肖志寒，王子辰，趙嘯宇，司銘軒，張同禹，陳錫儒，曹靖，戴俊程，陳亮，許晶

210029 南京，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸外科（肖志寒、王子辰、司銘軒、張同禹、陳錫儒、曹靖、陳亮、許晶），病案統(tǒng)計科（趙嘯宇）；211166 南京，南京醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院（趙嘯宇、戴俊程）

原發(fā)性肺癌（primary lung cancer， PLC）是最常見的癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1-3］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是PLC的主要病理學(xué)類型，包括肺腺癌（lung adenocarcinoma， LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma， LUSC）兩種優(yōu)勢亞型［4］。隨著低劑量胸部CT技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，PLC的診斷率顯著提升，大量早期肺癌（lung cancer， LC）的患者得以診斷，日本LC登記聯(lián)合委員會的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2010年共18 973例患者在日本接受PLC手術(shù)治療，其中I期為12 701例，占總體的78.9%，研究表明，隨著高危人群中低劑量胸部CT篩查的普及，早期LC將成為PLC的主要人群［5-6］。

手術(shù)是早期NSCLC患者的首選治療方案［7-8］，以往以肺葉切除術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式。近年來日本臨床腫瘤學(xué)協(xié)會針對早期LC的手術(shù)治療策略展開了一系列的前瞻性臨床研究，其中影響力最大的JCOG0802研究針對直徑小于2 cm，但實性成分大于50%的IA期LC患者進(jìn)行探索，結(jié)果表明，肺段切除術(shù)與肺葉切除術(shù)同樣有效，術(shù)后5年生存率均可達(dá)到90%以上（肺段切除術(shù)為94.3%，肺葉切除為91.1%）。進(jìn)一步死因分析發(fā)現(xiàn)，第二原發(fā)癌（second primary cancer， SPC）的發(fā)生是僅次于LC本身的第二位死因，也是肺段切除術(shù)患者5年生存率優(yōu)于肺葉切除術(shù)的主要原因之一，其中結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）的發(fā)生居于所有 SPC 的首位［9］。此外，美國國立癌癥研究所設(shè)計了NSCLC多中心組間試驗，發(fā)現(xiàn)I期患者中約15%罹患SPC，CRC作為死亡率第二位的SPC，在早期NSCLC術(shù)后患者中受到廣泛關(guān)注［10］。以上研究表明，隨著PLC的早期診斷和治療體系的逐步完善，患者術(shù)后可以獲得長期生存，SPC的發(fā)生是患者術(shù)后生存的重大威脅。觀察性研究提示CRC作為PLC術(shù)后主要的SPC類型之一，與PLC的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)，由于觀察性研究存在混雜因素等固有局限性，在基因?qū)用鍼LC與CRC的發(fā)生是否存在關(guān)聯(lián)仍未明確［11］。

孟德爾隨機化（Mendelian randomization， MR）作為一種病因推斷方法在遺傳流行病學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［12］。近年來，隨著MR研究方法的深入挖掘，其作為一種較為理想的基因?qū)用嫜芯糠椒?，逐漸被應(yīng)用于兩種復(fù)雜疾病之間發(fā)病關(guān)聯(lián)的推斷。2021年Li等［13］基于大樣本的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study， GWAS），使用兩樣本的 MR 分析方法，探索了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和帕金森氏病之間的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與帕金森氏病之間存在基因?qū)用娴娘@著負(fù)相關(guān)。同年，Zhu等［14］應(yīng)用MR的研究方法探討多囊卵巢綜合征和乳腺癌之間的發(fā)病關(guān)聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征與乳腺癌三種亞型的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)。本研究中，我們擬利用PLC及CRC的全基因組關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)，通過兩樣本MR的研究方法揭示在遺傳水平上PLC和CRC之間的發(fā)病關(guān)聯(lián)，為臨床工作中原發(fā)性早期LC術(shù)后SPCCRC的預(yù)防策略的制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計

MR研究的具體設(shè)計見圖1。遺傳工具變量來自于Mckay等［15］發(fā)表的目前樣本量最大的PLC GWAS，該研究包含14 803例LC病例和12 262例對照，并將其結(jié)果與之前發(fā)表的29 266例LC病例和56 450例對照的GWAS研究結(jié)果進(jìn)行匯總分析獲得最終數(shù)據(jù)集。CRC的匯總數(shù)據(jù)來自Gene ATLAS。Gene ATLAS （http://geneatlas.roslin.ed.ac.uk/）是一個擁有452 264名英國人群生物樣本（UK Biobank）的開放數(shù)據(jù)庫，已開展數(shù)百個性狀和數(shù)百萬個遺傳變異之間的關(guān)聯(lián)研究［16］。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：2022-SR-046）。

1.2 遺傳工具變量篩選

根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建肺癌總體 （lung cancer overall，LCO）， LUAD， LUSC 的遺傳工具變量：（1） 遺傳工具變量與LC發(fā)生的關(guān)聯(lián)強度達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)水平（P ＜ 5×10-8）；（2） 遺傳工具變量之間無連鎖不平衡（linkage disequilibrium， LD） （r2＜ 0.001，windows = 500 kb）；（3） 遺傳工具變量的最小等位基因頻率（minor allele frequency， MAF） ＞ 0.01；（4） 排除位于回文序列中的工具變量；（5） 使用PhenoScanner數(shù)據(jù)庫剔除與混雜因素相關(guān)的遺傳工具變量；（6） 使用MR多效殘差和離群值（pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）模型中的 Outlier-corrected方法剔除工具變量中離群值（圖1）。

1.3 MR分析

兩樣本MR分析采用了多種方法:（1）逆方差加 權(quán) 法（inverse variance weighted， IVW）［17］。IVW是基于基因型的匯總數(shù)據(jù)，將每個遺傳工具變量的Wald估計值合并，獲得總體估計值； （2）遺傳風(fēng)險評分法（genetic risk score， GRS）。GRS 可代表所研究的暴露因素，進(jìn)而探討與結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)。本研究使用R（版本4.2.1）中的 “gtx”包 （Windows版本0.0.8版） 進(jìn)行分析，包中的grs.summary模塊具有基于匯總數(shù)據(jù)的GRS分析功能［18］；（3）加權(quán)中位數(shù)法（weighted median， WM）、簡單中位數(shù)法（simple median， SM）。WM法與SM法兩者類似，對遺傳工具變量的容忍度比較高，僅需50%以上的工具變量是有效工具變量，即可獲得穩(wěn)定的效應(yīng)值［19］；（4）MR穩(wěn)健調(diào)整評分法（robust adjusted profile score， RAPS）。RAPS法重點考量了工具變量暴露效應(yīng)中的測量誤差，即使存在較多弱工具變量也不會產(chǎn)生總體效應(yīng)的偏倚，尤其是用于暴露因素和結(jié)局都較為復(fù)雜的MR研究；（5）MR-PRESSO。MR-PRESSO強調(diào)水平多效性在MR研究中的作用，建議存在水平多效性時剔除離群值，矯正水平多效性后再進(jìn)行效應(yīng)評估；（6）使用Cochran’s Q檢驗進(jìn)行異質(zhì)性分析及MR-Egger檢驗進(jìn)行水平多效性測試。

1.4 統(tǒng)計分析工具

本研究采用雙側(cè)統(tǒng)計分析，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用R 4.1.2軟件中的“Two-Sample MR”“Mendelian Randomization”“gtx”“RAPS”“PRESSO”軟件包進(jìn)行MR分析。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳工具變量篩選

PLC的GWAS研究中LCO、LUAD和LUSC達(dá)到顯著性差異的工具變量分別為3 910、1 121和2 755個。根據(jù)工具變量之間的LD情況，篩選出無LD關(guān)聯(lián)的73個獨立工具變量（r2＜ 0.001， window = 500 kb）。剔除存在回文序列中的5個工具變量（rs2010752、rs4468572、rs11571833、rs9259927、rs149543464）。使用PhenoScanner數(shù)據(jù)庫剔除與混雜因素相關(guān)的工具變量［BMI：rs34517439、rs-71658797、rs34517439、rs71658797；吸煙：rs28580532、rs55781567、rs56113850、rs56113850、rs8040868、rs55781567、rs56113850；糖尿?。簉s3129063、rs3132556、rs116667074、rs144447022、rs148696809、rs148696809，rs144447022、rs116667074、rs2853999；炎癥性腸?。簉s239935、rs501942、rs501942；體力活動（中等強度10分鐘以上的天數(shù)或周數(shù)）：rs13201782、rs149866169］。最終47個獨立的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）被納入為PLC的工具變量，其中LCO、LUAD和LUSC分別23個、12個和12個工具變量（圖1）。

2.2 MR主分析

IVW法分析發(fā)現(xiàn)PLC與CRC在基因?qū)用嫔喜淮嬖陲@著關(guān)聯(lián)（結(jié)腸癌：OR = 1.0003，95% CI：0.9995～1.0011，P = 0.52；直腸癌：OR = 0.9999，95% CI：0.9994～1.0005，P = 0.88）。 亞 組 分 析同樣未發(fā)現(xiàn)LUAD（結(jié)腸癌: OR = 0.9998，95% CI：0.9990～1.0005，P = 0.51；直腸癌：OR = 0.9998，95% CI：0.9993～1.0004，P = 0.54）及 LUSC（結(jié)腸癌：OR = 0.9997，95% CI：0.9991～1.0004，P = 0.39；直腸癌：OR = 0.9996，95% CI：0.9991～1.00001，P =0.054）與CRC存在關(guān)聯(lián)。GRS法的分析結(jié)果與IVW法一致，即PLC與CRC無關(guān)（表1，圖2、3）。

表1 原發(fā)性肺癌和結(jié)直腸癌發(fā)病關(guān)聯(lián)的孟德爾隨機化研究Table 1.Mendelian Randomization Study of Association between PLC and CRC

圖2 兩樣本孟德爾隨機化森林圖Figure 2. Forest Plots of Two-Sample MR Analysis

圖3 兩樣本孟德爾隨機化散點圖Figure 3.Scatter Plot of Two-Sample MR Analysis

2.3 水平多效性及異質(zhì)性檢驗

MR-Egger方法顯示LCO、LUAD及LUSC組均未見顯著水平多效性。MR-PRESSO模型中的Outlier-corrected在LCO、LUAD及LUSC均未發(fā)現(xiàn)離群SNP。Cochran’s Q檢驗發(fā)現(xiàn)在研究LCO與直腸癌關(guān)聯(lián)時存在異質(zhì)性（Cochran’s Q值 = 35.284，P =0.04），我們采用了IVW方法中的隨機模型進(jìn)行評估，其余各組均未見顯著異質(zhì)性（表2）。

表2 兩樣本孟德爾隨機化異質(zhì)性和水平多效性評估。Table 2.Heterogeneity and Horizontal Pleiotropy of Two-Sample MR Analysis

2.4 敏感性分析

SM、WM、RAPS和PRESSO四種敏感性分析方法進(jìn)一步驗證主分析的結(jié)論，四種方法均顯示PLC與CRC不存在關(guān)聯(lián)，驗證了主分析的正確性及穩(wěn)健性（表 1，圖 2、3）。

3 討 論

SPC是指個體在罹患原發(fā)性癌癥一段時間后再次診斷出另一種原發(fā)性的癌癥。近年來，隨著癌癥在預(yù)防、診斷以及治療方面的進(jìn)步，海量的早期癌癥患者得到及時有效的治療，治療后患者生存期顯著延長，美國僅2014年一年就有1 450萬的早期癌癥患者獲得長期生存［20］。既往研究顯示，癌癥人群中SPC的患病比例較正常人群顯著增高，且隨著存活時間的推移呈上升趨勢，隨訪時間達(dá)到20年以上的，超過19%的患者可能罹患SPC［21］。在PLC方面，早期患者罹患SPC的風(fēng)險是正常人群的1.7倍［22］，約13.4%～22%的患者將罹患SPC［3］。隨著早期LC術(shù)后SPC發(fā)生比例的逐漸增高，SPC的發(fā)病、治療及預(yù)后引起了研究者們的廣泛關(guān)注，CRC作為發(fā)病率及死亡率位居前列的SPC，研究PLC與CRC之間的發(fā)病關(guān)聯(lián)，有助于早期LC術(shù)后CRC高?；颊叩暮Y查，及時開展有效的治療，從而提高患者的生存率。

SPC發(fā)病的病因目前仍不明確，觀察性研究提示遺傳因素，環(huán)境因素，生活習(xí)慣等均可能與SPC的發(fā)生相關(guān)。以往的觀察性研究發(fā)現(xiàn)，PLC和CRC之間可能存在關(guān)聯(lián)［23］，但由于混雜因素多樣、大樣本病例對照研究和隊列研究難以開展等原因，PLC和CRC之間是否存在關(guān)聯(lián)，存在何種水平的關(guān)聯(lián)仍然是一個有待探索的臨床問題。Zhou等［24］發(fā)表的基于SEER數(shù)據(jù)庫的研究發(fā)現(xiàn)，PLC治療后CRC的患病風(fēng)險較正常人群增加19%。Giopanou等［25］進(jìn)行的PLC與CRC基因?qū)Ρ葘嶒灡砻鳎?%～8%的NSCLC和13%的CRC患者存在BRAF基因突變，且15%的NSCLC和34%的CRC患者存在KRAS突變。然而Su等［26］進(jìn)行的回顧性研究揭示，PLC存活者中CRC的患病風(fēng)險并未增加［27］。本研究創(chuàng)新性地利用兩樣本MR的研究方法進(jìn)行PLC與CRC發(fā)病關(guān)聯(lián)的探索，研究證實PLC與CRC不存在基因水平上的關(guān)聯(lián)。

本研究首次采用兩樣本MR的研究方法探討兩種腫瘤類型之間的潛在關(guān)聯(lián)，與觀察性研究相比，該方法具有明顯優(yōu)勢。首先，我們利用PhenoScanner數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)性地篩選了與PLC以及CRC發(fā)生相關(guān)的混雜因素，并剔除與混雜因素有關(guān)聯(lián)的工具變量，避免遺傳工具變量存在潛在的水平多效性，并采用MR-Egger及MR-PRESSO （outlier-corrected）離群SNP評估法進(jìn)一步檢驗多效性的影響，保證了結(jié)果的可靠性［27-28］。此外，我們采用 Cochran’s Q 方法進(jìn)行工具變量的異質(zhì)性檢驗，若Cochran’s Q檢驗不存在顯著異質(zhì)性，通過IVW線性回歸進(jìn)行無偏倚的關(guān)聯(lián)估計；若存在顯著異質(zhì)性，則采用隨機效應(yīng)的IVW模型進(jìn)行分析［29-30］，保證了分析結(jié)果的正確性。第二，本研究除了應(yīng)用IVW法及GRS法作為主分析方法外，還應(yīng)用了多種敏感性分析法，包括WM方法、SM方法、RAPS方法及MR-PRESSO方法來驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。第三，我們首次對PLC采用分層分析的方法，鑒定了CRC與LUAD和LUSC的發(fā)生均無明顯關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究鑒定了PLC與CRC不存在基因?qū)用娴年P(guān)聯(lián)。本研究的結(jié)果將為早期PLC術(shù)后SPC-CRC精準(zhǔn)防治策略的制定奠定基礎(chǔ)。

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