物的花粉形態(tài)Plate Ⅰ Pollen morphology of 20 species of Camellia Sect. Theopsis and Camellia Sect.Eriandria

表2 20種連蕊茶組和毛蕊茶組植物的花粉形態(tài)特征Table 2 Pollen morphological characters of 20 species of Sect.Theopsis and Sect. Eriandria

結(jié)合花粉P值、E值和P/E值的測定結(jié)果對(duì)花粉大小進(jìn)行聚類分析顯示（圖1），20種植物的花粉大小在距離為25 處可分為2 大類。蒙自連蕊茶（C.forrestii）、作孚連蕊茶（C.tsofuii）、柃葉連蕊茶（C.euryoides）、尖連蕊茶（C.cuspidata）、四川毛蕊茶（C.lawii）、毛枝連蕊茶（C.trichoclada）、荔波連蕊茶（C.lipoensis）、光萼心葉毛蕊茶（C.cordifoliavar.glabrisepala）、浙江尖連蕊茶（C.cuspidatavar.chekiangensis）和毛花連蕊茶（C.fraterna）10 種（變種）聚為一類，其花粉的P值均大于50 μm，E值大于30 μm，按照花粉大小的等級(jí)劃分屬于大花粉（50～100 μm），其中毛花連蕊茶的花粉大小為（52.71～71.20）μm×（34.37～43.52）μm，為20種植物中花粉P值最大的1 種（圖1）。其他10 種植物聚為一類，在這一類中，除了廣東毛蕊茶（C.melliana）的 花 粉P值 為（48.98±2.22）μm，E值 為（29.95±2.00）μm，小果毛蕊茶（C.villicarpa）的花粉P值為（51.33±2.77）μm，E值為（27.68±1.85）μm，其余8 種植物的花粉P值均小于50 μm，E值小于30 μm，屬于中等花粉（25～50 μm），其中長管連蕊茶（C.elongata）的P值最小，為（44.16±1.72）μm，屬于20種供試材料中花粉最小的1種。

圖1 基于花粉大小的連蕊茶組和毛蕊茶組20種植物聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 20 species of Camellia Sect. Theopsis and Camellia Sect.Eriandria based on pollen size

2.2 連蕊茶組和毛蕊茶組花粉的外壁紋飾

從連蕊茶組和毛蕊茶組20種植物的外壁紋飾可見，孔穴是20種植物外壁紋飾共有的結(jié)構(gòu)（圖版Ⅰ），在此基礎(chǔ)上，根據(jù)其孔穴以外表面的雕紋可以將其外壁紋飾分為以下3類。

（1）孔穴狀紋飾：孢粉表面分布大小不一的孔穴，分布數(shù)量較多，不規(guī)則，孔穴以外的表面無附屬物，近光滑，呈波浪狀。長管連蕊茶（圖版Ⅰ：3）屬于此類型。

（2）顆粒狀紋飾：在孔穴以外的孢粉表面上分布著疏密不等的顆粒突起或呈現(xiàn)顆粒狀的雕紋。屬于此花粉紋飾的植物有17 種（變種），是種類最多的一類花粉外壁紋飾特征。在該類型紋飾中，顆粒的分布密度存在差異，可以分為稀疏、中等和密集3種類型：其中尖連蕊茶、浙江尖連蕊茶、柃葉連蕊茶、毛花連蕊茶、毛枝連蕊茶、四川毛蕊茶和柳葉毛蕊茶（圖版Ⅰ：1～2，4，7，10，16～17）顆粒的分布密度稀疏；荔波連蕊茶、川鄂連蕊茶、作孚連蕊茶、心葉毛蕊茶、光萼心葉毛蕊茶、斑枝毛蕊茶、廣東毛蕊茶和小果毛蕊茶為中等密度（圖版Ⅰ：8～9，13～15，18～20）；金屏連蕊茶（C.tsingpienensis）和毛萼金屏連蕊茶（圖版Ⅰ：11～12）的顆粒分布密度為密集。

（3）疣狀紋飾：孔穴以外的孢粉表面分布不規(guī)則的塊狀突起，突起的寬度一般大于高度，頂扁平。蒙自連蕊茶和尖萼蒙自連蕊茶（圖版Ⅰ：5～6）屬于此類型。

3 討論

3.1 連蕊茶組和毛蕊茶組植物的花粉形態(tài)特征

在報(bào)道的連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉大小方面，主要為大花粉（直徑50～100 μm），也會(huì)有中等（直徑25～50 μm）或很大（直徑100～200 μm）的類型，如毛花連蕊茶新鮮花粉的大小為106.8 μm（91.5～114.5 μm）× 58.6 μm（53.0～63.5 μm），柃葉連蕊茶新鮮花粉的大小為98.3μm（91.5～106.0 μm）× 56.0 μm（51.0～61.5 μm）明顯大于本研究中的花粉大小［14］，推測與研究樣本及觀測方法有關(guān)。川鄂連蕊茶采用醋酸酐方法處理后的花粉形態(tài)為扁球形，花粉粒大小為29.13 μm×40.33 μm，與本研究的（43.56～52.28）μm×（25.54～32.07）μm存在明顯差異，分析其原因主要與處理方法有關(guān)，花粉在遇水后吸水膨大，進(jìn)而成扁球形［13］。薛曉明等［12］報(bào) 道 的 蒙 自 連 蕊 茶 極 軸 長62.3 μm（59.9～64.4 μm），赤道軸長32.7 μm（30.6～34.9 μm），P/E值為1.91，與 本 研 究 的P值56.13 μm（48.72～62.22 μm）、E值30.76 μm（23.77～36.04 μm）接近。黃華等［19］關(guān)于淫羊藿屬（Epimedium）的研究表明，以往淫羊藿屬孢粉學(xué)研究往往忽略“居群”概念，以單一產(chǎn)地的少量個(gè)體代表整個(gè)物種，導(dǎo)致不同學(xué)者對(duì)同一物種花粉形態(tài)描述存在較大差異。由此可見，處理方法、采集樣本等外因和內(nèi)因均會(huì)對(duì)花粉大小產(chǎn)生影響。

在花粉的外壁紋飾上，韋仲新等［7］報(bào)道的3 種連蕊茶組植物和1 種毛蕊茶組植物的外壁紋飾為皺溝狀紋飾。敖成齊等［16］研究的連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉外壁紋飾主要為顆粒-皺顆粒型。李廣清等［14］將研究的6 種連蕊茶組植物的花粉外壁紋飾分為皺波狀、不規(guī)則皺網(wǎng)狀、腦紋狀和穴狀4 種類型。薛曉明等［12］對(duì)2 個(gè)連蕊茶組植物花粉外壁紋飾描述為皺波狀和皺網(wǎng)狀。綜上，已報(bào)道的連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉外壁紋飾存在諸多不同描述，本研究以供試的20 種（變種）山茶屬植物花粉共有的孔穴結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，以孔穴以外的孢粉表面光滑、具顆粒、疣狀等紋飾作為分類的主要特征，將花粉外壁紋飾分為孔穴狀、顆粒狀和疣狀紋飾3 類，從而為進(jìn)一步系統(tǒng)地開展2 組植物的花粉外壁紋飾描述提供依據(jù)。此外，從本研究20種（變種）山茶屬植物花粉大小的聚類分析結(jié)果來看，花粉大小與花粉外壁紋飾類型之間尚未見明顯的相關(guān)性。

3.2 連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉形態(tài)特征的系統(tǒng)進(jìn)化趨勢(shì)

前人研究認(rèn)為花粉大小的進(jìn)化方向?yàn)橛纱蟮叫。ǚ弁獗诩y飾進(jìn)化方向?yàn)楸砻婀饣籽睢鷹l紋→網(wǎng)狀紋飾→網(wǎng)狀雕紋→網(wǎng)狀紋飾［20-21］。在山茶屬的系統(tǒng)進(jìn)化趨勢(shì)中，束際林等［22］在對(duì)茶組（Sect.Thea）植物花粉外壁紋飾的研究認(rèn)為，茶樹光滑型的紋飾應(yīng)屬于原始特征，而粗糙型或具疣則屬于進(jìn)化類型。倪穗等［9］對(duì)紅山茶組（Sect.Camellia）花粉外壁紋飾的研究認(rèn)為，紅山茶組植物花粉的類型演化趨勢(shì)為：光滑→皺溝狀→皺波狀→皺波狀致顆粒狀→顆粒狀→網(wǎng)狀。本研究中20種連蕊茶組和毛蕊茶植物的花粉大小從大型花粉到中型花粉，其中，毛花連蕊茶的花粉最大，在供試材料中屬于較為原始的種，長管連蕊茶的花粉最小，為花粉大小進(jìn)化的前進(jìn)方向。在花粉外壁紋飾方面，在孔穴狀、顆粒狀和疣狀紋飾3 種類型中，以顆粒狀紋飾居多，結(jié)合茶組及紅山組花粉類型的演化趨勢(shì)，連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉類型的演化趨勢(shì)為：僅具有孔穴結(jié)構(gòu)的孔穴狀紋飾為原始特征，如長管連蕊茶，其次為顆粒狀紋飾，最為進(jìn)化的是疣狀紋飾，其代表為蒙自連蕊茶和尖萼蒙自連蕊茶。

3.3 連蕊茶組和毛蕊茶組植物的分類探討

花粉的形狀、大小、外壁紋飾等具有種的特異性，可用作植物識(shí)別或鑒定的分類依據(jù)［23］。在本研究的20 種（變種）供試材料中，柳葉毛蕊茶和廣東毛蕊茶等7 種（變種）與連蕊茶組的10 種植物的花粉外壁紋飾均為顆粒狀紋飾，無法從花粉形態(tài)特征上將其與連蕊茶組區(qū)分開。在連蕊茶組和毛蕊組的分類探討中，呂林玲［24］對(duì)2 組植物3 個(gè)葉綠體基因片段和江正棟［25］對(duì)葉綠體的系統(tǒng)發(fā)育分析中，均顯示出連蕊茶組和毛蕊茶組為一自然單系類群。本研究的結(jié)果初步顯示，毛蕊茶組植物花粉的外壁紋飾不具有組的特異性，從花粉外壁紋飾特征的角度支持連蕊茶組和毛蕊茶組植物為單系類群的觀點(diǎn)。

進(jìn)一步，在種的分類中，現(xiàn)有的3 個(gè)主要分類系統(tǒng)在種類劃分上存在諸多分歧。本研究中，蒙自連蕊茶和尖萼蒙自連蕊茶除了在地理分布、形態(tài)特征上具有相似性之外，其花粉外壁紋飾均為疣狀紋飾，Chang H T［5］及閔天祿［6］將C.acutisepalaH.T.Tsai & K.M.Feng 作為C.forrestiivar.acutisepala（H.T.Tsai & K.M.Feng）Hung T.Chang 尖萼蒙自連蕊茶的分類觀點(diǎn)一致。在心葉毛蕊茶的形態(tài)描述中，Sealy［4］及Chang H T［5］均提及該種存在連續(xù)變異，閔天祿［6］將萼片無毛的變異定名為C.cordifoliavar.glabrisepalaT.L.Ming 光萼心葉毛蕊茶，本研究采自廣東乳源同一居群的材料顯示，兩者的花粉大小及外壁紋飾一致，從花粉形態(tài)的角度支持閔天祿［6］的分類觀點(diǎn)。此外，閔天祿［6］將荔波連蕊茶歸并為C.rosthornianaHand.-Mazz.川鄂連蕊茶、作孚連蕊茶歸并為C.euryoidesvar.nokoensisY.C.Liu毛蕊柃葉連蕊茶。本文花粉形態(tài)特征的結(jié)果顯示其花粉大小，尤其是外壁紋飾特征存在明顯不同，因此作孚連蕊茶和荔波連蕊茶的分類地位還有待進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

對(duì)20種（變種）山茶屬連蕊茶組和毛蕊茶組植物花粉的研究表明：花粉大小及外壁紋飾可為系統(tǒng)進(jìn)化、分類鑒定及親緣關(guān)系分析提供參考依據(jù)，尤其是花粉外壁紋飾。研究的20種（變種）植物的花粉外壁紋飾主要包括孔穴狀、顆粒狀和皺疣狀紋飾3 種類型，其花粉外壁紋飾的演化趨勢(shì)為：孔穴狀→顆粒狀→疣狀。在山茶屬連蕊茶組和毛蕊茶組的分類中，花粉形態(tài)特征支持現(xiàn)有報(bào)到的連蕊茶組和毛蕊茶組植物為單系類群的觀點(diǎn)，支持尖連蕊茶、蒙自連蕊茶、金屏連蕊茶及心葉毛蕊茶及其變種的分類觀點(diǎn)；但作孚連蕊茶和荔波連蕊茶作為變種處理的觀點(diǎn)有待進(jìn)一步探討。