金美英，張偉冬，王婉霖，李泉鋒，趙文海，沙里泉*，崔鎮(zhèn)海*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130017；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成和滑膜增生為特征的骨疾病[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)炎癥機(jī)制在介導(dǎo)生物力學(xué)失調(diào)的影響方面起著核心作用，會(huì)造成關(guān)節(jié)組織生物力學(xué)的紊亂。在KOA 炎癥的過程中，巨噬細(xì)胞會(huì)釋放出IL-1β、IL-6 和TNF-α 等細(xì)胞因子子[4]。這些細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達(dá)，干擾細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），促使II 型膠原蛋白（collagen type II）降解，進(jìn)而損傷關(guān)節(jié)軟骨，加劇KOA 的發(fā)展[5]。目前，KOA 的治療可大致分為減少誘發(fā)的危險(xiǎn)因素、物理方式、關(guān)節(jié)內(nèi)治療、手術(shù)治療和替代治療[6]。非甾體抗炎藥（NSAIDs）和對乙酰氨基酚（Paracetamol）通常被認(rèn)為是治療骨關(guān)節(jié)炎的首選藥物[7]。然而非甾體抗炎藥應(yīng)謹(jǐn)慎用于胃腸道疾病患者，有造成消化道出血、穿孔等風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，安全性高、副作用小的中草藥是防治骨性關(guān)節(jié)炎的較好選擇。本團(tuán)隊(duì)在前期臨床試驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證腰腿痛寧膠囊治療KOA 的確切療效。此次研究旨在觀察木瓜蛋白酶（papain）誘導(dǎo)的兔早期 KOA 模型中炎癥因子的水平，研究腰腿痛寧膠囊對木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔早期 KOA 的保護(hù)作用。

1 動(dòng)物與材料

1.1 動(dòng)物

新西蘭大白兔20 只，體質(zhì)量（2.01±0.15）kg，購于哈爾濱市道里區(qū)駿琦養(yǎng)殖場[生產(chǎn)許可證編號：SCXK（黑）2021-004]。由黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)單位檢測，實(shí)驗(yàn)場地在長春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)室條件：溫度16 ～26℃，濕度40%～70%。飼養(yǎng)時(shí)間：上午8:30，下午3:30。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守善待動(dòng)物規(guī)定，最大限度減少動(dòng)物的痛苦，減少動(dòng)物使用數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理審批號：2020226）。

1.2 藥物及試劑

腰腿痛寧膠囊（吉藥制備字：Z20200131000，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院），處方成分：熟地黃、雞血藤、乳香、狗脊、薏苡仁、烏梢蛇、骨碎補(bǔ)、黃芪、牡蠣、鹿角霜、伸筋草、龍骨1、五靈脂、延胡索、地龍、冰片、當(dāng)歸、蜈蚣、天麻、牛膝。木瓜蛋白酶（BS190-25g，Biosharp），L- 半胱氨酸（BS181-25g，Biosharp），速眠新Ⅱ[ 獸藥字（2010）070031582，圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司]，舒泰50[（2015）外獸藥證號43 號，Virbac China]，仙靈骨葆膠囊（國藥準(zhǔn)字：Z20025337，同濟(jì)堂制藥有限公司），ELISA 試劑盒 ：IL-1β（SP25549，Saipei Biotech Co）、IL-6（SP25495，Saipei Biotech Co）、TNF-α（SP25520，Saipei Biotech Co）。

1.3 主要儀器

動(dòng)物跑步機(jī)（宇晟YS-J100），電子秤（Electronic SF-400），恒溫?fù)u床（BLabotery ZHPW-250），染色機(jī)（DIAPATH Giotto），X 射線攝像系統(tǒng)（蘇州唯特銳醫(yī)療器械有限公司 VDR-1800），脫水機(jī)（DIAPATH Donatello），組織包埋中心 （Tissue-Tek TEL），正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及模型制備

20 只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為空白組、模型組、仙靈骨葆組和腰腿痛寧組，每組5 只。模型組、仙靈骨葆組和腰腿痛寧組進(jìn)行KOA 造摸。具體操作步驟：兔子保定后，剔除左膝關(guān)節(jié)局部兔毛，碘伏消毒液和75%酒精依次進(jìn)行消毒，屈曲膝關(guān)節(jié)75°，定位外膝眼為進(jìn)針點(diǎn)，誘導(dǎo)劑由Papain（4%）和L-Cysteine（0.03 mol·L-1）配伍，注射量0.5 mL·kg-1。在造模第1 天、第3 天、第7 天各注射1 次。同時(shí)，每日定時(shí)強(qiáng)迫兔在跑步機(jī)活動(dòng)，早晚各1 次，每次時(shí)長為15 min，連續(xù)驅(qū)趕14 d。造模21 d 后，出現(xiàn)左膝關(guān)節(jié)腫脹，屈伸障礙，X 線提示膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變，判定為KOA 模型成功。

2.2 干預(yù)方法

按照以往實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行等量換算，腰腿痛寧膠囊劑量為0.177 g·kg-1，仙靈骨葆膠囊劑量為0.099 g·kg-1。腰腿痛寧膠囊和仙靈骨葆膠囊去除膠囊外衣后，所得藥粉均用10 mL 的純凈水配成溶液，每日1 次，連續(xù)灌胃28 d?？瞻捉M和模型組無需特殊處理，常規(guī)飼養(yǎng)即可。

2.3 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兔右后肢肌肉注射麻醉，麻醉劑（舒泰50 和速眠新Ⅱ，配比 6:1），0.35 mL·kg-1。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.8 mL 無菌生理鹽水，屈伸關(guān)節(jié)15 次，抽取膝關(guān)節(jié)液 0.5 mL，耳緣靜脈處取血 5 mL，均注入無菌 EP 管中離心，設(shè)置參數(shù)為3000 r·min-1，運(yùn)轉(zhuǎn)10 min，吸取上清液后置于-20 ℃ 冰箱中待測。采用空氣栓塞法進(jìn)行安樂死，打開左膝關(guān)節(jié)腔，用咬骨鉗夾取股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端，放入4%多聚甲醛固定液中保存。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 兔左膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度測量 觀察各組治療前后左膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度改變情況。在治療前（OA 模型建立后）和治療結(jié)束后，用量角器測量兔左后肢膝關(guān)節(jié)活動(dòng)角度，評估關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍。量角器的軸心放置在膝關(guān)節(jié)的中心，量角器的靜止臂與股骨平行固定，移動(dòng)臂跟蹤脛骨的運(yùn)動(dòng)。分別記錄膝關(guān)節(jié)處于最大伸展和屈曲狀態(tài)時(shí)的角度（°）。膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍的計(jì)算方法是最大伸展角度減去最大屈曲角度。

2.4.2 X 線片影像 觀察各組拍攝X 線片，觀察膝關(guān)節(jié)情況。兔置于固定器上，用眼罩遮住雙目，待到呼吸平順，被動(dòng)延展兔雙后肢，保持在適度拍攝體位。正位片拍攝方法：1）兔取仰臥位，被動(dòng)屈髖30°，髖外展15°，盡量伸直膝關(guān)節(jié)，保持髕骨位于正前方，放射球管距離拍攝部位110 mm；2）拍攝側(cè)位片時(shí)取側(cè)臥位，左后肢伸直置于前側(cè)，右后肢被動(dòng)屈髖70°、屈膝30°置于后側(cè)，放射球管距離拍攝部位110 mm；3）設(shè)置檢驗(yàn)參數(shù)：工作電壓45 kVP，照射電流160 mA，照射量為5.02 mAs，曝光時(shí)間31 ms。

2.4.3 軟骨組織病理觀察 所有實(shí)驗(yàn)兔左側(cè)脛骨關(guān)節(jié)面處進(jìn)行軟骨取材，用鋒利骨鑿鑿至深達(dá)軟骨下骨層，軟骨獲取后需要修剪成大小合適組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中保存。經(jīng)過脫水脫鈣等一系列處理后，用光學(xué)顯微鏡對軟骨組織情況觀察拍照。

2.4.4 軟骨損傷程度評價(jià) 采用Mankin 評分標(biāo)準(zhǔn)判定軟骨的損傷程度。

2.4.5 血清和關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平測定 采用ELISA 法測定血清和關(guān)節(jié)液中 IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，具體檢測操作方法嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書上進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 9.00 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)方差齊性的數(shù)據(jù)，采用配對t檢驗(yàn)法進(jìn)行組內(nèi)比較，LSD-t 法進(jìn)行組間比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組左膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度變化比較

見表1。

表1 各組左膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度變化比較（±s，n = 5） °

表1 各組左膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度變化比較（±s，n = 5） °

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與治療前比較，▲P ＜0.05

組別治療前治療后空白組138.40±1.67140.00±3.00模型組 91.40±3.85#100.80±4.38腰腿痛寧組 88.20±5.67#128.40±6.39△▲仙靈骨葆組 90.00±7.52#130.20±4.32△▲

3.2 各組左膝關(guān)節(jié)X線影像學(xué)比較

各組X 線片結(jié)果顯示，空白組兔膝關(guān)節(jié)雙側(cè)髁間隙距離等寬，脛骨平臺(tái)輪廓清晰，未見骨贅；模型組外側(cè)髁間隙明顯變窄，脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面粗糙不平，可見髁間隆起變銳，軟骨下骨骨質(zhì)硬化，骨贅形成；仙靈骨葆組外側(cè)髁間隙窄于內(nèi)側(cè)，髁間隆起變銳，骨贅形成；腰腿痛寧組關(guān)節(jié)間隙未見明顯異常，髁間隆起稍變銳，骨贅形成。見圖1。

圖1 各組左膝關(guān)節(jié)X線影像學(xué)比較

3.3 各組病理組織HE 染色結(jié)果

HE 結(jié)果顯示，空白組軟骨組織染色均勻，表面光滑，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列規(guī)則，潮線完整；與空白組比較，模型組軟骨組織顯示局部軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，有多處裂隙，出現(xiàn)陷窩，符合骨關(guān)節(jié)炎病理改變，提示造模成功；仙靈骨葆組關(guān)節(jié)軟骨中可見裂隙，軟骨欠光澤，關(guān)節(jié)面稍不平整，但情況好于模型組；腰腿痛寧組顯示關(guān)節(jié)軟骨中可見少量裂隙，關(guān)節(jié)表面較光滑平整，結(jié)構(gòu)改善。見圖2。

圖2 各組病理組織HE 染色結(jié)果

3.4 各組治療后左膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin 評分比較

見表2。

表2 各組治療后左膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin 評分比較（±s，n = 5） 分

表2 各組治療后左膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin 評分比較（±s，n = 5） 分

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別評分空白組0.00±0.00模型組5.00±0.71#腰腿痛寧組2.20±0.84△仙靈骨葆組2.40±1.14△

3.5 各組治療后血清中炎癥因子水平比較

見表3、圖3。

圖3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較

表3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

表3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白組106.18±9.80 106.18±9.80410.25±43.05模型組152.75±4.03# 152.75±4.03# 674.42±38.30#腰腿痛寧組108.09±8.50△108.09±8.50△ 466.57±64.49△仙靈骨葆組108.64±4.19△108.64±4.19△ 463.47±57.85△

3.6 各組治療后關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平比較

見表4、圖4。

圖4 各組治療后關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平比較

表4 各組治療后關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

表4 各組治療后關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白組 67.29±6.55 513.18±39.01113.36±24.54模型組100.63±11.29# 909.05±98.42# 179.67±13.27#腰腿痛寧組 74.02±9.44△542.71±106.08△132.60±30.20△仙靈骨葆組 76.62±9.75△542.02±99.51△ 124.46±28.15△

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎與腎氣虧損致血瘀痹阻有關(guān)，患者伴有膝部疼痛，關(guān)節(jié)屈伸不利，甚則僵硬。本人經(jīng)過數(shù)十載的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出了“益腎填精、活血除痹”的獨(dú)特診治思路，研制出腰腿痛寧膠囊。此方藥具有益腎填精之效，可濡養(yǎng)骨骼強(qiáng)健經(jīng)筋。方中選用鹿角霜，取其補(bǔ)腎陽亦強(qiáng)筋骨之用，在配伍熟地黃滋陰，益精填髓，二者同用平調(diào)陰陽，壯其筋骨。骨碎補(bǔ)能活瘀血，續(xù)斷傷，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療骨折疾病時(shí)大量應(yīng)用，有破血止血，補(bǔ)傷折之說。當(dāng)歸可活血、亦補(bǔ)血；狗脊強(qiáng)筋骨，能止痛；黃芪補(bǔ)氣血，驅(qū)病邪。地龍，烏蛇，蜈蚣配伍，增強(qiáng)活血通絡(luò)之功，氣血聚處，祛邪以無痕。諸藥共用，周流氣血，通暢經(jīng)脈，其病可愈。仙靈骨葆膠囊在診療指南（2020年版）[9]中為膝關(guān)節(jié)炎推薦用藥，臨床證實(shí)能有效改善膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的各項(xiàng)指標(biāo)[10]。將其作為陽性對照組藥物，能與腰腿痛寧膠囊組形成良好對照。

團(tuán)隊(duì)前期實(shí)踐證明腰腿痛寧膠囊在治療 KOA 臨床療效顯著[11]，此次研究設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要探討其作用機(jī)制。木瓜蛋白酶能直接作用于兔關(guān)節(jié)軟骨，引起細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的降解[12]。蛋白多糖的缺失會(huì)相對增加膠原蛋白的暴露，促炎因子和基質(zhì)金屬蛋白酶對基質(zhì)的破壞也會(huì)加強(qiáng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的大量流失[13]。然而，軟骨細(xì)胞新分泌的膠原蛋白等基質(zhì)成分的性能較差，軟骨基質(zhì)的生物和機(jī)械性能發(fā)生變化，軟骨失去正常的彈性和抗壓能力，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)退化[14]。這種方法可以避免手術(shù)引起的關(guān)節(jié)腔內(nèi)出血、結(jié)構(gòu)破壞等并發(fā)癥的干擾，適用于研究軟骨的病理變化和藥物對早期KOA 的治療效果。兔造摸后，左下肢均出現(xiàn)不同程度腫脹，皮溫升高情況。驅(qū)使兔被迫運(yùn)動(dòng)，可見兔左后肢因疼痛無法觸及地面，出現(xiàn)跛行。同時(shí)，抽取患肢關(guān)節(jié)液時(shí)，呈渾濁狀態(tài)，以上改變與早期KOA 病理發(fā)展基本一致，說明兔KOA 模型建立成功。

研究[15]發(fā)現(xiàn)，軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的增加是骨關(guān)節(jié)炎的主要特征，炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起核心作用。在骨關(guān)節(jié)炎的早期階段，分解代謝活性增加，這與炎癥介質(zhì)、軟骨降解蛋白和應(yīng)激反應(yīng)因子的表達(dá)增加有關(guān)[16]。這些改變導(dǎo)致軟骨細(xì)胞丟失，從淺層的纖顫到更復(fù)雜和更深的裂隙[17]。IL-6 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生，并通過增強(qiáng)KOA 中IL-1β 和TNF-α 等細(xì)胞因子的破壞作用而加速軟骨基質(zhì)的降解[18-19]。同時(shí)，TNF-α也可誘導(dǎo) IL-1、IL-6 等的釋放，它們之間相互影響，共同作用于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)[20]。給藥28 d 后，藥物治療組脛骨軟骨表面粗糙度減弱，軟骨細(xì)胞排列更加整齊，同時(shí)血清和關(guān)節(jié)液中的炎癥因子明顯減少。驅(qū)趕兔被迫運(yùn)動(dòng)時(shí)，治療組后肢蹬地有力，而模型組仍有不同程度跛行。實(shí)驗(yàn)中兔關(guān)節(jié)損傷程度基本與炎癥因子水平呈正相關(guān)，說明通過抑制血清和關(guān)節(jié)液中1L-1β、IL-6、TNF-α 水平可以延緩KOA 病情發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)腰腿痛寧膠囊干預(yù)后，兔早期KOA 模型血清和關(guān)節(jié)液中1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平均明顯降低。說明腰腿痛寧膠囊能延緩軟骨的退化，其作用機(jī)制可能與降低炎癥因子水平有關(guān)。由于腰腿痛寧膠囊是中藥復(fù)方制劑，且KOA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，所以其藥物有效成分和作用靶點(diǎn)需進(jìn)一步深入研究。