張 馥，胡若寧，高 萍，匡 璐，夏 磊，周星怡，朱家宸，柳 旭，時 玉，褚海燕，王保戰(zhàn)，蔣建東

青藏高原三種典型生境中硝化微生物分布和群落結(jié)構(gòu)①

張 馥1，胡若寧1，高 萍1，匡 璐1，夏 磊1，周星怡1，朱家宸1，柳 旭2，時 玉3，褚海燕2，王保戰(zhàn)1*，蔣建東1

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室，南京 210095；2 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；3 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004)

以青藏高原3種典型生境(荒漠草地、濕地和鹽堿地)為研究對象，通過功能基因qPCR和16S rRNA基因擴增子測序，研究了其氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)、氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)、亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)和完全硝化細(xì)菌(complete ammonia oxidizer，CMX)的分布與群落結(jié)構(gòu)特征。qPCR結(jié)果表明，荒漠草地和鹽堿地中3種氨氧化微生物，其豐度順序為AOA>CMX>AOB，而在濕地中則為CMX≥AOA>AOB。各生境中AOA主要類群為土壤類群(即group 1.1b)，且其中約半數(shù)屬于屬分支，該分支在北極凍土中也有分布?；哪莸睾蜐竦刂蠥OB主要為亞硝化螺菌屬(spp.，71.21% ～ 100%)，而鹽堿地主要為亞硝化單胞菌屬(spp.，75.51% ～ 88.71%)。3種生境中NOB主要類群均為硝化螺菌屬(spp.，70.87% ～ 98.79%)。clade A和clade B分支的CMX在各生境均存在，且二者比例相當(dāng)。值得注意的是，大多生境中都檢測出一種或多種典型海洋類群硝化微生物，比如group 1.1a的AOA、的AOB、Lineage 4的NOB，這強烈暗示青藏高原硝化微生物可能受青藏高原古海洋環(huán)境的影響。

青藏高原；氨氧化古菌；氨氧化細(xì)菌；亞硝酸鹽氧化微生物；完全硝化微生物

青藏高原是全球面積最大、海拔最高的高原，平均海拔為4 378 m，被稱為地球的“第三極”。青藏高原生態(tài)系統(tǒng)多樣性極高，擁有荒漠、草地、森林、湖泊濕地、河流濕地、鹽堿地等，且其高寒氣候條件和5 000萬年前的古海洋生境可能孕育了特有的微生物群落及結(jié)構(gòu)，驅(qū)動了青藏高原的物質(zhì)能量循環(huán)，在全球氣候變化中扮演了重要的角色。

微生物硝化過程是全球氮素循環(huán)的核心環(huán)節(jié)，是氮素循環(huán)中唯一的氧化途徑，即將NH4+氧化成NO2–，然后NO2–被進一步氧化成NO3–[1]。前者主要由氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)或氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)驅(qū)動，在有氧條件下由氨單加氧酶(ammonia monooxygenase，AMO)催化氨(NH3)氧化為羥胺(NH2OH)，又在羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidoreductase，HAO)的催化下迅速氧化為亞硝酸鹽(NO2–)，該過程被稱為氨氧化過程，是硝化過程的限速步驟[2]。后者由亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)驅(qū)動，通過亞硝酸鹽氧化還原酶(NXR)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。而完全硝化微生物(complete ammonia oxidizer，Comammox或CMX)的發(fā)現(xiàn)改變了上百年來的硝化過程必須由兩種微生物接力完成的經(jīng)典研究范式[3–4]。然而這些硝化微生物在青藏高原典型生境中的分布規(guī)律和群落結(jié)構(gòu)特征卻并不清楚。

本文針對青藏高原荒漠草地、濕地(河流/湖泊)、鹽堿地3種典型生境，通過功能基因?qū)崟r熒光定量PCR(qPCR)、16S rRNA基因擴增子Illumina HiSeq測序等技術(shù)手段，解析青藏高原3種典型生境的硝化微生物分布和群落結(jié)構(gòu)特征，將有助于加深對青藏高原硝化過程微生物學(xué)機制的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

供試5個土壤的采樣地點位于30°N附近的青藏高原，分別為措勤、申扎、納木錯、雅魯藏布江中游和扎布耶茶卡(圖1)。研究地區(qū)屬高原山地氣候，平均海拔4 000 m以上，年均氣溫1.7℃，年均降水400 mm。本研究共采集了10個樣本，將取自措勤和申扎的荒漠草地土壤樣本命名為C1、C2、C3、C4，將取自納木錯和雅魯藏布江中游的濕地土壤樣本命名為S5、S6、S7、S8，將取自扎布耶茶卡的鹽堿地土壤樣本命名為Z9、Z10。

圖1 5個土壤采樣點地理位置示意圖

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

使用pH計(Thermo Orion-868，MA，USA)測定土壤pH，水土質(zhì)量比為5∶1；使用總有機碳分析儀(Multi N/C 3100，Analytik Jena AG，德國)測定土壤可溶性有機碳(DOC)含量；使用連續(xù)流動分析儀(San ++ System，Skalar，Holland)測定土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3–-N)和溶解性總氮(DTN)含量(表1)。溶解性有機氮(DON)使用以下公式計算：DON = DTN – (NH4+-N + NO3–-N)。將沉積物風(fēng)干并將其篩分至2 mm，通過燃燒法測定(Thermo Fisher Scientific Flash Smart Elemental Analyzer，Bremen，Germany)測定土壤全碳(TC)和全氮(TN)含量。ICP-AES Optima 8000 儀器(Perkin-Elmer，Waltham，MA，USA)用于測量全磷(TP)和全鉀(TK)含量。

1.3 土壤DNA提取

土壤微生物總DNA提取采用Fast DNA Spin kit for soil 試劑盒(MP Biomedicals，美國)。根據(jù)試劑盒操作說明提取土壤微生物總DNA，并使用Nanodrop ND-1000超微量分光光度計(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，美國)和1% 的凝膠電泳檢測DNA 濃度和質(zhì)量，將DNA于–20℃保藏。

1.4 amoA基因定量PCR

利用ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，美國)對青藏高原土壤中AOA、AOB和CMX 的基因進行定量分析。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，日本)，0.8 μL上下游引物(10 μmol/L)，2 μL(約 1 ～ 10 ng)模板DNA，補充雙蒸水至20 μL。qPCR引物和反應(yīng)條件見表2。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)包含3個測試平行。將含有AOA、AOB和CMX基因的單克隆質(zhì)粒DNA梯度稀釋成101～ 109的標(biāo)準(zhǔn)濃度作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 土壤的基本理化性質(zhì)

表2 定量PCR擴增引物及反應(yīng)條件

1.5 16S rRNA基因PCR擴增及高通量測序

細(xì)菌多樣性測定方法：采用16S rDNA 序列分析方法，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測定。16S rDNA的PCR擴增：引物為515F 5′-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′和907R 5′-CCGTCAATTCMTTT RAGTTT-3′。PCR 的 20 μL 混合反應(yīng)體系包括 4 μL 5×FastPfu Buffer，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA 和10 ng的樣本DNA。采用ABI GeneAmp?9700型PCR 儀，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；29個循環(huán)(95 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸 10 min。

測序數(shù)據(jù)處理：將從 Illumina HiSeq 測序平臺得到的初始數(shù)據(jù)根據(jù)Barcode序列拆分為不同樣品數(shù)據(jù)，并且截去PCR擴增引物序列和Barcode序列；將拆分完成的數(shù)據(jù)應(yīng)用FLASH(V1.2.7，http://ccb. jhu.edu/software/FLASH/)對每個樣品的reads進行拼接，拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)；將原始Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值≤3)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個低質(zhì)量堿基位點截斷，進一步過濾去除其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75% 的Tags；與數(shù)據(jù)庫(Gold database，http:// drive5.com/uchime/uchime_download.html)進行比對(UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/ manual/uchime_algo.html)，檢測嵌合體序列；去除嵌合體序列得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

利用MUSCLE(Multiple Protein Sequence Alignment)軟件對代表性序列進行多序列比對，使用Gblocks提取保守序列，然后用IQ-tree軟件構(gòu)建AOA、AOB、NOB的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，通過“-m MF -T AUTO”選擇最佳進化模型，利用最佳進化模型，并設(shè)置參數(shù)“-FMP -bb 1000”，進行進化樹構(gòu)建。

1.7 共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了研究硝化微生物與非硝化微生物，以及硝化微生物與關(guān)鍵環(huán)境因子之間的關(guān)系，本研究進行了共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)(co-occurrence network)分析。篩選出至少在5個樣本中出現(xiàn)的OTU之間所有可能的Spearman秩相關(guān)。如果Spearman相關(guān)系數(shù)()>0.6且<0.05，則OTU之間存在有效共現(xiàn)性。利用Cytoscape v3.9.0軟件生成節(jié)點文件和邊文件，并通過Gephi v0.9.2對網(wǎng)絡(luò)進行了可視化。

2 結(jié)果

2.1 總微生物群落組成

土壤總微生物16S rRNA基因擴增子測序發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctobacteria)、芽單胞菌門(Gemmabacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes) 、裝甲菌門(Armatimonadetes)和候選門WPS-1(Candidate division WPS-1)是青藏高原3種生境中豐度最高的微生物類群(圖2A)。NMDS分析發(fā)現(xiàn)，不同生境中樣品微生物群落顯著聚集，其中荒漠草地和濕地微生物群落結(jié)構(gòu)較為接近(圖2B)。進一步的Mantel test分析發(fā)現(xiàn)，NH4+-N和pH是驅(qū)動總微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子(圖2C)。

2.2 AOA、AOB 和 CMX amoA 基因豐度

基于基因的qPCR結(jié)果揭示，AOA在荒漠草地和鹽堿地兩種生境中豐度最高，分別為5.26×106～ 9.78×106copies/g和1.42×107～ 2.15×107copies/g，是AOB和CMX基因豐度的1 ～ 2個數(shù)量級(圖3)。而特別的是，CMX基因在絕大多數(shù)濕地樣品中(4個樣品中的3個)豐度最高，分別為5.27×104～ 2.87× 106copies/g，其豐度與AOA的基因豐度相當(dāng)或高于AOA，顯著高于AOB的基因豐度(圖3)。

圖2 總微生物群落組成(A)、NMDS分析(B)及與土壤理化性質(zhì)的曼特爾檢驗(C)

(圖中不同小寫字母表示同一樣地不同氨氧化微生物間差異顯著(P<0.05))

2.3 AOA、AOB和NOB系統(tǒng)發(fā)育和群落組成

基于16S rRNA基因擴增子測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青藏高原3種生境中AOA主要類群為土壤類群(即group 1.1b)，且其中約半數(shù)以上屬于最新發(fā)現(xiàn)的分支(圖4)，該分支也存在于北極凍土中[8]。3種生境中AOB類群結(jié)構(gòu)也差異顯著，荒漠草地、濕地(4個樣品中的3個)主要為亞硝化螺菌屬(，71.21% ～ 100%)，而鹽堿地主要為亞硝化單胞菌屬(，75.51% ～ 88.71%) (圖5)。各生境中NOB主導(dǎo)類群均為硝化螺菌屬(，70.87% ～ 98.79%)，且lineage II是其主導(dǎo)分支。由于目前已知的CMX均屬于該分支，且經(jīng)典NOB和CMX無法在16S rRNA基因水平進行區(qū)分，因此lineage II同時包含了CMX的16S rRNA基因序列(圖6)。硝化菌屬()僅占3種生境中NOB總序列數(shù)的1.22% ～ 29.13%(圖6)。

圖4 AOA 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹及在不同樣本中的相對豐度

特別的是，在多個生境中檢測到了典型海洋類群的硝化微生物，如其中一個荒漠草地和一個濕地樣品包含了較高比例的海洋類群AOA(即group 1.1a)，分別為12.77% 和51.14%，且主要為海岸口分支(圖4)。而在濕地的兩個樣品中均檢測到了典型海洋來源的AOB，即亞硝化單胞菌屬海洋譜系()，豐度分別為13.64% 和29.51%(圖5)；而在濕地及鹽堿地中均檢測到了典型海洋分支的NOB，即lineage 4，豐度為0.64% ～ 3.90%(圖6)。

2.4 硝化微生物網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系

微生物共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，AOA ()和與非硝化微生物物種間多為正相關(guān)連接，分別占總連接數(shù)的68.40% 和92.13%(圖7A)。而AOB()和與非硝化微生物物種間以負(fù)相關(guān)連接為主，分別占總連接數(shù)的65.19% 和52.57%(圖7A)。進一步的硝化微生物與環(huán)境因子相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，DON、DOC、TK和TP是影響AOA()的主要環(huán)境因子(圖7B)，多種環(huán)境因子(除了TC和NO3–-N)均與AOB ()有顯著相關(guān)性，DOC、DON和NH4+-N等多種環(huán)境因子均與有顯著相關(guān)性(圖7B)，而只有NO3–-N與其有顯著的相關(guān)性(圖7B)。

圖5 AOB 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹及在不同樣本中的相對豐度

圖6 NOB 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹及在不同樣本中的相對豐度

3 討論

青藏高原被稱為地球的“第三極”，總面積高達(dá)2.62×108hm2，其高寒氣候條件和多樣性的生境以及其古海洋環(huán)境，可能塑造了其獨特的硝化微生物群落，然而目前對青藏高原硝化微生物種群特征及其分布規(guī)律仍知之甚少。本研究以荒漠草地、濕地和鹽堿地3種典型生境為研究對象，系統(tǒng)分析了硝化微生物分布規(guī)律和群落結(jié)構(gòu)特征，研究發(fā)現(xiàn)，AOA、AOB和NOB3種硝化微生物在不同生境中具有獨特的類群，如與北極凍土和海洋生境同類群的AOA，且受pH和NH4+-N等多種環(huán)境因子的影響。該研究加深了對青藏高原硝化過程微生物生態(tài)分布和群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)知。

在土壤總微生物群落結(jié)構(gòu)方面，發(fā)現(xiàn)NH4+-N和pH是影響3種生境總體微生物群落最重要的兩個環(huán)境因子(圖2C)。而NH4+-N和pH也是影響硝化微生物生理代謝活性和生態(tài)分布的關(guān)鍵環(huán)境因子，暗示了3種生境中硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)分布的特異性[9]。比如，3種生境中AOA主要類群為土壤類群(即group 1.1b)，且其中約半數(shù)以上屬于分支。含有類群的序列最早發(fā)現(xiàn)于土壤生境，被稱為29i4[10]，隨后在北極凍土中富集到了該類群的菌株，證明該類群能夠適應(yīng)低溫環(huán)境，這和青藏高原常年低溫氣候特點相互吻合[8]。Wang等[11]通過穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)，首次明確證明該類群可以主導(dǎo)高銨投加條件下水稻土的氨氧化過程。隨后國內(nèi)外多個研究團隊在污染土壤[12]、旱地土壤[13]、廢水生境[14]和水稻土[15]中分離到了該類群的純菌株，并把該類群命名為clade[12]，且發(fā)現(xiàn)該類確實可以耐受高濃度銨[13]。Wang 等[16]通過生長活性測定、基因組和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，該類群代表性菌株N. oleophilus MY3可以耐受酸性pH環(huán)境，而本研究的3種生境均偏堿性環(huán)境。由此可見，類群可能是目前發(fā)現(xiàn)的溫度、底物濃度和pH適應(yīng)范圍最為廣泛的AOA類群。

(圖A展示了硝化微生物與非硝化微生物的相互作用關(guān)系；圖B展示了各硝化OTU與土壤理化性質(zhì)的互作關(guān)系， “＋”表示正相關(guān)，“－”表示負(fù)相關(guān))

在5 000萬年前印度與歐亞板塊開始碰撞逐漸形成目前的青藏高原之前，該地區(qū)曾經(jīng)是特提斯古海洋(Tethys Sea)。本研究在3種典型生境中大多檢測出了典型海洋類群的硝化微生物，如荒漠草地和河流濕地中檢出了group 1.1a分支的AOA，且主要屬于estuarine/coastal marine clade[16]；另有研究在湖泊中檢出了典型海洋來源的類群的AOB[17]，在河流沉積物中檢出了典型海洋分支的NOB，即lineage 4[18]。這一特征在已經(jīng)研究的農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中包括濕地等生境的硝化微生物群落中極少發(fā)現(xiàn)[9,11,16,19–21]，強烈暗示青藏高原硝化微生物類群除了受近代和當(dāng)前環(huán)境影響，還可能受5 000萬年前古海洋環(huán)境的影響。另外，值得注意的是，本研究中包括了典型的鹽堿地，其具有較高的土壤鹽度，而荒漠草地和濕地也具有較高的pH，這有可能是導(dǎo)致以上生境依然保留了部分海洋類群硝化微生物特征的原因之一。

完全硝化微生物(CMX)的發(fā)現(xiàn)改變了上百年來硝化微生物研究的經(jīng)典范式[3–4]。目前發(fā)現(xiàn)，CMX在地下水、土壤、河流、濕地、廢水處理系統(tǒng)和海岸口等多種生境中廣泛分布，但在遠(yuǎn)洋海水中暫未發(fā)現(xiàn)其存在[22–23]。而本研究首次在青藏高原高寒生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)CMX的存在，且在大多數(shù)河流濕地和湖泊濕地中其豐度顯著高于AOA和AOB。這說明CMX生境適應(yīng)的廣泛性，暗示CMX在青藏高原氮循環(huán)中可能發(fā)揮了重要作用。未來純菌株分離、生理代謝特征和基因組研究，將有助于進一步加深對青藏高于CMX類群生理生態(tài)功能的認(rèn)知。

總之，本研究較為完整地解析了青藏高原3種典型生境中硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和分布特征，對認(rèn)知青藏高原氮循環(huán)和微生物生態(tài)和遺傳進化具有重要意義。

4 結(jié)論

青藏高原荒漠草地和鹽堿地中3種氨氧化微生物的豐度順序為AOA>CMX>AOB，而在濕地中則為CMX≥AOA>AOB。3種生境中AOA主要類群為土壤類群(即group 1.1b)，且約50% 屬于分支，該分支在北極凍土中也有發(fā)現(xiàn)，暗示了該類群能夠耐受低溫的特征?；哪莸睾蜐竦刂蠥OB主要類群為，而鹽堿地主要為。3種生境中NOB主要類群均為。clade A和clade B分支的CMX在各生境均存在，且二者比例相當(dāng)。特別的是，大多生境中存在典型海洋來源的硝化微生物類群，如group 1.1a的AOA、的AOB、Lineage 4的NOB，這強烈暗示青藏高原硝化微生物可能受青藏高原古海洋環(huán)境的影響。

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Distribution and Community Structures of Nitrifying Microorganisms in Three Typical Habitats of Qinghai-Tibet Plateau

ZHANG Fu1, HU Ruoning1, GAO Ping1, KUANG Lu1, XIA Lei1, ZHOU Xingyi1, ZHU Jiachen1, LIU Xu2, SHI Yu3, CHU Haiyan2, WANG Baozhan1*, JIANG Jiandong1

(1 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210095, China; 2 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China)

The absolute abundance ofgenes of ammonia-oxidizing archaea (AOA), ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and complete ammonia oxidizer (CMX) in three typital habitats of Qinghai-Tibet Plateau were determined by the qPCR, and the community structures of AOA, AOB and nitrite-oxidizing bacteria (NOB) were analyzed by using the Illumina HiSeq sequencing of the 16S rRNA gene amplicons. The qPCR demonstrates that the abundance ofgenes of ammonia oxidizers is in the order AOA>CMX>AOB in the desert grassland and alkaline saline soils, but CMX≥AOA>AOB in the wetlands. The 16S rRNA gene amplicon analysis reveals that the AOA mostly are belonged to theclade of the soil group 1.1b in nearly all three habitats, which is also detected in the Arctic soils.is the predominant genus in the desert grassland and wetland with 71.21%–100% of all AOB sequences, but 75.51%–88.71% of AOB in alkaline saline soils fall into the genus of. However, NOB of all three habitats are mostly affiliated with the genus ofwith 70.87%–98.79% of all NOB sequences. Both clade A and B of CMX are detected in all three habitats and with the similar relative abundances. Notably, most habitats in this study harbor typical lineages of nitrifier specific from marine ecosystems, for instance, group 1.1a of AOA,of AOB and lineage 4 of NOB, strongly indicating that these nitrifying communities are also influenced by the paleo-ocean environment since the Qinghai-Tibet Plateau was Tethys Sea 500 Ma year ago.

Qinghai-Tibet Platea; Ammonia-oxidizing archaea; Ammonia-oxidizing bacteria; Nitrite-oxidizing bacteria; Comammox

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.02.013

張馥, 胡若寧, 高萍, 等. 青藏高原三種典型生境中硝化微生物分布和群落結(jié)構(gòu). 土壤, 2023, 55(2): 331–339.

國家自然科學(xué)基金項目(41977056)資助。

(bzwang@njau.edu.cn)

張馥(1997—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail: 2019116054@njau.edu.cn