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黃精雙向液體發(fā)酵的菌種優(yōu)選及培養(yǎng)基優(yōu)化研究

2023-05-22 06:41:32馬緒民孫加龍韓春超顧正位
關(guān)鍵詞:雞腿菇菌絲體黃精

馬緒民,孫加龍,韓春超,顧正位

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250355; 2.泰安市東麒健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 泰安 271000)

黃精(Polygonati Rhizoma)藥材來源于百合科黃精屬植物黃精,是傳統(tǒng)的藥食同源中藥,具有很好的藥用和食用價值[1-2]。 雞腿菇[Coprinus comatus(Muell.ex Fr.) Gray],學(xué)名毛頭鬼傘,是16 種珍稀食用菌之一[3]。 蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link],又稱北蟲草,為藥食兩用真菌,含有豐富的藥理活性物質(zhì),現(xiàn)代研究多集中于其保健和藥用方面[4-5]。秀珍菇[Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél]學(xué)名肺形側(cè)耳,又名小平菇,屬于食用真菌,具有豐富的營養(yǎng)價值[6-7]。

近年來,中藥雙向液體發(fā)酵技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。 中藥液體發(fā)酵是將營養(yǎng)物質(zhì)溶解在液體中制備培養(yǎng)基,隨后在其中接入菌種進行培養(yǎng)得到目標產(chǎn)物的發(fā)酵技術(shù)[8]。 雙向發(fā)酵是以中藥材為基質(zhì),以藥用或食用真菌作為發(fā)酵菌種,其中中藥材為真菌的生長提供營養(yǎng),同時中藥材因真菌的分解作用而產(chǎn)生新的成分[9]。 本研究將二者結(jié)合,以雞腿菇、蛹蟲草、秀珍菇為發(fā)酵菌種,對黃精進行雙向液體發(fā)酵,通過考察菌絲體得率、抗氧化活性而優(yōu)選出發(fā)酵黃精的最優(yōu)菌種,并且對優(yōu)選出的菌種液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化,為黃精深層次的開發(fā)以及增加雞腿菇發(fā)酵產(chǎn)物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

雞腿菇菌種R2000,山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;蛹蟲草菌種CICC14013,山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;秀珍菇菌種LD1,山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,上海麥克林生物科技有限公司,CAS#1898-66-4);總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、羥自由基測定試劑盒(南京建成 生 物 工 程 研 究 所,A105/A018);NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);無水乙醇、葡萄糖、果糖、麥芽糖(分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);瓊脂、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白胨(北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司);蔗糖、乳糖、KH2PO4、MgSO4(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基

雞腿菇斜面培養(yǎng)基:20%土豆,2%葡萄糖,0.1%KH2PO4,0.1% MgSO4,2.5%瓊脂。 種子液培養(yǎng)基:20%土豆,2%麩皮,2%葡萄糖,0.1% KH2PO4,0.1% MgSO4。發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽:2%葡萄糖,0.1% KH2PO4,1% MgSO4。

蛹蟲草斜面培養(yǎng)基同雞腿菇菌種。 種子液培養(yǎng)基:2%葡 萄 糖,1%蛋 白 胨,0.05% KH2PO4,0.05%MgSO4。 發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽:2%葡萄糖,2%蛋白胨,0.05% KH2PO4,0.05% MgSO4。

秀珍菇菌種培養(yǎng)基同雞腿菇菌種。 種子液培養(yǎng)基:20%土豆,2%麩皮,0.5%蛋白胨,0.2% KH2PO4,0.049% MgSO4。 發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)的碳源、氮源和磷酸鹽:2.5%葡萄糖,0.5%蛋白胨,0.102% KH2PO4,0.039% MgSO4。

1.3 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺:SW-CJ-1D,上海蘇靜實業(yè)有限公司;高壓滅菌鍋:YX-280D,寧波久興醫(yī)療器械有限公司;分光光度計:UV-6100S,上海美譜達儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱:101,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;電子天平:FA2004N,上海菁海儀器有限公司;恒溫振蕩:TS-2012C,上海印溪儀器儀表有限公司。

2 研究方法

2.1 菌種的發(fā)酵

從雞腿菇斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體,勾取5 次。接種于種子培養(yǎng)基。26 ℃,160 r/min振搖4 d[10]。

從蛹蟲草斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體,勾取3 次,接種于種子培養(yǎng)基,26 ℃,160 r/min振搖6 d,制備蛹蟲草種子液[11]。

從秀珍菇斜面培養(yǎng)基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體,勾取3 次,接種于種子培養(yǎng)基,26 ℃,160 r/min振搖11 d[12]。

3 種不同的真菌進行黃精雙向液體發(fā)酵,用500 mL 的錐形瓶,加入相應(yīng)菌種發(fā)酵培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì),裝樣量300 mL,黃精濃度7.5 mg/mL,接種量10%,溫度26 ℃。 雞腿菇160 r/min 振搖5 d,蛹蟲草靜置7 d,秀珍菇140 r/min 振搖7 d。 平行3次,將菌絲體抽濾,40 ℃烘干,稱量。

2.2 菌種的優(yōu)選

將3 種菌絲體煎煮3 次,每次2 h,與發(fā)酵液混合,濃縮至20 mg/mL,作為最終的發(fā)酵產(chǎn)物,4 ℃保存?zhèn)溆谩?干燥的黃精(40~60 目)與蒸餾水以1∶10 的比例煎煮3 次,每次3 h,濃縮至20 mg/mL 備用。

2.2.1 DPPH 自由基清除試驗[13]

按照表1 的操作步驟加入蒸餾水,無水乙醇,樣品和DPPH 混合均勻之后,避光反應(yīng)30 min,于517 nm測吸光度(OD)值,按照下列公式計算清除率。

表1 DPPH 自由基清除試驗操作步驟

表2 黃精發(fā)酵后抗氧化活性(s)

表2 黃精發(fā)酵后抗氧化活性(s)

注:DPPH 為1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼。 與黃精水提液比較,*P<0.01。

組別 個數(shù)黃精水提液 3黃精雞腿菇發(fā)酵 3黃精蛹蟲草發(fā)酵 3黃精秀珍菇發(fā)酵 3 DPPH 自由基清除率/% 羥自由基抑制力/(U/mL) 總抗氧化能力/(U/mL)39.96±2.98 69.88±9.54 1.04±0.20 89.17±2.04* 78.12±9.02 9.37±1.56*83.40±3.21* 29.84±3.13 2.15±0.64 92.15±0.76* 65.79±9.44 1.80±0.31

注:OD0 為空白參比吸光度值;OD1 為樣品與DPPH 自由基反應(yīng)后的吸光度值;OD2 為樣品本身吸光度值。

2.2.2 羥自由基抑制能力測定[14]

按照羥自由基測定試劑盒(A018)說明書,用維生素C(VC)在相同濃度下對比。 取0.2 mL 樣品,于550 nm處,雙蒸水調(diào)零,測定OD 值,按照公式計算。

2.2.3 總抗氧化能力測定[15]

按照T-AOC 測定試劑盒說明書,用VC 在相同濃度下對比,取0.2 mL 樣品,于520 nm 處,雙蒸水調(diào)零,測定OD 值。 按照下列公式計算。

2.3 黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 黃精液體發(fā)酵質(zhì)量濃度的考察

在基本營養(yǎng)成分不變的前提下,考察黃精質(zhì)量濃度為0 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL 的液體發(fā)酵情況,每個濃度平行3 次,以生物量(g/L)為指標,優(yōu)選黃精最佳的液體發(fā)酵濃度[16]。采用500 mL 的錐形瓶,裝樣量300 mL,140 r/min 振搖3 d,將菌絲體抽濾,40 ℃烘干,稱量。

2.3.2 碳源種類和含量的考察

參考張疏雨等[17]的方法,并做適當修改。 首先以相同濃度的2%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和乳糖,每種碳源平行3 次,優(yōu)選出碳源后再進行濃度的優(yōu)化。 設(shè)置5 個濃度:0%、2%、4%、6%、8%。 用100 mL的錐形瓶,裝樣量50 mL,140 r/min 振搖3 d,將菌絲體進行抽濾,40 ℃烘干,稱量。

2.3.3 氮源種類和含量的考察

參考孟麗君等[18]的方法,并做適當修改。 首先以相同濃度的5%的麩皮、蛋白胨、酵母膏、酪蛋白胨和硫酸銨作為氮源,優(yōu)選出氮源后再進行濃度的優(yōu)化。設(shè)置5 個濃度:0%、2.5%、5%、7.5%、10%。 采用100 mL的錐形瓶,裝樣量50 mL,發(fā)酵3 d,平行3 次,將菌絲體抽濾,40 ℃烘干,稱量。

2.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以合適的碳源、氮源以及黃精濃度作為試驗的三個因素,每個因素設(shè)三個水平,另外設(shè)置空白因素和空白水平項,設(shè)計L9(34)因素水平表,按照該表進行試驗,平行3 次,取平均值,以生物量(g/L)為指標,確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方[19]。見表3、表4。

表3 黃精雞腿菇發(fā)酵工藝因素水平

表4 黃精雞腿菇發(fā)酵正交試驗結(jié)果

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 菌絲體得率

以生物量(g/L)為縱坐標,黃精發(fā)酵后與普通發(fā)酵后生物量比較見圖1。 黃精均可使用3 種菌種進行液體發(fā)酵且發(fā)酵后菌絲體的得率均顯著增加,黃精雞腿菇液體發(fā)酵后生物量最多,為8.47 g/L,與自身普通發(fā)酵比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 黃精蛹蟲草液體發(fā)酵后生物量增加的最多,發(fā)酵后生物量為7.56 g/L,與自身普通發(fā)酵比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 黃精發(fā)酵后菌絲體的得率

3.2 菌種的優(yōu)選

由表2 可知,黃精和不同菌種液體發(fā)酵后,發(fā)酵后的產(chǎn)物DPPH 清除力比黃精水提液均有顯著增加。其中以秀珍菇發(fā)酵后DPPH 清除率最高,各發(fā)酵組與黃精水提液組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在羥自由基清除試驗中,黃精經(jīng)過蛹蟲草和秀珍菇發(fā)酵后,羥自由基抑制能力反而有顯著降低,黃精雞腿菇發(fā)酵后略有上升,可達到(78.12±9.02)U/mL。在總抗氧化能力方面,經(jīng)過發(fā)酵后,黃精雞腿菇發(fā)酵比黃精水提液顯著增強,兩組療效比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

綜合考慮,選擇雞腿菇對黃精進行液體發(fā)酵,并對其液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

3.3 黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

3.3.1 黃精發(fā)酵濃度

以生物量(g/L)為縱坐標,結(jié)果見圖2-A,黃精在發(fā)酵質(zhì)量濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 時,生物量比普通發(fā)酵顯著性增加,10 mg/mL 時生物量最多。 因此,并不是黃精濃度越大提供的營養(yǎng)越多,真菌生長最好。

圖2 培養(yǎng)基條件單因素考察

3.3.2 碳源的種類和濃度

以生物量(g/L)為縱坐標,結(jié)果見圖2-B。果糖和乳糖作為碳源時,其生物量比其他碳源的顯著減少,生物量最大的碳源是葡萄糖,因此選擇葡萄糖作為黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。

以生物量(g/L)為縱坐標,結(jié)果見圖2-C。當葡萄糖含量太高時,其生物量反而顯著減少;當葡萄糖含量為0%和2%時,其生物量相差不大;0%的葡萄糖含量時,黃精發(fā)酵生物量反而高。

3.3.3 氮源種類和濃度

以生物量(g/L)為縱坐標,結(jié)果見圖2-D,麩皮作為氮源時,生物量最多,酵母膏、硫酸銨和酪蛋白胨作為氮源時生物量顯著減少,因此麩皮更適合應(yīng)用在黃精液體發(fā)酵中。

以生物量(g/L)為縱坐標,結(jié)果見圖2-E,與不加麩皮比較,其他含量時的黃精發(fā)酵生物量均顯著增加,麩皮5%的含量時生物量最多,濃度增大時生物量趨于平緩。

結(jié)果如表4 所示,各因素對黃精液體發(fā)酵培養(yǎng)影響的順序為:黃精濃度>氮源含量>碳源含量。由表5 方差分析數(shù)據(jù)可知,氮源和黃精濃度對黃精雞腿菇發(fā)酵具有顯著影響,而碳源的含量則對其雙向液體發(fā)酵工藝無顯著影響。 由分析結(jié)果可知,最佳培養(yǎng)基為葡萄糖0%,麩皮含量為5%,黃精質(zhì)量濃度為10 mg/mL,土豆20%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,按照該條件進行發(fā)酵,進行驗證試驗,菌絲體得率為(8.06±0.20)g/L。

表5 黃精雞腿菇發(fā)酵不同工藝因素水平下方差分析結(jié)果

4 討論

黃精在用三個菌種進行雙向液體發(fā)酵后,生物量均有顯著增加,以雞腿菇為菌種進行發(fā)酵時,菌絲體得率最高。 此外,雞腿菇-黃精液體發(fā)酵后DPPH清除率和總抗氧化能力較其他菌種發(fā)酵后高,且羥自由基抑制能力也略有提高。 因此綜合考慮選擇雞腿菇作為對黃精進行液體發(fā)酵的菌種。

真菌的生長繁殖離不開適宜的生長條件,在合適的生長條件下,真菌的生長代謝活動才能正常進行[20]。 各種營養(yǎng)是微生物生長的先決條件,并且各種營養(yǎng)物質(zhì)只有在適宜的濃度時才能對真菌的生長繁殖起到最佳效果。 所以培養(yǎng)基的優(yōu)化需要在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗篩選出營養(yǎng)物質(zhì)的最佳配比。 結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)基為葡萄糖0%,麩皮含量5%,黃精質(zhì)量濃度10 mg/mL,土豆20%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%。 此外由單因素結(jié)果可知,當黃精含量持續(xù)升高時,生物量反而降低,說明并不是黃精含量越多發(fā)酵過程越好,黃精-雞腿菇雙向發(fā)酵應(yīng)在適宜的含量范圍內(nèi)進行,超出一定的限度反而會阻礙發(fā)酵過程。

由正交試驗結(jié)果猜測,黃精在液體發(fā)酵過程中,其水提液為雞腿菇的生長繁殖提供了一定的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì),特別是碳源所具備的營養(yǎng),此過程符合中藥雙向液體發(fā)酵的定義。 此外,黃精和雞腿菇中的主要成分為多糖類物質(zhì),相關(guān)研究表明黃精多糖和雞腿菇多糖具有很好的抗氧化作用[21-22]。 在雞腿菇發(fā)酵黃精后抗氧化能力顯著提升,說明發(fā)酵后的產(chǎn)物具有更好的抗氧化能力,原因可能是發(fā)酵后產(chǎn)生了具有良好抗氧化能力的多糖。 本研究為開發(fā)黃精發(fā)酵產(chǎn)品提供了新思路,為接下來雞腿菇雙向發(fā)酵黃精在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定參考。但是對于雞腿菇發(fā)酵黃精后新產(chǎn)生的活性物質(zhì)還有待進一步的研究和探索,這也是日后研究工作的重點關(guān)注內(nèi)容。

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