李艷婷，郭 尚**，馮 斌，徐莉娜，郭霄飛，郭偉偉

（1.山西農業(yè)大學山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.山西省檢驗檢測中心，山西 太原 030000）

大白樁菇（Leucopaxillus giganteus）屬擔子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白樁菇屬（Leucopaxillus），又名雷蘑、大青蘑[1]。子實體大型，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，還可治療小兒麻疹、煩燥不安等病癥[2-3]。此外，大白樁菇含有多糖、杯傘素等生物活性物質，這些生物活性物質具有清除過量自由基、提高免疫力、抗腫瘤等生物學功能[4-7]。已有研究測定大白樁菇子實體蛋白質含量為49.12 g·100-1·g-1，17 種游離氨基酸總量為33.95 g·100-1·g-1，其中必需氨基酸占比31.41%（色氨酸除外），不僅富含鮮味成分天冬氨酸和谷氨酸，且氨基酸評分（35.26）高于FAO/WHO模式的35%，所以大白樁菇具有較好的口感和風味，極具研究價值[8]。

大白樁菇作為臺蘑的代表種類之一，目前對其蛋白質與水解氨基酸的相關研究卻尚屬空白[9]。為深入研究大白樁菇中蛋白質與氨基酸的生物活性，首先要建立氨基酸含量的測定方法。試驗首次對大白樁菇中的水解氨基酸含量進行測定，對測定方法進行了方法學研究，并通過水解氨基酸含量對大白樁菇的蛋白質進行評價。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大白樁菇采集于山西呂梁地區(qū)。該地區(qū)海拔為2 249.90 m，位于東經111°51′36″、北緯38°46′12″處，為針闊葉林和混交林地生長地帶。子實體保藏于山西省農業(yè)科學院食用菌研究所，標本編號為SXSYJBB1601。

1.2 主要試劑

氨基酸混合標準溶液，塞卡姆（北京）科學儀器有限公司；濃鹽酸（優(yōu)級純），太倉滬試劑有限公司；苯酚，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氨基酸測定成品試劑包（緩沖液A、緩沖液B、緩沖液D、鉀鈉緩沖液、茚三酮、檸檬酸鈉緩沖液），塞卡姆（北京）科學儀器有限公司。

1.3 主要儀器

S-433D 型全自動氨基酸分析儀，塞卡姆科學儀器有限公司；TVE-1100 試管濃縮儀，上海愛朗儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；水浴氮吹儀器，上海那艾精密儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 大白樁菇樣品制備

參考《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124-2016）[10]的方法并對其進行改進后處理樣品。

將大白樁菇子實體洗凈，50 ℃烘箱放置24 h，粉碎，過60 目篩，備用。準確稱取50 mg 樣品于20 mL 水解管中，加入6 mol·L-1的鹽酸10 mL，加入3 滴新蒸餾的苯酚，充入高純氮氣后擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管置于110 ℃電熱鼓風恒溫箱中水解22 h，取出，冷卻至室溫。打開水解管，水解液過0.45 μm 濾膜，純水沖洗水解管2～3 次，水洗液均過0.45 μm 濾膜，并全部轉移至同一個50 mL 容量瓶內，去離子水定容，振蕩混勻。

準確吸取1.0 mL 濾液，移入20 mL 蒸干管，使用試管濃縮儀在50 ℃環(huán)境下減壓干燥，殘留物用2.0 mL 去離子水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。將2.0 mL 檸檬酸鈉緩沖液加入到干燥后蒸干管內溶解底物，振蕩混勻后，吸取溶液過0.22 μm 濾膜，轉移至儀器進樣瓶，為樣品測定液，供儀器測定用。

1.4.2 氨基酸混合標準工作溶液制備

氨基酸混合標準工作溶液（濃度500 μmol·L-1）的制備：精密量取2 mL 氨基酸混合標準溶液（濃度為2.5 mmol·L-1），轉移至10 mL 容量瓶中，用pH 2.2 的樣品稀釋液（檸檬酸鈉緩沖液）定容至刻度。

精密量取氨基酸混合標準工作溶液0.02、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用pH 2.2 的樣品稀釋液（檸檬酸鈉緩沖液）定容至刻度，搖勻，得濃度為1.0、5.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol·L-1的系列標準工作曲線。

1.4.3 測定條件

色譜柱編號為0208167；柱溫為58 ℃；反應器溫度為130 ℃；流速為0.25 mL·min-1；進樣量為50 μL。

1.4.4 水解氨基酸及蛋白質評價

氨基酸成分分析評價根據(jù)氨基酸測定數(shù)據(jù)，計算大白樁菇子實體蛋白質的必需氨基酸組成，參考FAO/WHO 的標準模式進行分析[11-12]。氨基酸評分（AAS）、化學評分（CS）、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、生物價（BV）、營養(yǎng)指數(shù)（NI）按照BANO 等[13]和FAO[14]的方法進行計算與評價。根據(jù)氨基酸平衡理論，利用標準模式譜計算必需氨基酸的氨基酸比值（RAA）氨基酸比值系數(shù)（RC）[15]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

將1.4.2 制備得到的氨基酸混合標準工作溶液系列溶液置于進樣瓶進行測定。波長為570 nm 處測天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸含量；波長440 nm 處測脯氨酸含量；對標準曲線進行線性回歸分析。各氨基酸實際濃度（x，μmol·L-1）與峰面積（y）的線性回歸方程見表1。

表1 氨基酸標準曲線線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation for amino acid standard curve

由表1 可知，半胱氨酸線性關系在0.5～50.0 μmol·L-1內良好，其他16 種氨基酸線性關系在1～100 μmol·L-1內良好。

2.2 重復性試驗

稱取6 份大白樁菇子實體粉0.005 g，按照1.4.1的方法制備樣品測定液，測定17 種氨基酸的含量，分析6 次重復（Y1～Y6）的相對標準差RSD（relative standard deviation，RSD）。6 次重復性試驗結果見表2。

表2 重復性試驗結果Tab.2 Results of reproducibility test

如表2世紀，17 種氨基酸含量的RSD 均小于10%，表明方法重復性良好。

2.3 精密度試驗

稱取1 份（0.005 g）大白樁菇子實體粉末，按照1.4.1 的方法進行處理制備樣品測定液，氨基酸分析儀上連續(xù)進樣6 針進行測定。連續(xù)進樣6 針檢測的精密度試驗結果見表3。

表3 精密度試驗結果Tab.3 Results of precision test

17 種氨基酸含量的如表3世紀，RSD 均小于10%，表明精密度良好。

2.4 回收率試驗

使用低、中、高3 個濃度（即標準品的質量濃度分別為10、25、50 μg·L-1）加入法測定回收率，每個濃度下測定3 個平行樣品?；厥章试囼灲Y果見表4。

由表4 可知，3 個不同質量濃度下回收率為80%～120%，RSD 均小于10%，表明回收良好。

2.5 水解氨基酸及蛋白質分析與評價

測定大白樁菇水解氨基酸的組成含量，結果如表5世紀。

表5 大白樁菇子實體中水解氨基酸的組成及含量Tab.5 Composition and content of hydrolyzed amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表5 可知，大白樁菇共測得17 種水解氨基酸（色氨酸未測），氨基酸總含量為132.11 mg·g-1；其中必需氨基酸為43.7 mg·g-1，占氨基酸總量33.08%；非必需氨基酸88.41 mg·g-1，占比66.92%。組成藥用的氨基酸有10 種，分別是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸，其含量占水解氨基酸總量的88.89%。藥用氨基酸維持著人體機能的碳平衡，且某些氨基酸只能通過食物的攝取才能得到補充，說明大白樁菇具有良好的開發(fā)利用價值。藥用氨基酸中谷氨酸的含量最高，占氨基酸總含量的18.09%。谷氨酸是一種神經遞質，對改善人體腸道功能、腦功能、神經功能和治療精神性疾病具有重要的作用[16-17]。其次是天冬氨酸（11.63%），說明大白樁菇可能在保護心肌、消除疲勞等方面具有調節(jié)意義[18]。天門冬酰胺和谷氨酰胺在水解過程中會產生天冬氨酸和谷氨酸[19]。大白樁菇也富含亮氨酸（6.97%），亮氨酸具有調節(jié)糖脂代謝功能，改善脂肪沉積的作用[20]。蛋氨酸和半胱氨酸含量較低，分別占水解氨基酸總量的0.83%和1.13%，可能是由于這2 種氨基酸與空氣接觸，發(fā)生氧化反應造成了部分氨基酸的損失[21]。

對大白樁菇水解氨基酸中人體必需氨基酸組成進行分析，并與FAO/WHO 標準模式及雞蛋模式進行比較，計算分析各評分數(shù)值。其中，RAA 為樣品中某氨基酸含量與FAO/WHO 標準模式氨基酸含量的比值，RC 為RAA 與RAA 平均數(shù)的比值，AAS 為樣品中某氨基酸含量與FAO/WHO 模式譜氨基酸含量的比值乘以100，CS 為樣品中某氨基酸含量與雞蛋模式譜氨基酸含量的比值乘以100。結果詳見表6。

表6 大白樁菇子實體中必需氨基酸的組成分析Tab.6 Composition analysis of essential amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表6 可知，大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸占總水解氨基酸的質量分數(shù)低于標準模式譜。從必需氨基酸的氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)計算結果可以看出，大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸含量較低，RC 值為0.55，說明其為大白樁菇的第一限制氨基酸。在FAO/WHO 模式中，除纈氨酸外，大白樁菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式譜的要求。大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸的CS 值為35.65，說明其為大白樁菇的第一限制氨基酸，與RC 值分析結果一致。

對大白樁菇水解氨基酸的EAAI、CBV 和NI 進行分析。其中EAAI 為樣品中所有必需氨基酸CS 值的幾何平均數(shù)；CBV 為樣品必需氨基酸指數(shù)與1.09的乘積再減去11.7；NI 為樣品中必需氨基酸指數(shù)與蛋白質含量的乘積除以100。經計算，大白樁菇的EAAI 值為69.96。必需氨基酸指數(shù)（EAAI）的概念由OSER[22]提出，當EAAI＞90，說明樣品的蛋白質營養(yǎng)價值較高；當80≤EAAI＜90 時，說明樣品的蛋白質營養(yǎng)價值為良；當EAAI＜70，說明樣品的蛋白質營養(yǎng)價值較低。因此，大白樁菇的營養(yǎng)價值接近良。生物價越高表示可利用程度越高，CBV 與EAAI 之間的關系呈線性，趨勢與EAAI 一致。營養(yǎng)指數(shù)（NI）方法中包括粗蛋白含量與必需氨基酸組成，以此進行綜合評價，故評價更為全面和準確。大白樁菇營養(yǎng)指數(shù)為34.36，因大白樁菇粗蛋白含量較高，所以營養(yǎng)指數(shù)較高，且超過了雞腿菇（Coprinus comatus）、香菇（Lentinus edodes）、茶樹菇（Agrocybe aegirit）和黑木耳（Auricularia auricula）等常見食用菌[23]。

3 結論與討論

在國家標準《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124-2016）的基礎上，增加了半胱氨酸含量的測定方法，對樣品處理方法進行了改進，將改進方法用于大白樁菇子實體中17 種水解氨基酸的測定，并進行了方法學驗證分析。結果表明，本方法具有線性關系良好、結果準確、重現(xiàn)性好、回收率高的特點，可用作大白樁菇中17 種水解氨基酸的測定方法。大白樁菇水解氨基酸測定方法的建立對進一步研究大白樁菇蛋白質的營養(yǎng)價值具有重要意義。

研究表明大白樁菇是一種高蛋白野生食用菌，粗蛋白含量高達49.12 g·100-1·g-1。本試驗中測定大白樁菇17 種水解氨基酸總含量為132.11 mg·g-1。其中，必需氨基酸43.7 mg·g-1，占氨基酸總量的33.08%；藥用氨基酸總量為88.89 mg·g-1，占氨基酸總量的67.28%。與FAO/WHO 模式和雞蛋模式相比，大白樁菇第一限制氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸。除纈氨酸外，大白樁菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式譜的要求。大白樁菇的必需氨基酸指數(shù)為69.96，表明其營養(yǎng)價值接近良好，而與其蛋白質含量相結合計算后，其營養(yǎng)指數(shù)達到34.36，表明大白樁菇營養(yǎng)價值較高，且超過香菇、黑木耳等常見食用菌。綜上所述，大白樁菇是一種氨基酸分布均衡，且營養(yǎng)價值較高的高蛋白食用菌。