楊超勍，歐陽建萍，2，邵 君，許春明，孫啟彪，2，季曉紅，2，何 剛，2**

（1.九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332005；2.九江市真菌資源保育及應用重點實驗室，江西 九江 332005）

豬苓多孔菌[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]又稱傘形多孔菌，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）多孔菌屬（Polyporus），主要分布于河北、陜西、四川、云南、吉林、安徽等地，是一種名貴的藥用真菌[1]。豬苓多孔菌的干燥菌核（即豬苓菌核）亦稱為豬苓、豬屎苓、野豬苓等，是其入藥部位，具有利水滲濕之功效，主治小便不利、水腫、淋濁、泄瀉、帶下等癥[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，豬苓化學成分豐富，生物活性多樣，具有利尿、護腎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4-5]。隨著豬苓藥用價值逐漸受到人們重視，市場對豬苓藥材的需求也越來越旺盛。然而，市面所售豬苓質(zhì)量參差不齊，普通百姓缺乏專業(yè)知識難以辨別真?zhèn)?、評判品質(zhì)，存在以次充好甚至以假冒真等現(xiàn)象，危害人民群眾用藥安全。

為了解線上平臺所售豬苓品質(zhì)現(xiàn)狀，通過分子鑒定并對7 批線上平臺所售豬苓藥材的性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、總灰分、酸不溶性灰分和主要成分含量進行分析。旨在為豬苓藥材真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評價提供科學依據(jù)，為合理利用豬苓資源、促進豬苓線上市場健康有序發(fā)展提供參考。

1 試驗器材

1.1 儀器

UltiMate 3000RSLC 超高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；BX53 生物顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；BioRad C1000 Touch 梯度PCR 儀，美國伯樂公司；YTH-2.5-10 定時箱式電阻爐，紹興市蘇珀儀器有限公司；AUW120D 分析天平，日本島津公司；KQ-500TDV 型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；XT-500a 多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司。

1.2 試劑

麥角甾醇對照品（純度≥98%），成都普思生物科技股份有限公司；甲醇為色譜純；石油醚（60～90 ℃，純度99%）、乙酸乙酯、香草醛、濃鹽酸、濃硝酸、濃硫酸等試劑均為分析純；水為超純水；真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 材料

試驗所用7 批豬苓藥材樣品均購自線上銷售平臺，并進行樣品鑒定。

2 試驗方法

2.1 豬苓的性狀和鑒別

參照《中華人民共和國藥典（2020年版一部）》[3]中豬苓藥材性狀與鑒別項下的要求和方法，對其進行外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)和薄層色譜檢測。

2.2 豬苓分子鑒定

采用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，按照說明書提取樣品DNA。選用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進行擴增，獲取豬苓樣品ITS 區(qū)基因片段[6]。PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序。

利用Chromas 軟件仔細核對所測序列峰圖與堿基序列，并在NCBI 網(wǎng)站進行BLAST 比對，以確保所得豬苓序列的準確性。為比較與文獻報道的豬苓異同，參考ZHOU 等[7]的研究，從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)內(nèi)群和外群序列。運用MEGA 軟件將本研究中測得的序列和下載的序列構(gòu)建序列矩陣，使用MUSCLE 3.8.31 軟件對序列矩陣進行比對分析，借助Gblocks v.0.91b 軟件刪去比對不理想?yún)^(qū)域或高變區(qū)[8]。比對后的序列矩陣基于Akaike Information Criterion 標準，采用MrModeltest 2.0 軟件進行最適模型選擇，基于最大似然法ML（maximum likelihood，ML）利用RAxML 7.2.8 軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。根據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系判定市售豬苓樣品的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分

參照《中華人民共和國藥典（2020年版 一部）》[3]中豬苓檢查項下要求和方法，對其水分、總灰分和酸不溶性灰分進行檢測。

2.4 麥角甾醇含量測定

參照《中華人民共和國藥典（2020年版 一部）》[3]中豬苓檢查項下要求和《中華人民共和國藥典（2020年版四部）》中通則0512 項下的高效液相色譜法[9]，測定豬苓樣品麥角甾醇含量。

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

規(guī)格為250 mm×4.6 mm、5 μm 的Symmetry C18色譜柱，流動相為甲醇，檢測波長為283 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。理論板數(shù)按麥角甾醇峰計算不低于5 000[3]。

2.4.2 對照品溶液的制備

取麥角甾醇對照品適量，精密稱定，加入甲醇，制成的麥角甾醇溶液質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.5 g 過四號篩，精密稱定，置于具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲（功率為220 W，頻率為50 kHz）處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足損失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取濾液即得。

2.4.4 測定方法

分別精密吸取20 μL 的對照品溶液與各供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬苓分子鑒定

以購得的豬苓樣品基因組DNA 為模板，利用真菌rDNA-ITS 區(qū)通用引物ITS1 和ITS4 擴增得到603～644 bp 大小的ITS 序列。所得序列提交至GenBank獲得登錄號，并在NCBI 中進行同源性搜索，結(jié)果顯示與多孔菌屬（Polyporus）真菌具有高度同源性，故7 批豬苓樣品歸屬于多孔菌屬。7 批樣品信息詳見表1。

表1 線上銷售的樣品信息Tab.1 Information of online commercial samples

結(jié)合表1 中各樣品GenBank 登錄信息，采用最大似然法將本研究樣品測得的ITS 序列與其構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，詳見圖1。

圖1 基于ITS 序列借助最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree inferred from ITS sequences using the maximum likelihood method

如圖1世紀，樣品1 號與KY389212 相似性較高，聚為一支；樣品2 號至7 號與KY389217、KY389219、HQ225481、EU442270、AY322495 等系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更緊密且聚為一支。根據(jù)7 批樣品分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進一步確認7 批樣品均為豬苓Polyporus umbellatus。

3.2 豬苓性狀

豬苓樣品的宏觀特征、切片特征、粉末性狀詳見圖2～4。

圖2 部分線上銷售豬苓的宏觀特征Fig.2 Macroscopic characteristics of some online commercial Polyporus umbellatus

圖3 線上銷售豬苓1 號～7 號的切面Fig.3 Section of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

圖4 線上銷售豬苓1 號～7 號的粉末Fig.4 Powder of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

如圖2～4世紀，豬苓原藥材呈不規(guī)則條形、類圓形或扁塊狀，少量樣品有分枝，長5～15 cm，直徑2～5 cm。表面黑色、灰黑色或棕黑色，皺縮或有瘤狀突起。豬苓體輕，質(zhì)硬，斷面呈白色或黃白色，略呈顆粒狀。氣微，味淡。豬苓粉末呈米白色或黃白色。

3.3 豬苓粉末顯微特征

顯微觀察（40×）下豬苓粉末的特征詳見圖5。

圖5 線上銷售豬苓粉末的顯微特征圖Fig.5 Microscopic characteristics from online commercial Polyporus umbellatus powder

如圖5世紀，豬苓粉末少數(shù)菌絲呈棕色、不易分離；多數(shù)菌絲無色，直徑為3～8 μm，彎曲，有橫隔膜，分枝或呈結(jié)節(jié)狀膨大。有草酸鈣方晶，以正方八面體形、規(guī)則的雙錐八面體形為主，直徑為12～56 μm，有時數(shù)個結(jié)晶集合。

3.4 薄層鑒別

線上銷售豬苓樣品1 號～7 號薄層色譜圖結(jié)果見圖6。

如圖6世紀，在可見光下檢視，供試品色譜均在與對照品麥角甾醇色譜相應的位置上，7 個供試樣品均在相同位置顯示相同顏色斑點。

3.5 水分、總灰分和酸不溶性灰分測定

測定市售豬苓原藥材的水分、總灰分、酸不溶灰分，每批樣品3 次重復，結(jié)果詳見表2。

表2 線上銷售豬苓中水分、總灰分、酸不溶灰分的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of moisture,total ash and acidinsoluble ash in online commercial Polyporus umbellatus

由表2 可知，7 批豬苓原藥材水分含量除2 號（15.0%）和3 號（14.1%）超過規(guī)定范圍外，其余樣品均為11.1%～13.4%，符合藥典規(guī)定值（水分≤14.0%）；總灰分含量為2.7%～7.1%，均符合藥典規(guī)定值（總灰分≤12.0%）；酸不溶性灰分含量為0.3%～1.8%，均符合藥典規(guī)定值（酸不溶性灰分≤5.0%）。

3.6 麥角甾醇含量測定

麥角甾醇含量測定按照色譜條件進樣，樣品和標準品色譜圖見圖7；測定試驗重復3 次，市售豬苓原藥材麥角甾醇含量測定結(jié)果詳見表3。

圖7 市售豬苓供試品溶液與麥角甾醇對照品的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of ergosterol standard and test solutions of online commercial Polyporus umbellatus

表3 線上銷售豬苓中麥角甾醇的測定結(jié)果Tab.3 Determination results of ergosterol in online commercial Polyporus umbellatus

由圖7 和表3 可知，麥角甾醇對照品約6 min出峰，重現(xiàn)性好，分離度高，峰型尖銳且無拖尾；7 批豬苓樣品中麥角甾醇的含量為0.228 7%～0.346 9%，均符合藥典標準（麥角甾醇≥0.070%）。

4 結(jié)論與討論

藥用真菌類中藥材質(zhì)量評價主要目的在于鑒別藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣，保障人民群眾臨床用藥安全有效。隨著豬苓藥用范圍、來源和市場需求不斷擴大，關(guān)于豬苓質(zhì)量評價亦愈發(fā)受人們關(guān)注。針對豬苓藥材質(zhì)量控制，《中華人民共和國藥典（2020年版 一部）》[3]限定了豬苓藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分和麥角甾醇的含量與性狀特征。然而，豬苓藥材間宏觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)（粉末）近似，傳統(tǒng)性狀鑒別方法不僅需要專業(yè)經(jīng)驗且費時費力，還不能保證精確無誤。因此，僅通過外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)和有關(guān)含量分析并不能精準反映豬苓藥材真?zhèn)危y以達到有效質(zhì)量控制的目的。

為此，本研究中綜合利用性狀鑒別、分子鑒定、含量測定等方法，對7 批線上平臺市售豬苓藥材開展性狀、顯微特征、薄層色譜、麥角甾醇含量、水分、總灰分、酸不溶性灰分等評價。通過形態(tài)學觀察進行性狀鑒別，結(jié)合分子系統(tǒng)學和真菌DNA 條形碼技術(shù)，選取rDNA-ITS 基因片段對市售豬苓藥材開展分子鑒定，明確了7 批藥材的分類地位，確定均為豬苓。綜合形態(tài)學和分子鑒定進行藥材真?zhèn)舞b別，具有快速、準確、可靠等特點，可為此類藥材真?zhèn)舞b別提供科學依據(jù)。

結(jié)果顯示，7 批豬苓藥材水分含量為11.1%～15.0%，除2 號（安徽霍山）和3 號（四川阿壩）水分超標外，其他批號符合《中華人民共和國藥典（2020年版 一部）》[3]水分項下規(guī)定；而超出水分含量范圍的樣品可能發(fā)生霉變等變質(zhì)現(xiàn)象從而影響質(zhì)量。7 批豬苓總灰分含量為2.7%～7.1%，酸不溶性灰分含量為0.3%～1.8%，說明其灰分檢測結(jié)果符合要求，藥材純度好。參照《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》[9]豬苓項下含量測定要求，7 批豬苓麥角甾醇含量為0.228 7%～0.346 9%，其中以產(chǎn)自陜西省佛坪縣的豬苓藥材含量最高；從含量測定結(jié)果看7 批市售豬苓質(zhì)量符合藥典規(guī)定。

綜上，7 批豬苓藥材中除少部分樣品水分含量超標，其他各項指標均符合藥典標準。建議綜合豬苓藥材性狀要求、分子鑒定、品質(zhì)指標和含量要求進行豬苓質(zhì)量控制和評價，以實現(xiàn)藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)價。