劉光盛劉敏 賴宏豪陳銳勇何穎

1海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心，海洋生物醫(yī)藥與極地醫(yī)學(xué)研究室，上海200433；2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與工程專業(yè)，上海 201306；3海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，上海 200433

近年來，核潛艇部隊(duì)任務(wù)繁重，戰(zhàn)備訓(xùn)練強(qiáng)度加大，發(fā)生核事故的潛在危險(xiǎn)隨之增加。核潛艇事故發(fā)生時(shí)可能伴隨著核泄漏，艇員暴露于核輻射環(huán)境中[1-2]?？焖偕细∶撾U(xiǎn)因具有脫險(xiǎn)深度大、操作簡單、速度快等優(yōu)點(diǎn)而被作為有效的潛艇脫險(xiǎn)方式廣泛應(yīng)用，但快速上浮脫險(xiǎn)過程中也存在減壓病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。減壓病是由于外界環(huán)境壓力迅速下降，導(dǎo)致機(jī)體組織內(nèi)溶解的惰性氣體溢出形成氣泡，從而造成一系列病理反應(yīng)的疾病[4-5]?？焖偕细∶撾U(xiǎn)導(dǎo)致的減壓病主要累及心肺系統(tǒng)[6-7]，而肺作為對(duì)電離輻射敏感的組織之一，在輻射暴露后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可產(chǎn)生早期輻射損傷[8]。艇員在受到一定劑量核輻射后，是否會(huì)增加隨后快速上浮脫險(xiǎn)所致減壓病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于后續(xù)救治方案和流程的制定至關(guān)重要。

本研究以大鼠為研究對(duì)象，建立不同輻射劑量合并特定減壓負(fù)荷的復(fù)合損傷動(dòng)物模型，觀察實(shí)驗(yàn)后大鼠的死亡情況，并檢測其肺濕干重比、肺組織損傷程度以及肺泡灌洗液中炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)分子的變化，探討輻射對(duì)快速上浮脫險(xiǎn)致減壓病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及肺組織損傷的影響，為失事核潛艇脫險(xiǎn)艇員的一線救治提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康6周齡普通級(jí)雄性SD大鼠53只，體重為（199.3±10.4）g，由海軍特色醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（滬）2017-0019。實(shí)驗(yàn)前按大鼠體重分層后以隨機(jī)數(shù)表法分為5組：空白對(duì)照組（10只）、單純減壓組（10只）、4 Gy 照射+減壓組（11只）、6 Gy 照射+減壓組（11只）以及8Gy 照射+減壓組（11 只）。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間（溫度22℃、濕度50%）動(dòng)物自由攝食及飲水，光照節(jié)律12 h/12 h。

1.2 主要儀器及試劑

快速上浮脫險(xiǎn)減壓艙購自煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)股份有限公司；低溫高速離心機(jī)（5418R）購自德國Eppendorf 公司；精密電子天平（TB214）購自美國DENVER 儀器公司；Multiskan 1550酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司。大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于上?；鶢栴D生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建

不同劑量照射組大鼠送至海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心，采用海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心60Coγ 射線放射源進(jìn)行照射，按分組劑量，分別進(jìn)行4、6、8Gy劑量一次性全身輻照構(gòu)建大鼠急性放射病模型，輻射劑量率分別為0.43、0.64、0.86Gy/m in。空白對(duì)照組及單純減壓組在相同環(huán)境下不進(jìn)行照射。

輻射結(jié)束后1 h 將大鼠運(yùn)送至海軍特色醫(yī)學(xué)中心潛水與高氣壓醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，各減壓組進(jìn)行減壓處理。將大鼠置于減壓艙，模擬空氣潛水，加壓深度為57 m，停留45m in，隨后快速勻速減壓至大氣壓，減壓時(shí)間為37 s。從減壓艙中取出大鼠，在30m in 內(nèi)觀察各組大鼠的死亡情況。

1.4 樣本采集與制備

減壓結(jié)束后3 h，以3%戊巴比妥鈉注射大鼠腹腔進(jìn)行麻醉，劑量40 mg/kg，完全麻醉后暴露氣管，打開胸腔，結(jié)扎右側(cè)肺門，對(duì)左側(cè)肺組織進(jìn)行生理鹽水灌洗。用注射器吸取1.5 m l 生理鹽水，插入大鼠氣管緩慢注入，待左肺完全膨脹、蒼白后立即回抽灌洗液，反復(fù)3次，每次回收率>80%。收集獲得的肺泡灌洗液以3 000 r/m in 離心15m in（離心半徑10 cm），離心后吸取上清，?80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1肺濕干重比檢測

取大鼠右肺上葉，濾紙吸干表面血漬后，放在干燥稱量紙上，精密電子天平稱量肺濕重；隨后將肺組織放入80℃烘箱內(nèi)48 h，烘干至恒重，稱量肺干重。計(jì)算大鼠肺濕干重比。

1.5.2肺組織病理學(xué)檢測

取大鼠右肺中葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm 厚切片用蘇木精-伊紅染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測，以觀察肺組織病理損傷的程度。

1.5.3炎癥因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分別測定各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的變化。操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值。

1.5.4氧化應(yīng)激分子檢測采用羥胺法測定大鼠肺泡灌洗液SOD 活力，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀檢測550 nm 處吸光度值；采用硫代巴比妥酸法測定大鼠肺泡灌洗液MDA 水平，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀檢測532 nm 處吸光度值；采用微量酶標(biāo)法測定大鼠肺泡灌洗液GSH-Px 水平，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀檢測405 nm處吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 9軟件制圖，應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性的進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，大鼠組間死亡率的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量輻射對(duì)大鼠減壓病死亡率的影響

由表1可知，單純減壓組和6 Gy 照射+減壓組各有1只大鼠死亡，4 Gy 照射+減壓組和8 Gy照射+減壓組各有4只大鼠死亡。各組間大鼠死亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.925，P>0.05），但4Gy照射+減壓組和8Gy 照射+減壓組大鼠的死亡率較單純減壓組存在上升趨勢。

表1 不同輻射劑量暴露后大鼠減壓病死亡情況Tab le 1 Death of decompression sickness after exposure to different dosesof radiation

2.2 不同劑量輻射對(duì)減壓大鼠肺濕干重比的影響

由圖1可見，與空白對(duì)照組相比，各組大鼠肺濕干重比均有上升趨勢，其中6Gy 照射+減壓組和8 Gy 照射+減壓組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.096，LSD-t=2.758、2.959；均P<0.05）；與單純減壓組相比，各照射組大鼠肺濕干重比均有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=0.901、1.818、2.020，均P>0.05）。

圖1 不同劑量輻射暴露后各組大鼠肺濕干重比的比較 圖中，a 表示與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=2.758、2.959，均P<0.05）Figure 1 Comparision of lung wet-dry weight ratio in each group of ratsafter different dosesof radiation exposure

2.3 不同劑量輻射對(duì)減壓大鼠肺組織損傷的影響

由圖2可見，空白對(duì)照組大鼠肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)基本正常，無炎性細(xì)胞浸潤；單純減壓組大鼠可見輕度炎性細(xì)胞浸潤和少量紅細(xì)胞滲出；4Gy 照射+減壓組大鼠肺間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，可見紅細(xì)胞滲出，肺泡壁輕度增厚；6Gy 照射+減壓組大鼠肺間質(zhì)增生伴炎性細(xì)胞浸潤，支氣管內(nèi)少量滲出物，肺泡壁增厚；8Gy 照射+減壓組大鼠血管及支氣管周圍組織增生，內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤及出血灶，部分血管周圍明顯可見滲出物，肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)明顯可見滲出物。組織病理學(xué)檢查結(jié)果提示，不同劑量輻射暴露后再進(jìn)行減壓會(huì)加重大鼠肺組織水腫及炎性損傷，其中6Gy 照射+減壓組和8Gy 照射+減壓組大鼠的損傷較為顯著。

圖2 不同劑量輻射暴露后各組大鼠肺的組織病理學(xué)改變（蘇木精-伊紅染色，×200）Figure 2 Changesof lung histopathology in each group of rats after different dosesof radiation exposure (hematoxylin eosin staining,×200)

2.4 不同劑量輻射對(duì)減壓大鼠肺泡灌洗液炎癥因子水平的影響

由圖3可見，與空白對(duì)照組比較，各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著上升（均P<0.01）；與單純減壓組比較，各照射組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著上升（均P<0.01）；與4Gy照射+減壓組比較，6 Gy 照射+減壓組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著上升（均P<0.01）；而與6Gy 照射+減壓組比較，8 Gy 照射+減壓組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平則顯著下降（均P<0.05）；4Gy 照射+減壓組與8Gy 照射+減壓組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=0.624、0.587、0.922，均P>0.05）。

圖3 不同劑量輻射暴露后各組大鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6及TNF-α 水平的變化 圖中，a 表示與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.039、69.930、78.270，LSD-t=6.656～15.830；均P<0.01）；b 表示與單純減壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=3.081～8.265，均P<0.01）；c 表示與4 Gy 照射+減壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=4.291、3.856、3.409，均P<0.01）；d 表示與6Gy 照射+減壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=3.614、3.219、2.409，均P<0.05）。IL-1β為白細(xì)胞介素1β；IL-6為白細(xì)胞介素6；TNF-α 為腫瘤壞死因子αFigure 3 Changes of interleukin-1β,interleukin-6,tumor necrosis factor-αlevels in bronchoalveolar lavage fluid in each group of rats after different dosesof radiation exposure

2.5 不同劑量輻射對(duì)減壓大鼠肺泡灌洗液氧化應(yīng)激分子水平的影響

由圖4可見，與空白對(duì)照組比較，各組大鼠肺泡灌洗液中SOD活力、GSH-Px 水平均顯著下降（F=35.720、51.370，LSD-t=6.267～13.107；均P<0.01）；與單純減壓組比較，各照射組大鼠SOD活力、GSH-Px 水平顯著下降（LSD-t=2.716～5.154，均P<0.01）；各照射組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但6Gy 照射+減壓組大鼠SOD活力、GSH-Px 水平下降幅度最大。

圖4 不同劑量輻射暴露后各組大鼠肺泡灌洗液SOD活力、GSH-Px 及MDA 水平的變化 圖中，a 表示與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.720、51.370、45.680，LSD-t=4.395～13.107；均P<0.01）；b 表示與單純減壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=7.716～8.017，均P<0.01）；c 表示與4Gy 照射+減壓組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=3.618，P<0.01）；d 表示與6Gy 照射+減壓組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=4.204，P<0.01）。SOD為超氧化物歧化酶；GSH-Px 為谷胱甘肽過氧化物酶；MDA 為丙二醛Figure 4 Changes of superoxide dismutase,glutathione peroxidase,malondialdehyde levels in bronchoalveolar lavage fluid in each group of rats after different dosesof radiation exposure

與空白對(duì)照組比較，各組大鼠肺泡灌洗液MDA 水平均顯著上升（F=45.680，LSD-t=4.395～12.752；均P<0.01）；與單純減壓組比較，各照射組大鼠MDA 水平顯著上升（LSD-t=3.198～8.017，均P<0.01）；與4 Gy 照射+減壓組比較，6 Gy 照射+減壓組大鼠MDA 水平顯著上升（P<0.01），8 Gy照射+減壓組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t=0.541，P>0.05）；而與6 Gy 照射+減壓組比較，8 Gy 照射+減壓組則顯著下降（LSD-t=4.204，P<0.01）。

3 討論

雖然核潛艇沉沒事故發(fā)生后艇員幸存的可能性很小，但現(xiàn)代逃生技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步提升了這種可能性。然而，目前國內(nèi)外對(duì)核潛艇事故幸存艇員輻射與減壓復(fù)合損傷情況的研究很少，而在北大西洋公約組織的援潛救生手冊(cè)中也只是簡單地描述了幸存艇員救治原則的重點(diǎn)在于放射性污染的清除[9]。實(shí)施快速上浮脫險(xiǎn)時(shí)，不可避免地存在減壓病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，這也是危及脫險(xiǎn)艇員生命安全與健康的主要問題[10]。本研究旨在探討大鼠受到一定劑量的輻射暴露后，再進(jìn)行快速上浮脫險(xiǎn)，是否會(huì)加重減壓病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)以及肺組織的損傷程度。在本研究中，4Gy 照射+減壓組和8Gy 照射+減壓組大鼠的死亡數(shù)較單純減壓組有所增加，但6Gy 照射+減壓組大鼠的死亡數(shù)沒有變化。這一結(jié)果提示大鼠受到一定劑量輻射暴露后再進(jìn)行快速上浮脫險(xiǎn)，會(huì)增加減壓病的病死率；但6 Gy 照射+減壓組的情況提示個(gè)體對(duì)于減壓反應(yīng)的易感性差異所導(dǎo)致的死亡率差異并不能排除。關(guān)于減壓病的相關(guān)研究結(jié)果表明，減壓病的發(fā)生與機(jī)體組織內(nèi)皮功能障礙、血小板激活以及白細(xì)胞激活密切相關(guān)，但個(gè)體對(duì)于減壓壓力的反應(yīng)實(shí)際上才決定了減壓病的發(fā)病率[4-5]。個(gè)體對(duì)于減壓病易感性的差異是顯而易見的，這種差異既存在于個(gè)體之間，也存在于個(gè)體內(nèi)部，并且這種差異并不總是恒定的，其與體重、年齡、溫度、身體狀態(tài)等多種因素相關(guān)[5]。在本研究中，6Gy 照射+減壓組大鼠的死亡率較4 Gy 照射+減壓組和8 Gy 照射+減壓組是降低的，結(jié)合減壓病易感性的理論，我們認(rèn)為這可能是不同組別間對(duì)于減壓病的易感性差異所造成的。同時(shí)這一現(xiàn)象也提示，在進(jìn)行相關(guān)人員的選拔和習(xí)服訓(xùn)練時(shí)，個(gè)體對(duì)于減壓病的易感性差異是一個(gè)不可忽視的重要因素。

肺作為電離輻射中度敏感組織，在輻射暴露后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可產(chǎn)生早期輻射損傷[11-12]，不可修復(fù)的DNA 損傷和不可控的氧化應(yīng)激都會(huì)導(dǎo)致肺組織細(xì)胞的損傷或凋亡，并進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子，引發(fā)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[13-14]。對(duì)于減壓病而言，血管內(nèi)氣泡的形成在減壓病的發(fā)生機(jī)制中起核心作用[15-16]。靜脈氣泡導(dǎo)致血小板活化沉積和白細(xì)胞激活，并伴隨著氧化應(yīng)激和一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺組織損傷[17-18]。因此，肺作為輻射損傷和減壓損傷的共同作用靶器官，輻射損傷可能加重后續(xù)快速上浮脫險(xiǎn)所致減壓病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和損傷程度。在本研究中，各照射組大鼠的肺組織病理損傷程度隨著輻射劑量的增加而呈加重的趨勢，且較單純減壓組更為嚴(yán)重。從肺濕干重比的結(jié)果來看，各照射組大鼠的肺濕干重比與單純減壓組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但存在上升的趨勢。該現(xiàn)象提示輻射暴露會(huì)加重快速上浮脫險(xiǎn)所致的減壓病肺損傷的嚴(yán)重程度，但輻射劑量與肺損傷程度的量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

輻射暴露和減壓暴露均可導(dǎo)致不同程度的肺部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并引起多種炎癥因子以及氧化應(yīng)激相關(guān)分子發(fā)生變化。TNF-α 是由激活的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，可觸發(fā)其他炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和GM-CSF等）的釋放[19-20]。IL-1β則直接參與早期肺組織損傷和修復(fù)[21]。同時(shí)TNF-α 和IL-1β可刺激多種趨化因子如IL-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（M IP-1α）的產(chǎn)生，在炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[22-23]。而IL-6作為一種多效性細(xì)胞因子，可導(dǎo)致多種自身免疫性和炎癥性疾病的發(fā)生[24]。機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)可生成MDA。MDA 通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及關(guān)鍵酶的活性，會(huì)加劇機(jī)體損傷[25-26]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗氧化體系（SOD、GSH-Px 等）不足以清除電離輻射產(chǎn)生的自由基時(shí)，則出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。在本研究中，各照射組大鼠肺泡灌洗液中的炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平及MDA 水平較單純減壓組均顯著上升，而機(jī)體內(nèi)抗氧化酶（SOD、GSH-Px）水平較單純減壓組則顯著降低。本研究結(jié)果提示，輻射暴露會(huì)加重隨后快速上浮脫險(xiǎn)所致肺部炎癥損傷和氧化應(yīng)激損傷。6Gy 照射+減壓組大鼠的肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α 以及MDA 水平上升幅度是各照射組中最大的，而SOD、GSH-Px水平的下降幅度也是最大的。由于減壓后立即死亡的大鼠未被納入此次實(shí)驗(yàn)范圍，而6Gy 照射+減壓組大鼠的死亡率在各照射組中是最低的，我們認(rèn)為6 Gy照射+減壓組大鼠對(duì)于快速上浮脫險(xiǎn)所致減壓病的易感性較低，以致出現(xiàn)較低的死亡率，但存活個(gè)體的肺泡灌洗液炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)分子的變化卻最為顯著。各組間炎癥因子水平和氧化應(yīng)激分子均存在顯著差異，或許能夠比組織病理損傷更早地預(yù)測輻射復(fù)合減壓損傷的復(fù)合效應(yīng)。致死性復(fù)合損傷的原因不僅僅是肺組織炎癥滲出，也可能是炎癥因子和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管舒縮反應(yīng)。

綜上所述，輻射暴露會(huì)加重隨后的快速上浮脫險(xiǎn)所致減壓病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的肺組織損傷，會(huì)導(dǎo)致幸存艇員待援能力的下降和救治效率的不足，提示復(fù)合損傷幸存艇員早期的抗炎和抗氧化應(yīng)激措施應(yīng)該得到重視。而6 Gy 照射+減壓組大鼠的存活個(gè)體損傷最重，但總體死亡率卻最低，則提示個(gè)體對(duì)于減壓病發(fā)生的易感性對(duì)于其脫險(xiǎn)尤為重要，下一步可以深入研究其易感機(jī)制并應(yīng)用于人員選拔和習(xí)服訓(xùn)練。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉光盛負(fù)責(zé)現(xiàn)場的實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析、論文的撰寫；劉敏、賴宏豪負(fù)責(zé)文獻(xiàn)的查閱、現(xiàn)場的實(shí)驗(yàn)；陳銳勇、何穎負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與指導(dǎo)、論文的審閱與修改