王蒙蒙, 金 鑫

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是具有急性、熱性、出血性等臨床特征的高度致死性傳染病[1]。20世紀(jì)20年代首次在國外發(fā)現(xiàn)并公開報(bào)道,在歐洲循環(huán)傳播后傳至南美洲,又傳入俄羅斯聯(lián)邦,最后蔓延至我國境內(nèi),2018年在遼寧省首次發(fā)現(xiàn)ASF疫情[2]。2020—2022年9月2日,已有45個(gè)國家相繼報(bào)告ASF疫情(圖1)[3]。

圖1 按行政區(qū)劃顯示ASF存在的世界地圖

1 ASFV病原體特征

ASF病原體是非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),它是目前唯一已知的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的線性雙鏈DNA蟲媒病毒,屬非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、豬瘟病毒屬(Asfivirus)[4]。傳播途徑較廣,可通過間接接觸受感染的軟蜱(ornithodoros spp)進(jìn)行媒介傳播,也可直接接觸感染的家豬或野豬以及飼料、污染物等傳播病原體[5]。病毒主要在細(xì)胞質(zhì)復(fù)制,早期也在細(xì)胞核[6],具有細(xì)胞嗜性,天然靶細(xì)胞是單核細(xì)胞或者是巨噬細(xì)胞。從形態(tài)學(xué)上,ASFV具有二十面體對(duì)稱型結(jié)構(gòu),平均直徑為260 nm[6],自內(nèi)向外的結(jié)構(gòu)分別是擬核基因組(nucleoid)、核芯殼(core shell)、內(nèi)膜(inner envelope)、衣殼 (capsid)和囊膜(outer envelo-pe) 5層結(jié)構(gòu)[7](圖2)。毒株基因組大小為170～194 kb,含有150～167個(gè)開放閱讀框(open reading fra-mes, ORF),編碼 150～200種病毒蛋白,包括 68種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。基因組大小差異主要是源于屬于多基因家族(multigene families, MGFs)基因拷貝的增加或丟失以及基因組非編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量的變化[9]。

圖2 ASFV整體結(jié)構(gòu)切面圖

基因組通過編碼多種蛋白質(zhì),來調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調(diào)控細(xì)胞周期等, 進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。已有研究表明,ASFV基因組編碼調(diào)控的晚期蛋白DP71L、早期蛋白A238L等調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá);多基因家族蛋白MGF360、MGF530/505、晚期蛋白I329L等抑制I型干擾素表達(dá), 并抑制干擾素的抗病毒效應(yīng)以及NF-κB信號(hào)通路;蛋白A179L、晚期蛋白A224L、蛋白EP153R等在感染初期抑制細(xì)胞凋亡;蛋白E183L等在感染后期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;晚期蛋白CD2v等抑制淋巴細(xì)胞增殖;早期蛋白L83L等抑制IL-1β的抗病毒效應(yīng)等[10]。目前還不明確ASFV是如何吸附細(xì)胞以及相關(guān)的受體,但有相關(guān)報(bào)道表明,衣殼蛋白P72、內(nèi)膜蛋白P54、膜相關(guān)抗原蛋白P30等參與病毒結(jié)合、內(nèi)化、入侵宿主細(xì)胞以及內(nèi)體(early endosome, EE)遷移等過程[11]。 現(xiàn)已鑒定出的毒株有24種基因型,目前我國、東歐地區(qū)及其周邊流行的是基因Ⅱ型,西非地區(qū)及其周邊主要是基因Ⅰ型[10]。ASFV毒株抵抗力強(qiáng),在低溫條件下可以保持穩(wěn)定,-80 ℃可保持1年,在高溫環(huán)境中不穩(wěn)定,60 ℃條件下可存活20 min,常規(guī)消毒劑如氫氧化鈉、次氯酸鈉等均可有效滅活毒株,對(duì)一些有機(jī)溶劑敏感,如乙醚、氯仿等。早在20世紀(jì)60年代,ASFV疫苗就開始進(jìn)行相關(guān)研究,但均以失敗告終,其主要原因有ASFV傳播能力強(qiáng),且生物學(xué)特性復(fù)雜,基因組復(fù)雜,無法完全掌握毒力基因;免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜,安全性、保護(hù)效力有待提高等[12]。直到2022年4月,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所才解析出ASFV A137R蛋白逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的分子機(jī)制,這也為蛋白調(diào)控ASFV毒力的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。隨著全球疫情態(tài)勢(shì)發(fā)展愈加嚴(yán)峻以及疫情所造成的經(jīng)濟(jì)威脅愈加嚴(yán)重,對(duì)于安全有效且商業(yè)化疫苗的研發(fā)需求愈加迫切。應(yīng)盡快研發(fā)出可以消滅ASF的疫苗來預(yù)防控制疫情。

2 ASF診斷方法

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)將其列為A類疫病,法律規(guī)定報(bào)告動(dòng)物疾病,我國也將其列為一類動(dòng)物疫病。該病分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型4種,其中,最急性型、急性型死亡率及發(fā)病率最高[13]。臨床特征主要表現(xiàn)為持續(xù)性高熱、食欲減退甚至廢絕、氣喘、四肢無力、嘔吐、便秘或腹瀉、便血等癥狀。病理解剖方面,眼觀病畜體表可見大塊紫色瘀斑;剖檢可見脾臟顯著腫大、呈紫黑色、質(zhì)地變脆,心肌、肝臟、肺臟、腎臟、腸系膜、腸系膜淋巴結(jié)均出現(xiàn)出血腫大現(xiàn)象,以及心包腔、胸腹腔有積液存在[14]。實(shí)驗(yàn)室病理組織鏡檢可觀察到組織均以廣泛性充血、出血及炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)變化為主[15]。目前全世界對(duì)于ASF疫情主要從血清學(xué)檢驗(yàn)和分子病原學(xué)檢測(cè)等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷鑒別,在血清學(xué)上,致細(xì)胞病變效應(yīng)和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)呈現(xiàn)的“玫瑰花環(huán)”為ASFV感染特有的標(biāo)志[16];OIE推薦應(yīng)用病毒分離、熒光抗體檢測(cè)抗原(FAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)[17]。同時(shí)結(jié)合臨床、病理特征等進(jìn)行鑒別診斷,若發(fā)現(xiàn)有疫情輸入,立即采取隔離、撲殺、消毒等嚴(yán)格的處置措施[18]。

3 常見防控ASF疾病的措施

3.1 ASF疫苗的研究進(jìn)展

3.1.1 滅活疫苗

滅活疫苗(inactivated vaccine)是指利用物理或者化學(xué)方法將毒株滅活,使其喪失感染性、毒性,且保持免疫原性,同時(shí)結(jié)合相應(yīng)佐劑而制成的疫苗。由于滅活疫苗制備簡便、成本低、保存容易、安全性高等優(yōu)點(diǎn),所以針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種病毒,會(huì)優(yōu)先研發(fā)滅活疫苗[19]。2014年,有研究人員將二元乙炔亞胺(diacetylenimine, DEI)滅活的ASFV制劑分別與PolygenTM和Emulsigen?-D佐劑配伍免疫機(jī)體,機(jī)體被同源高毒性ASFV攻擊,通過結(jié)果可知,產(chǎn)生了特異性抗體,但并沒有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用,而是抗體依賴性增強(qiáng),出現(xiàn)急性臨床癥狀[20]。由于滅活疫苗的特性,不能引起完整的細(xì)胞免疫反應(yīng),故滅活疫苗在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上不能作為安全有效的研究途徑使用[21]。

3.1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗(live attenuated vaccines, LAV)是指利用分離鑒定、人工制備等方法將病原體毒性減弱,免疫原性保留而制成的活疫苗[22]。LAV分為傳統(tǒng)減毒活疫苗和重組減毒活疫苗?？梢l(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng),在理論上,相較于滅活疫苗,減毒活疫苗具有免疫反應(yīng)時(shí)間長、免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[23]。被一些研究學(xué)者評(píng)為短期內(nèi)最有希望的疫苗[24]。早在20世紀(jì)60年代,西班牙和葡萄牙暴發(fā)ASF疫情時(shí),已經(jīng)有學(xué)者進(jìn)行田間試驗(yàn),因能為機(jī)體提供同源保護(hù)和部分異源保護(hù),故在當(dāng)時(shí)大范圍應(yīng)用LAV,卻增加了多重感染和再次感染的風(fēng)險(xiǎn)[23],出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)等副作用[25]。毒力減弱的同時(shí)免疫原性和穩(wěn)定性也減弱[20]。因此,提高LAV的有效安全性依舊是未來的主要研究方向。

3.1.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗

對(duì)傳統(tǒng)減毒活疫苗(traditional live attenuated vaccines)的研究主要集中在天然致弱毒株(OURT88/3或NH/P86)和利用豬骨髓來源細(xì)胞、Vero細(xì)胞和COS-1細(xì)胞等細(xì)胞制成的人工傳代致弱毒株。

2015年有研究表明,NH/P86接種豬后,自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK)和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cyt-otoxic lymphocyte, CTL)活性增強(qiáng),抵御一些強(qiáng)毒株的攻擊[26]。用OURT88/3首免,再用OUR/T88/1加強(qiáng)免疫,分泌γ-IFN的淋巴細(xì)胞活性增強(qiáng),這樣誘導(dǎo)交叉免疫有效保護(hù)率為60%～100%[27]。以上這些保護(hù)作用會(huì)隨著CD8+T淋巴的不斷衰竭,效果逐漸減退[28]。

2021年步志高的研究表明,用ASFV野毒株( ASFV-G )在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng),ASFV-G復(fù)制次數(shù)會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而增加,毒力逐漸喪失直至110代完全衰竭,得到致弱株(ASFV-G/V),完全減毒的毒株感染豬后可能由于基因組發(fā)生進(jìn)行性基因缺失造成對(duì)強(qiáng)毒株的攻擊不能提供保護(hù)[29]。

因此,傳統(tǒng)減毒活疫苗有著很多不可控的生物安全問題,這可能也是不能廣泛應(yīng)用的原因[21]。

3.1.2.2 重組減毒活疫苗

重組減毒活疫苗(recombinant live attenuated vaccine)是指針對(duì)毒株的結(jié)構(gòu)、毒力基因等采用基因編輯或同源重組等分子生物學(xué)技術(shù)手段,降低毒株毒力,制備成活疫苗[30],屬于基因工程疫苗(geneti-c engineering vaccines)。目前ASF的重組減毒活疫苗的研究主要集中在毒力基因缺陷疫苗(分為疫苗免疫和野毒免疫)上[25],即敲除弱毒株或強(qiáng)毒株上單個(gè)或多個(gè)靶向基因減小毒力或誘發(fā)免疫反應(yīng),增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平[20](表1)。

表1 ASFV基因缺失疫苗

有研究發(fā)現(xiàn),重組減毒活疫苗能夠產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[31],相較于傳統(tǒng)減毒活疫苗來說更具有保護(hù)性,對(duì)親本毒株的保護(hù)率可達(dá)100%[22],更有機(jī)會(huì)成為廣泛應(yīng)用的商業(yè)化疫苗。但對(duì)ASFV毒力相關(guān)基因或免疫逃逸基因的精準(zhǔn)敲除和最優(yōu)組合以及對(duì)其免疫途徑、接種劑量、接種時(shí)間和安全有效性等方面的確認(rèn)應(yīng)該進(jìn)一步研究[22]。

2008年有研究人員將E70毒株上的A238L基因敲除,免疫機(jī)體后研究發(fā)現(xiàn),無任何保護(hù)作用且臨床上出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和出血等免疫后不良反應(yīng)(adverse post vaccination reactions)[32];2017年有研究人員將Benin 97/1上的DP148R基因敲除,研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中病毒復(fù)制并沒有減少,但毒力降低,當(dāng)用親本強(qiáng)毒株攻擊經(jīng)肌肉注射或經(jīng)鼻內(nèi)免疫途徑的豬后,可誘導(dǎo)對(duì)親本強(qiáng)毒株的高度保護(hù),即同源保護(hù)(homologous protection)[33];將BA71毒株上的CD2v基因敲除,研究發(fā)現(xiàn)毒株在機(jī)體內(nèi)高度減毒,免疫機(jī)體后,不僅可以抵抗親本強(qiáng)毒株的攻擊,還可以抵抗異源毒株的攻擊,即交叉保護(hù)(Cross-protection)[34];2018年研究人員將NH/P68上的A238L、A224L基因敲除,研究發(fā)現(xiàn)免疫后的機(jī)體可抵抗Arm07毒株的攻擊,即異源保護(hù)(heterologous protection)[35];將ASFV-G△9GL△MGF免疫機(jī)體毒株完全致弱,不能引起免疫應(yīng)答。2020年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制出一種安全有效的疫苗HLJ/18-7GD,免疫后在機(jī)體內(nèi)完全減毒并能夠?qū)C(jī)體提供完全保護(hù),截至到2021年已經(jīng)安全評(píng)價(jià)生產(chǎn)性試驗(yàn)和第二階段臨床試驗(yàn)[36],有望成為安全有效的商業(yè)化的疫苗。2021年研究人員研究了ASFV-G-△I177L疫苗,該疫苗效價(jià)和效力不因基因缺失而改變,還可在穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)物中生長,所以同樣它也有望成為大規(guī)模商業(yè)化疫苗[37]。經(jīng)口給藥是該疫苗重要的接種方式[38]。

3.1.3 基因工程疫苗

病毒活載體疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗3者的共同點(diǎn)在于都涉及可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效性免疫保護(hù)作用的抗原基因,即保護(hù)性抗原(protective antigen)[20],都為基因工程疫苗(表2)。研究表明,ASFV保護(hù)性抗原基因有p72、p54、p30、CD2v、EP153R、p12等[4]?；蚬こ桃呙绲膬?yōu)點(diǎn)主要有免疫強(qiáng)烈持久、安全性高、穩(wěn)定等,但其生物安全依舊是未來研發(fā)需要解決的難題[23]。

ASFV活載體疫苗(live vector vaccine)是利用基因工程技術(shù)將外源性保護(hù)性抗原基因插入到無毒或低毒的活病毒基因組非必需區(qū)基因中重組表達(dá),誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymp-hocyte,CTL)反應(yīng)與細(xì)胞免疫[39]。用于ASFV活載體的主要有痘病毒(poxvirus)、腺病毒(adenovirus, ADV)、皰疹病毒(herpesviruses)、甲病毒(alpha-virus)、桿狀病毒(baculovirus)等[20]。目前對(duì)ASFV基因工程疫苗的研究比較少,還缺乏相應(yīng)的攻毒保護(hù)試驗(yàn),對(duì)攻毒保護(hù)有效性需要進(jìn)一步的驗(yàn)證(表2)。2001年研究人員在E183L基因的NotⅠ酶切位點(diǎn)插入CP204L基因,構(gòu)建嵌合蛋白p54/30,由桿狀病毒表達(dá),免疫豬后發(fā)現(xiàn),在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了中和抗體(neutralizing antibodies),且最大病毒血癥滴度減少,可以作為血清學(xué)診斷試劑使用[40]。將p54、p30插入到載體后表達(dá)免疫豬發(fā)現(xiàn),可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生特異性應(yīng)答和中和性抗體,但并不能提供完全保護(hù)作用[41]。2004年研究人員為評(píng)估病毒蛋白p30、p54和p72的免疫保護(hù)作用,將分離株P(guān)r4上的p30、p54、p72和p22重組到桿狀病毒上進(jìn)行表達(dá)并對(duì)豬進(jìn)行免疫,可檢測(cè)到中和抗體,但在臨床上出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,不能產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的保護(hù)作用[42]。

DNA疫苗(DNA vaccine)也叫核酸疫苗,是將保護(hù)性抗原克隆到質(zhì)?；蚍侵虏⌒圆《旧?表達(dá)出天然的保護(hù)性蛋白,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答[43]。研究人員利用CRISPR/Cas9基因工程技術(shù)將ASFV的開放閱讀框E199L、p30和p22插入偽狂犬病病毒載體中并表達(dá),研究顯示密碼子顯著增強(qiáng)了E199L的表達(dá), 且嵌合的啟動(dòng)子優(yōu)化了轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)[44]。將p54、p30和血凝素(ASFV hemagglutinin, sHA)與泛素(Ubiquitin,Ub)融合,并克隆到質(zhì)粒表達(dá),免疫豬后發(fā)現(xiàn)機(jī)體可產(chǎn)生特異性機(jī)體應(yīng)答,并且能夠提供部分保護(hù)作用[45]。

亞單位疫苗(subunit vaccine)是將保護(hù)性抗原導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)得到保護(hù)性蛋白,再配以合適的佐劑制備成的疫苗。研究人員將p32、p54、pp62、p72基因插入到腺病毒載體表達(dá),配制2種不同的佐劑,采取“雞尾酒式”免疫豬,結(jié)果表明誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性抗體和CTL反應(yīng)[46]。但是對(duì)于免疫疫苗的保護(hù)效力仍需進(jìn)一步評(píng)估,也需要找到合適的佐劑。

表2 ASFV基因工程疫苗

3.1.4 單周期病毒疫苗

單周期病毒疫苗(single-cycle virus vaccines)也叫作復(fù)制缺陷型病毒疫苗,是利用基因工程技術(shù)ASFV復(fù)制所必需基因進(jìn)行缺失對(duì),使其在輔助細(xì)胞系中可進(jìn)行有效復(fù)制,在感染動(dòng)物后不能進(jìn)行有效復(fù)制,故該疫苗以最大程度的原始狀態(tài),保持了免疫原性且避免了排毒等免疫副作用,是目前新研發(fā)出的一種安全性相對(duì)較高的疫苗[47]?，F(xiàn)已有研究者Kaori Terasaki等[48]發(fā)現(xiàn),復(fù)制缺陷型裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)進(jìn)行單周期復(fù)制,且不會(huì)引起免疫宿主系統(tǒng)性感染,可作為疫苗的候選毒株。也有研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種了單周期病毒疫苗,發(fā)現(xiàn)機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生了體液和細(xì)胞免疫,但其保護(hù)效力及能否成為防控ASFV的有效疫苗,需要進(jìn)一步確認(rèn)[49]。

3.1.5 納米疫苗

納米疫苗(nanovaccine,NVs)是當(dāng)前疫苗研究的新型熱點(diǎn),具有廣闊前景。目前并沒有針對(duì)ASFV研發(fā)的納米疫苗。NVs是將抗原與佐劑連接,將納米材料作為載體或免疫調(diào)節(jié)劑,用于疾病治療和預(yù)防的一類疫苗。NVs自身具有制備材料易得、生物相容性好、安全有效性高、副作用少等優(yōu)點(diǎn),在ASF防控上具有減小疫苗帶來的毒副作用、誘導(dǎo)高水平體液和細(xì)胞免疫作用、提高抗原遞送效率等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)應(yīng)用于獸用疫苗的NVs有聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ploy D,L-lactic-coglycolic acid, PLGA)、金納米粒(AuNPs)、聚酸酐(polyanhydrides)以及殼聚糖(chitosan, CS)[50]。NVs的研究發(fā)展為ASFV疫苗的研究提供新的思路與方向。

3.2 其他防控措施

除用疫苗免疫接種的防控措施外,還可以根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室、臨床診斷,由專業(yè)人員針對(duì)圈舍環(huán)境及其用具等進(jìn)行科學(xué)有效的消毒處理。嚴(yán)格的日常管理和生物安全措施等方法都可以切斷傳播途徑,防止交叉感染的風(fēng)險(xiǎn),例如,引進(jìn)新的品種豬時(shí),按照規(guī)定進(jìn)行檢疫;定期消滅軟蜱、鼠、蠅等可以攜帶病原體的寄生蟲及動(dòng)物等。

抗ASF藥物的應(yīng)用能夠?qū)SF的防控起到推動(dòng)作用,有多種抗病毒化合物在體外Vero細(xì)胞和豬巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出抗ASF活性,(S)-HPMPA 等“核酸類似物”類化合物既能抑制ASF核酸合成,也能夠在病毒感染晚期抑制IP-73蛋白的合成[51]。氟喹諾酮類抗生素能夠抑制病毒復(fù)制,減少感染帶來的細(xì)胞病變等[43,52]。Pitstop2、dynasore等藥物能夠抑制病毒網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,阿米洛利 (EIPA)、細(xì)胞松弛素D等藥物能夠有效抑制胞飲作用,降低細(xì)胞吸收ASFV作用[53]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多安全有效的化合物具有抗ASF作用,但無論是人工合成還是天然合成的化合物目前都僅僅涉及體外的研究試驗(yàn),并沒有臨床驗(yàn)證結(jié)果,所以抗ASF藥物的研發(fā)也是未來疫情防控的重要途徑。

3.3 抗病育種可作為未來防控ASF的新方向

一些研究表明,豬的抗病性是受到遺傳因素影響的,故有人在1980年左右就提出過抗病育種(disease-resistant breeding)的構(gòu)想,并隨著基因工程技術(shù)和分子遺傳學(xué)的成熟應(yīng)用,這一構(gòu)想逐漸完善。目前已有奶牛乳房炎、豬繁殖與呼吸綜合征、豬水腫病等均已在這一方向上進(jìn)行研究并取得初步研究成果?？共∮N,即將目的基因通過基因工程技術(shù)重組到受體基因組內(nèi),表達(dá)出穩(wěn)定的性狀,最終傳代培育出抗病力較強(qiáng)的抗體?？共∮N的機(jī)制簡單,其中,抗性基因分為抗性主基因與抗性多基因,抗性多基因以主要組織相容復(fù)合物(MHC)研究為主(圖3)。在防控ASF疾病時(shí),利用豬的抗病性基因可遺傳的特征,用基因工程重組技術(shù)將可標(biāo)記輔助選擇抗性基因重組到新的受體基因組內(nèi)表達(dá)出抗ASFV強(qiáng)的基因性狀。此研究可作為新的研究課題為早日完全控制ASF奠定基礎(chǔ)。該技術(shù)為疫病防控提供一個(gè)新的方向,其主要優(yōu)勢(shì)在于提高特異性抗病力,相較于一般性抗病力來說,遺傳力會(huì)提高。但該技術(shù)受到多種因素制約,如遺傳因素、個(gè)體差異因素,基因和經(jīng)濟(jì)因素等。

圖3 抗病育種簡單機(jī)制

3.4 目前ASF防控所遇到的難題

1) 在疫苗研發(fā)上需要解決的難題:ASF病原體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,逃避機(jī)制復(fù)雜,傳播能力較快;ASF疫苗安全性有待提高,無可商業(yè)化應(yīng)用的ASF疫苗。

2) 從國家層面上需要解決的難題:防控體系不完善,監(jiān)督監(jiān)管責(zé)任沒有落實(shí)到位;生豬市場(chǎng)以及海關(guān)檢疫存在潛在的ASFV感染風(fēng)險(xiǎn)。

3) 從社會(huì)層面上需要解決的難題:民眾生物安全意識(shí)較差;專業(yè)檢疫技術(shù)人員缺少。

4) 從個(gè)人層面上需要解決的難題:個(gè)體養(yǎng)殖戶防疫意識(shí)不到位;對(duì)ASF的認(rèn)識(shí)不夠,盲目接種ASF疫苗;消毒劑使用錯(cuò)誤。

解決這些難題需要全社會(huì)的共同努力。例如,在ASF流行的大環(huán)境下,應(yīng)該科學(xué)管理飼養(yǎng)豬場(chǎng);嚴(yán)格執(zhí)行疫病處理,做好生物安全工作;落實(shí)市場(chǎng)責(zé)任義務(wù),做好疫病監(jiān)管監(jiān)測(cè)工作。在疫苗研究以及抗ASF藥物研制上,應(yīng)該加強(qiáng)研發(fā)疫苗安全性,完善抗ASF藥物的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。從目前來看,我國依舊面臨著ASF帶來的防控壓力,全社會(huì)各部門之間應(yīng)相互配合,盡職盡責(zé),最大限度減少ASF帶來的損害,保障我國生豬業(yè)穩(wěn)定發(fā)展。

4 小結(jié)與展望

面對(duì)ASF疫情的大流行趨勢(shì),全世界圍繞著ASF疫情防控正在積極、緊張地展開研究,我國研究者對(duì)ASF防控國家重大戰(zhàn)略需求開展一系列科技攻關(guān)并獲得了一些成果。

疫苗作為疫情防控的有效措施之一,研發(fā)出安全有效的商業(yè)化疫苗的需求已經(jīng)迫在眉睫?；蚬こ桃呙绫葌鹘y(tǒng)疫苗更有可能成為未來疫苗研發(fā)的主要方向。其中,ASFV重組減毒活疫苗的相關(guān)研究成果比較多,疫苗可降低毒株毒力,誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng),保護(hù)效力高,大部分疫苗還可抵抗親本強(qiáng)毒株的攻擊,有些甚至可以抵抗異源毒株的攻擊,產(chǎn)生交叉免疫。但由于ASFV基因多樣性,無法明確毒力基因,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)等免疫副作用。隨著分子生物技術(shù)和疫苗學(xué)的發(fā)展,病毒活載體疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗也逐漸走向商品化,保護(hù)效力更加持久、穩(wěn)定。單周期病毒疫苗作為新型疫苗,為疫苗的研發(fā)提供了更多的可能。納米疫苗是近些年出現(xiàn)的概念,還沒有應(yīng)用于ASF疫苗中,但在生物醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用,且免疫副作用小,安全性高,ASFV納米疫苗是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)以及ASFV 的反向遺傳操作技術(shù)應(yīng)用到新型ASF疫苗候選株的研制中,可以加快安全有效的ASF疫苗的研發(fā)腳步。

除疫苗外,也可以借鑒其他用來防控傳染病的研究方法,例如抗病育種,該技術(shù)為疫病防控提供一個(gè)新的方向,其主要優(yōu)勢(shì)在于抗性基因具有遺傳性,可穩(wěn)定表達(dá)出抗病性狀。但該技術(shù)受到多種因素制約,如遺傳因素、個(gè)體差異因素、基因和經(jīng)濟(jì)因素等。隨著分子遺傳學(xué)和家畜育種學(xué)的發(fā)展,該技術(shù)一旦突破瓶頸,就會(huì)給疫情的防控帶來希望和改變。

生物安全是商業(yè)化疫苗未來研發(fā)的重中之重,隨著今后基因工程技術(shù)的發(fā)展,要進(jìn)一步深入對(duì)ASFV基因組的認(rèn)知,充分了解其表達(dá)蛋白及功能、感染及免疫機(jī)制、抗原識(shí)別及免疫靶點(diǎn)等,研發(fā)出安全有效的疫苗,實(shí)現(xiàn)量化生產(chǎn),為ASFV疫苗研制提供理論依據(jù),也為全世界ASF疫情防控提供科技支撐。