王徐紅，柳國斌，徐 磊

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院外七科，上海 201203）

糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者最嚴重的慢性并發(fā)癥之一［1］。它是由血管病變和（或）神經(jīng)病變、感染等因素引起足部組織破壞所致。超過15%的糖尿病患者最終會發(fā)生足部潰瘍，其中超過50%會出現(xiàn)潰瘍創(chuàng)面感染，嚴重者會導致截肢［1］。最新研究［2］顯示，DFU 合并感染者的截肢率是未合并感染者的50～150 倍。因此，控制感染對于保肢具有重要意義?？股貙τ诳刂瓢橛邪l(fā)熱的全身感染療效顯著，但DFU 患者往往伴有下肢動脈病變，使局部病灶的藥物濃度較低，加之耐藥菌株的出現(xiàn)，這些都為創(chuàng)面感染的控制增加了困難。隨著新技術(shù)、新材料日新月異的發(fā)展，越來越多的抗菌敷料走進人們的視野。其中，納米銀（通常指直徑在10～100 nm）敷料以其獨特的抗菌性能引起了人們的關(guān)注。當下，國內(nèi)外開展納米銀敷料治療DFU 的研究越來越多［3，4］。本文就其促進DFU 創(chuàng)面愈合的原理、療效及安全性作一綜述。

1 納米銀敷料促進DFU 創(chuàng)面愈合的原理

1.1 銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的制備途徑

納米銀敷料采用納米技術(shù)使AgNPs 均勻牢固地附著在敷料上，使其與創(chuàng)面接觸后可持續(xù)不斷地釋放出銀離子，從而達到持久的抗菌效果。AgNPs可以通過物理、化學和生物途徑制備［5］。表1 列出了這3 種途徑的常用方法和各自的優(yōu)缺點。

表1 AgNPs 的制備途徑Tab 1 Preparation route of AgNPs

1.2 AgNPs 的抗菌機制

AgNPs 因?qū)Ω鞣N病原體包括細菌、真菌和病毒的顯著抗菌特性而聞名。然而，AgNPs 殺菌作用的機制尚不清楚。有學者認為，AgNPs 的殺傷作用與其納米顆粒直接接觸細菌細胞壁，然后穿透進入細胞質(zhì)有關(guān)［5］。在細菌細胞壁上直接接觸大比表面積的AgNPs 會導致細胞膜損傷，使細胞內(nèi)容物泄漏，最終導致細胞死亡［6-9］，特別是直徑＜10 nm 的Ag-NPs 對細菌的毒性更強［8］。穿透細胞質(zhì)的AgNPs可能與生物分子，如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和DNA 相互作用。在某些情況下，AgNPs 可以與呼吸酶系統(tǒng)相互作用，從而產(chǎn)生活性氧（ROS），如過氧化氫（H2O2）、羥基（-OH）和超氧自由基（O2-），誘導氧化應激和損傷蛋白質(zhì)和核酸［10］。

相反，AgNPs 對細菌的細胞毒作用也可能是AgNPs 氧化溶解的Ag+所致。AgNPs 暴露于氣-水溶液中可被氧化生成Ag+［11］。Xiu 等［12］證明了Ag-NPs 在有氧條件下釋放的銀離子對抗菌活性起著完全的作用［12］。在有氧條件下，較小的AgNPs（約5 nm）比較大的AgNPs（11 nm）能釋放更多的Ag+。而在厭氧環(huán)境中，很少有Ag+被釋放，所以他認為，AgNPs 本身對細菌無毒。Ag+的抗菌作用和其與巰基（-SH）的相互作用密切相關(guān)［13］。因此，Ag+可以與細胞壁結(jié)合酶和蛋白質(zhì)的-SH 基團發(fā)生反應，從而破壞細菌的細胞壁和干擾細菌的呼吸鏈。此外，AgNPs 釋放的Ag+可以穿透細胞壁進入細胞質(zhì)，從而降解染色體DNA［14］，或與細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)硫醇基團發(fā)生反應，從而導致DNA 失去復制能力和ATP 生成所必需的蛋白質(zhì)也失去活性。一般來說，較小的銀顆粒比較大的銀顆粒更容易進入細胞質(zhì)［15］。AgNPs 進入細胞后也能釋放Ag+，從而產(chǎn)生自由基和氧化應激。

Bondarenko 等［16］報道了以上兩種抗菌活性機制之間存在協(xié)同效應。細胞與納米顆粒直接接觸可促進Ag+從AgNPs 中釋放，從而提高細胞對顆粒相關(guān)的Ag+的攝取量。Ivask 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs釋放的正電荷離子往往會干擾大腸桿菌電子傳遞鏈的正常功能，從而促進活性氧（ROS）的形成。而ROS 的產(chǎn)生是細菌死亡的主要原因，因為它促進脂質(zhì)過氧化，抑制ATP 的生成和DNA 的復制［18］。所以，這些機制效應可以總結(jié)為：AgNPs 或Ag+最初附著在細菌細胞壁上，隨后穿透進入細胞內(nèi)，然后導致ROS 和自由基的產(chǎn)生、DNA 損傷和蛋白質(zhì)變性。

1.3 AgNPs 抗菌效果的影響因素

AgNPs 的抗菌效果與病原菌種類有關(guān)。由于細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)不同——革蘭氏陽性菌（G+）的細胞壁非常厚，包含許多肽聚糖層，而革蘭氏陰性菌（G-）只有單一的肽聚糖層，因此G-菌通常比G+菌更容易受到Ag+的侵襲。

再者，AgNPs 的殺菌效果也取決于納米粒子的特性，包括尺寸、形狀、表面電荷、劑量和粒子分散狀態(tài)［19-21］。一般來說，在生理溶液中分散良好的Ag-NPs 比聚集的AgNPs 具有更強的殺菌效果。Ag-NPs 對G-菌和G+菌的殺滅效果隨粒徑減小而增大。如Agnihotri 等［19］合成了5、7、10、15、20、30、50、63、85 和100 nm 大小的AgNPs，并發(fā)現(xiàn)10 nm 以下的AgNPs 比較大的納米顆粒對大腸桿菌的抗菌活性最好。

另外，AgNPs 具有形狀依賴性的殺菌活性。Pal 等從紙片擴散試驗中發(fā)現(xiàn)，AgNPs 對107CFU/mL 大腸桿菌的殺菌效果依次為：截斷三角形＞球形＞棒狀［22］。最近，Kidd 等［23］研究了球形和棒狀AgNPs 對肺炎克雷伯菌的效果，結(jié)果表明，球形Ag-NPs 比桿狀的對克雷伯氏菌的殺滅效果更好，且二者的殺菌活性與劑量和時間有關(guān)。

從文獻來看，Ag+的正電荷對其殺菌活性也是至關(guān)重要的。它通過與帶負電的細菌細胞壁之間的靜電吸引進行殺菌［24］。與G+菌細胞壁的厚肽聚糖層相關(guān)的羧基、磷酸基、羥基和胺基使它們帶負電荷。同樣，外膜中與脂多糖相關(guān)的官能團給G-菌細胞壁帶來整體負電荷［25］。此外，AgNPs 的殺菌效果也受其表面電荷的影響。如Abbaszadegan等［26］研究AgNPs 表面電荷對G+菌（金黃色葡萄球菌、突變鏈球菌和化膿性鏈球菌）和G-菌（大腸桿菌和尋常變形桿菌）抗菌活性的影響后指出，帶正電荷的AgNPs 對所有菌株都表現(xiàn)出最高的殺菌活性，而帶負電荷的抗菌活性最低，中性的抗菌活性中等。

2 納米銀敷料促進DFU 創(chuàng)面愈合的療效與應用

由于AgNPs 獨特的理化特性，特別是其比表面積，可能更具有優(yōu)勢。事實上，從直徑＜20 nm 的AgNPs 中釋放的Ag+比從直徑更大的釋放的Ag+要高出100 倍以上［27］。因為銀可以產(chǎn)生抗菌［28］和抗炎［29］的特性，所以AgNPs 作為一種內(nèi)在的治療劑，可以促進慢性傷口的愈合。又因其抗菌譜廣泛，因此其有望在促進糖尿病患者傷口愈合方面能發(fā)揮極好的潛力［30-32］。如Appapalam 等［33］報道，AgNPs可對DFU 主要的多重耐藥細菌的分離株，如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有殺菌抑制作用，并能促進創(chuàng)面愈合。Gohar 等從40 名DFU 患者中分離出65 株細菌，其中金黃色葡萄球菌（37%）和銅綠假單胞菌（18.5%）是潰瘍樣本中的主要分離株。他們研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖AgNPs與阿米卡星混合時顯示出最大的抗耐藥細菌活性。同時，AgNPs 可使阿米卡星最低抑菌濃度值降低95%［34］。這些研究均提示，AgNPs 對多重耐藥細菌有突出療效。

其次，納米銀敷料在促進DFU 創(chuàng)面愈合方面，較之于傳統(tǒng)敷料有著顯著優(yōu)勢。在Essa 等［35］開展的一項前瞻性、雙盲、隨機、對照研究中，80 名非缺血性DFU 患者被分為兩組。A 組采用AgNPs 凝膠敷料治療，B 組采用常規(guī)敷料（含或不含聚維酮碘的濕敷料）治療，療程為12 周。結(jié)果顯示A 組的每周治愈率均明顯高于常規(guī)組。另外，該敷料還有減少換藥次數(shù)，減輕創(chuàng)面疼痛等優(yōu)勢。

此外，新的成分也可以被加入到AgNPs 中，組成了新型的復合材料，從而賦予其更加全面的治療效果。如El-Batal 等［36］用伽馬射線照射構(gòu)建的雙金屬銀-金納米粒子（Ag-Au NPs），與對照組相比，對從DFU 患者中分離的抗枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和熱帶念珠菌等菌株都表現(xiàn)出最高的抗菌性能，并能抑制其生物膜的形成。Lee 等［37］合成的新型銀和納米顆粒包裹的生長因子共載殼聚糖復合水凝膠具有持續(xù)的抗微生物特性，并能促進糖尿病傷口愈合。

3 納米銀敷料用于創(chuàng)面安全性評價

3.1 AgNPs 的細胞毒性

許多體外模型被用以研究AgNPs 可能導致的潛在細胞毒性效應。Ag+對真核細胞的毒性反映了它們殺死微生物的方式——主要通過損害蛋白質(zhì)硫醇（-SH）和產(chǎn)生ROS。真核生物產(chǎn)生ROS 的凈效應是廣泛和多樣的，可能導致細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷，其凈效應是細胞凋亡［38］。

細胞主要通過胞飲、內(nèi)吞作用，少部分經(jīng)過細胞膜擴散使AgNPs 進入細胞。一旦在細胞質(zhì)中游離，AgNPs 就有可能通過多種途徑引發(fā)氧化損傷。如從納米顆粒表面溶解的Ag+可通過與H2O2的相互作用，導致羥基自由基（·OH）的產(chǎn)生；AgNPs 也可以直接與NAPDH 氧化酶或線粒體呼吸鏈的相互作用，從而產(chǎn)生ROS［39］。

另外，AgNPs 已被證明以線粒體為靶點，通過破壞呼吸鏈影響ATP 的產(chǎn)生，導致ROS 的進一步產(chǎn)生和釋放［40］。研究表明，線粒體損傷后釋放Ca2+和細胞色素c（凋亡途徑的中間產(chǎn)物）。后者釋放到細胞質(zhì)室可導致“caspase 級聯(lián)”的啟動，其凈效應是細胞凋亡［41］。再者，細胞內(nèi)鈣水平的升高也可能影響Ca2+/鈣調(diào)素依賴的酶，導致細胞壞死。

有研究表明將人肺成纖維細胞和人膠質(zhì)母細胞瘤細胞暴露在濃度高達400 μg/mL 的AgNPs 下，觀察到ROS 的產(chǎn)生增加，ATP 的生成減少［42］。他們還注意到AgNPs 在細胞質(zhì)、核內(nèi)體、線粒體和細胞核均有分布，并確定AgNPs 導致的DNA 損傷具有濃度依賴的遺傳毒性，而ROS 也可間接導致遺傳毒性。

3.2 銀在體內(nèi)的分布

由于倫理和檢測技術(shù)等原因，目前尚沒有文獻報道創(chuàng)面局部外用納米銀敷料后銀離子在人體內(nèi)的分布、代謝等情況。陳丹丹等［43］開展的一項動物試驗或許可以為我們提供這方面的認識。作者按體重將0.33 g/kg 納米銀或微米銀植入大鼠背部皮下組織，12 周后測定了大鼠不同臟器中的銀含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀在脾、腎、肝、腦、睪丸中蓄積的濃度較高，且納米銀在各臟器中的蓄積濃度遠高于微米銀，最多可達到61.9 倍［43］。

此外，Walker 等［44］分析了使用含銀的傷口敷料后，銀離子在人體的可能分布：（1）釋放的銀離子被創(chuàng)面局部、周圍的細胞外基質(zhì)蛋白或可溶性蛋白迅速結(jié)合；（2）結(jié)合可溶性蛋白的銀可能被系統(tǒng)吸收，并通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到遠處的器官；（3）被結(jié)合的銀可能被進一步代謝：通過皮膚的正常組織更替、糞便或尿液排出體外，或礦化并以惰性、不溶性硒化物和硫化物的形式留在體內(nèi)。但作者強調(diào)，正常使用含銀敷料對局部和系統(tǒng)造成的短期和長期毒性的風險是很低的，可以忽略不計。

3.3 劑量問題

目前，絕大多數(shù)致力于AgNPs 效果的研究都是在體外進行的，而試驗選擇的劑量都普遍較高。事實上，納米銀的許多潛在的生物學效應很可能只有在高濃度時才會發(fā)生，而傷口敷料的含銀濃度往往較低。因此，在許多情況下，毒性研究的結(jié)果與現(xiàn)實創(chuàng)面暴露的相關(guān)性并不明確［38］。其次，在任何體外研究中，引入模型系統(tǒng)的劑量與細胞可用的劑量之間也可能存在差異。當試圖用體外系統(tǒng)的結(jié)果來推斷其在體內(nèi)系統(tǒng)的作用時，考慮到生理和代謝對整個生物體的影響，這就更加復雜了［38］。

或許，Cha 等［45］研究所使用的AgNPs 濃度能更好地反應其對體內(nèi)細胞毒性的影響。研究者將人肝癌細胞置于濃度為2.4 μg/mL、直徑為15 nm 的AgNPs 中，發(fā)現(xiàn)細胞中還原型谷胱甘肽（GSH）的水平和線粒體的功能未受干擾，但確實觀察到了DNA損傷。

可能與AgNPs 皮膚暴露最相關(guān)的研究是Arora等［46］的工作，他們研究了7～20 nm AgNPs 對小鼠原發(fā)成纖維細胞和肝細胞的影響，并觀察到GSH 的降低和超氧化物歧化酶（SOD）水平的升高。因此，作者推測，在較低濃度的銀（纖維母細胞為25 μg/mL，肝細胞為100 μg/mL）時，細胞的抗氧化保護機制增強。值得注意的是，無毒的濃度范圍與納米銀敷料局部應用的濃度范圍相當，這為該敷料的安全性提供了證據(jù)［46］.

此外，當比較AgNPs 毒性和作用模式時，還需要考慮不同批次顆粒的特性。Ahamed 等［47］比較了多糖包被和未包被銀納米顆粒的作用，得出的結(jié)論是包被的AgNPs 比未包被的對DNA 的損傷程度更大，兩種類型的AgNPs 可能經(jīng)歷不同的胞內(nèi)分布模式。

4 總結(jié)和展望

DFU 伴感染是創(chuàng)面經(jīng)久難愈，甚至截肢的重要原因之一。而隨著抗菌藥物耐藥問題的日益嚴重，尋求替代抗菌藥物的壓力也越來越大。AgNPs 因其獨特的理化性質(zhì)和抗菌特性，已被證明在DFU 治療中非常有效［3］。銀用于抗感染已有悠久的歷史，但至今仍未見大規(guī)模的耐藥，這與抗生素廣泛性耐藥形成鮮明對比。因此，該敷料值得在治療DFU 方面推廣應用。

關(guān)于AgNPs 在人體吸收、分布、代謝和排泄等具體過程，我們尚不清楚。如：細胞從受傷皮膚中攝取AgNPs 的機制和程度的問題？AgNPs 能否被轉(zhuǎn)移到全身部位，進入大腦或穿過胎盤，它們?nèi)绾螐捏w內(nèi)清除？在細胞內(nèi)是否會侵害DNA 并造成遺傳損傷的能力？與潛在毒性相關(guān)的AgNPs 表面特征是什么？等等。然而，這些問題并不意味著在DFU 治療中使用此類敷料可能存在安全問題。但這或許是研究者未來探索的方向。目前，能做的可能是摸索治療各類慢性潰瘍，包括DFU 能夠取得最佳療效和安全性的合適劑量。

AgNPs 在殺傷抑制感染創(chuàng)面微生物的同時，對人體的正常細胞也會有一定的細胞毒性作用，可引起正常細胞的凋亡。但臨床尚未見其明顯毒性反應。因此，筆者認為其收益/風險比是有利的，特別是對于出現(xiàn)耐藥菌株的DFU 創(chuàng)面。盡管如此，筆者還是建議使用此類敷料的時間不應超過2 周，如White 等［48］所述。對于特大面積的創(chuàng)面，尤應關(guān)注其對局部和全身的不良反應。另外，納米顆粒比傳統(tǒng)配方提供了更高的銀含量，因此我們在臨床應用時需要進一步研究不同配方的敷料之間的收益/風險比。

作者貢獻度說明：

王徐紅：文獻檢索與收集，論文撰寫：徐磊：文獻檢索與收集；柳國斌：論文撰寫的指導與修正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。