戴美璐 游元和 肖 孟 陸 華

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔材料科，口腔頜面-頭頸腫瘤科*，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011）

膠原是重要的細(xì)胞外基質(zhì)，廣泛存在于動物的結(jié)締組織中，具有良好的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能。目前，膠原是天然醫(yī)用高分子材料轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)之一，其在組織再生、功能恢復(fù)領(lǐng)域展示出了良好的應(yīng)用前景[1]。然而，國內(nèi)、外現(xiàn)有的膠原類產(chǎn)品大多數(shù)為陸生動物來源的膠原。雖然陸生醫(yī)用膠原材料應(yīng)用需求廣泛，但其昂貴的成本和潛在的病毒傳播風(fēng)險，在一些領(lǐng)域中的應(yīng)用仍然受限，尋找陸生動物膠原的替代品是膠原類醫(yī)用材料發(fā)展的趨勢[2-3]。

基于以往研究，海洋源性膠原來源豐富，價格較低廉，生物安全性更高，還可以規(guī)避潛在的宗教壁壘問題；因此，海洋生物來源膠原無疑是最具潛力的替代性膠原[2,4]。當(dāng)然，需要尋找合適的手段和途徑，探討并證實(shí)海洋源性膠原的醫(yī)用價值及轉(zhuǎn)化前景。海洋源性膠原最為常見的為魚I 型膠原，I 型膠原是目前研究最為廣泛的膠原類生物醫(yī)用材料，尤其在組織誘導(dǎo)、修復(fù)再生領(lǐng)域。巨噬細(xì)胞是組織免疫微環(huán)境中的主要組成部位，是參與生物類醫(yī)用材料發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵細(xì)胞[3]?；诖?，本研究擬從來源相對較廣泛的魚I型膠原（marine type I collagen,MCI）入手，誘導(dǎo)人源巨噬細(xì)胞，體外給予不同濃度MCI 刺激，觀察其生物安全性，并采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法挖掘、探討MCI 的臨床應(yīng)用潛力。

1 材料和方法

1.1 MCI 的準(zhǔn)備

魚I 型膠原購于上海生工（魚鱗I 型膠原蛋白，A602898），2～8℃保存。MCI 在無菌條件下溶于1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中，配置成10 mg/ml 儲存液，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

單核細(xì)胞采用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1，美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。THP-1 用含10%胎牛血清（Gibco，美國）、10%青-鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海源培，中國）在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：THP-1 細(xì)胞在50ng/ml 的佛波酯（PMA，Sigma，美國）過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)成M0 巨噬細(xì)胞，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h 后，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.3 細(xì)胞活性實(shí)驗

細(xì)胞活性檢測采用Cell Counting Kit-8（CCK8）法。將3,000 個THP-1 細(xì)胞接種于96 孔板中，誘導(dǎo)成M0 巨噬細(xì)胞穩(wěn)定后，分為對照組和實(shí)驗組（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml;5 mg/ml），每組6 個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，向每孔加入10μl CCK8 試劑（碧云天，中國），孵育2 h 后檢測并比較各孔450 nm處的吸光度。

1.4 單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞趨化實(shí)驗

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞趨化能力檢測采用Transwell 實(shí)驗（5 μm 孔徑，Millipore,美國）。將20,000 個THP-1 細(xì)胞接種于上室，下室給予不同干預(yù)，檢測單核細(xì)胞的趨化能力，分為陰性對照組、陽性對照組（MCP-1，PeproTech，美國）和實(shí)驗組（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml），每組重復(fù)6 次。將20,000 個THP-1 細(xì)胞接種于上室，誘導(dǎo)成M0巨噬細(xì)胞穩(wěn)定后，下室給予不同干預(yù)，檢測巨噬細(xì)胞的趨化能力，分為陰性對照組、陽性對照組（MCP-1，50 ng/ml）和實(shí)驗組（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml），每組重復(fù)6 次。

1.5 免疫熒光染色

M0 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)穩(wěn)定后，給予不同干預(yù)，分為陰性對照組，陽性對照組（LPS+IFNγ）和實(shí)驗組（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml）。作用24 h后，細(xì)胞固定，透膜，細(xì)胞骨架染色（Cytoskeleton,美國），細(xì)胞核DAPI（碧云天，中國）復(fù)染。熒光顯微鏡（Leica,德國）下觀察并拍照。

1.6 RT-qPCR 實(shí)驗

M0 巨噬細(xì)胞刺激24 h 后，加入1 ml TRIzol，按試劑盒步驟要求（TaKaRa，日本）提取mRNA，并逆轉(zhuǎn)cDNA，-20℃保存。目的基因TNFα，IL-1β，IL-6，CXCL13 和MMP9 表達(dá)量檢測按說明書（TaKaRa，日本）要求采用SYBR Green 染料法，內(nèi)參選用GAPDH，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)并比較。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

M0 巨噬細(xì)胞經(jīng)MCI 刺激后提取總RNA，采用DNBSEQ 平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（華大基因，武漢），每個樣本重復(fù)3 次。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，使用HISAT and Bowtie2 軟件，參考人類基因組hg38（版本號:GCF_000001405.38_GRCh38.p13）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用R 語言包定義Q 值≤0.001，差異倍數(shù)＞1.5，KEGG 分析并比較差異基因（differentially expressed genes，DEGs）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件（SPSS,美國），數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的差異比較采用Student-t檢驗，P＜0.05 表示兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCI 對巨噬細(xì)胞活性的影響

24 h 時發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，各實(shí)驗組均不會顯著影響M0 巨噬細(xì)胞的活性（圖1a）。48 h時發(fā)現(xiàn)，1 mg/ml 和3 mg/ml 不會顯著影響M0 巨噬細(xì)胞的活性；5 mg/ml 組，與正常對照組相比M0 巨噬細(xì)胞活性顯著降低（圖1b）。

圖1 MCI 對巨噬細(xì)胞活性的影響

2.2 MCI 對單核/巨噬細(xì)胞趨化功能的影響

對照觀察發(fā)現(xiàn)，1 mg/ml 和3 mg/ml 濃度下，MCI 不會明顯提高單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的趨化能力（圖2）。

圖2 MCI 對單核/巨噬細(xì)胞趨化功能的影響

2.3 MCI 對巨噬細(xì)胞炎癥表型的影響

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，1 mg/ml 和3 mg/ml MCI 不會引起M0 巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞變化（圖3a）。通過檢測M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)，進(jìn)一步明確該濃度下MCI 不會引起M0 巨噬細(xì)胞TNFα，IL-1β 和IL-6 表達(dá)水平的顯著提高（圖3b）。

圖3 MCI 對巨噬細(xì)胞炎癥表型的影響

2.4 MCI 對巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果提示，與對照組相比，MCI 作用下M0 巨噬細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)的DEGs 有3375 個，下調(diào)的DEGs 有3167 個（圖4a-b）。KEGG 分析結(jié)果提示，上調(diào)的DEGs 與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和趨化因子信號通路最為密切相關(guān)（圖4c）。結(jié)合文獻(xiàn)檢索，在上調(diào)的DEGs中篩選出表達(dá)差異最為顯著的候選基因CXCL13（圖4d）。進(jìn)一步體外驗證證實(shí)，MCI 可以促進(jìn)M0 巨噬細(xì)胞CXCL13 表達(dá)水平的顯著提高（圖4e）。

圖4 MCI 對巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

3 討論

海洋生物種類繁多，海洋類原料資源豐富；隨著對海洋類生物材料的探索和研究，海洋類材料在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用價值也得到不斷地認(rèn)可[5]。本研究以魚鱗I 型膠原和巨噬細(xì)胞為研究對象，采用一系列實(shí)驗評估、探討MCI 的臨床應(yīng)用潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，MCI 在1 mg/ml 和3 mg/ml 工作濃度下，在體外不會對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性，單核/巨噬細(xì)胞的趨化功能及巨噬細(xì)胞炎性表型產(chǎn)生顯著影響。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組測序及驗證發(fā)現(xiàn)，MCI 可以顯著提高巨噬細(xì)胞CXCL13 的表達(dá)。

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是體內(nèi)最先響應(yīng)生物材料刺激的直接細(xì)胞[4]。本研究首先證實(shí)，MCI 在1 mg/ml 和3 mg/ml 工作濃度下不會影響巨噬細(xì)胞正常的活性狀態(tài)，一定程度上可以反映MCI 臨床應(yīng)用的生物安全性。本研究通過觀察發(fā)現(xiàn)MCI 不會顯著影響單核/巨噬細(xì)胞趨化功能及對巨噬細(xì)胞炎性表型，亦是評估生物材料免疫原性的重要實(shí)驗?；谝陨辖Y(jié)果，可以推測MCI 用于臨床具有一定生物安全性。既往研究報道，小牛來源的I 型膠原可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)COX-2，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)[6]。亦有研究表明，陸生I 型膠原可促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1 型極化[7]。本研究證實(shí)，MCI 不參與調(diào)控巨噬細(xì)胞趨化功能和炎性表型，提示其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用方向需要進(jìn)一步探討。

海洋膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能與陸生動物來源的膠原蛋白存在一定程度的差異，這些差異極有可能導(dǎo)致兩者臨床應(yīng)用及轉(zhuǎn)化的范圍不同[3]。本研究遂采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法進(jìn)一步探討MCI 對巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，發(fā)現(xiàn)MCI 可以顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCL13。大量研究證實(shí)，CXCL13 參與成骨微環(huán)境調(diào)控，尤其在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢和分化過程中發(fā)揮重要作用[8,9]。此外，CXCL13 可調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎患者局部成骨細(xì)胞分泌I型膠原蛋白，促進(jìn)骨組織缺損修復(fù)[10]。基于以上發(fā)現(xiàn)，本研究推測MCI 可能會在需要調(diào)控成骨的臨床實(shí)踐中具有應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究通過一系列實(shí)驗，證實(shí)魚I 型膠原不會引起人巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，并推測其可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)CXCL13 參與骨缺損修復(fù)，其臨床應(yīng)用領(lǐng)域及其潛在的機(jī)制尚需后續(xù)進(jìn)一步研究明確和探討。