毛林夕　王夢云　楊皓宇　覃艷　王煒

〔摘要〕 目的 制備谷胱甘肽（glutathione， GSH）響應(yīng)的香豆素類熒光探針并應(yīng)用于中藥GSH調(diào)節(jié)劑的篩選。方法 以香豆素為熒光團(tuán)，2-氯-5-硝基嘧啶為淬滅基團(tuán)，構(gòu)建GSH響應(yīng)的熒光探針（HCN），通過紫外、高效液相色譜、熒光光譜和核磁等表征手段確定HCN的結(jié)構(gòu)及其對(duì)GSH響應(yīng)的可行性、特異性、靈敏性，以確定最佳響應(yīng)條件。通過MTT實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞成像考察HCN的細(xì)胞毒性及胞內(nèi)熒光信號(hào)。以GSH商品化消耗劑（NEM）為陽性對(duì)照，選取民族藥血筒中16種化合物為篩選對(duì)象，通過HCN檢測所選化合物對(duì)GSH水平的調(diào)控能力，并進(jìn)一步采用分子對(duì)接手段驗(yàn)證篩選結(jié)果的可靠性。結(jié)果 核磁譜表明HCN合成成功，能與GSH特異性響應(yīng)并呈線性關(guān)系，且HCN的最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為37 ℃和100 min。MTT實(shí)驗(yàn)表明，在HepG2細(xì)胞中，與0 μmol/mL相比，80 μmol/mL和100 μmol/mL的HCN降低了細(xì)胞活力（P＜0.05），說明HCN對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有影響；在HL-7702細(xì)胞中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN對(duì)細(xì)胞活力影響微弱（P>0.05），說明HCN對(duì)HL-7702細(xì)胞增殖無影響。在細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05）。在藥物篩選中，與control相比，血筒中的化合物五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯和異南內(nèi)酯A下調(diào)了GSH的水平（P＜0.001，P＜0.05）。分子對(duì)接結(jié)果表明，血筒中的化合物五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯和異南內(nèi)酯A與GSH形成了2個(gè)及以上的氫鍵，結(jié)合能分別為-3.94、-3.64、-4.87 kal/mol。結(jié)論 本文設(shè)計(jì)合成了一種GSH響應(yīng)的香豆素類探針HCN，HCN具有良好的GSH響應(yīng)特異性、靈敏性、光穩(wěn)定性及低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，能應(yīng)用于中藥GSH調(diào)節(jié)劑的篩選，該研究可為熒光探針技術(shù)服務(wù)與中藥活性成分篩選提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 熒光探針；香豆素；谷胱甘肽；生物硫醇；天然產(chǎn)物；血筒

〔中圖分類號(hào)〕R284；R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.012

Preparation of GSH-responsive probe and its application in screening natural medicine

MAO Linxi， WANG Mengyun， YANG Haoyu， QIN Yan， WANG Wei

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To prepare the glutathione （GSH）-responsive coumarin fluorescent probe and apply it to screen GSH regulators in Chinese medicine. Methods A GSH-responsive fluorescent probe （HCN） was constructed by coumarin as fluorophore and 2-chloro-5-nitropyrimidine as quench group. The structure of HCN and the feasibility， specificity， and sensitivity of its response to GSH were determined by ultraviolet-visible （UV-Vis）， high performance liquid chromatography （HPLC）， fluorescence spectrum and nuclear magnetic resonance （NMR） spectrum， so as to ascertain the optimal response conditions. The cytotoxicity and intracellular fluorescence signal of HCN were examined by MTT assay and cell imaging， respectively. Using GSH commercial consumable （NEM） as the positive control， 16 compounds of Xuetong in the ethnic medicine were selected as screening objects. The regulatory ability of the selected compounds on GSH level was checked by HCN， and the reliability of the screening results was further verified by molecular docking method. Results The NMR spectrum showed that HCN was synthesized successfully and could respond to GSH in a linear relationship. The optional temperature and time of reaction of HCN were 37 ℃ and 100 min， respectively. MTT assay showed that， in HepG2 cells， HCN of 80 μmol/mL and 100 μmol/mL lowered the cell viability compared with HCN of 0 μmol/mL （P<0.05）， which indicated the influence of HCN on HepG2 cell proliferation. While in HL-7702 cells， HCN with various concentrations has mild effects on cell viability compared with HCN of 0 μmol/mL （P>0.05）， which indicated that HCN had no effects on HL-7702 cell proliferation. Cell imaging experiment demonstrated that HCN of various concentrations possessed higher fluorescence intensity compared with HCN of 0 μmol/mL （P<0.05）. Schisanlactone B， kadsudilactone， and heteroclitalactone A of Xuetong down-regulated GSH level compared with control in drug screening （P<0.001， P<0.05）. Molecular docking results showed that two or more hydrogen bonds were formed by Schisanlactone B， kadsudilactone， and heteroclitalactone A of Xuetong， and GSH， with the binding energies of -3.94， -3.64， and -4.87 kal/mol. Conclusion In this paper， HCN， a GSH-responsive coumarin fluorescent probe， was designed and synthesized. It is featured by good GSH response specificity， sensitivity， light stability and low cytotoxicity， which could help screen GSH regulators of Chinese medicines. This study aimed to provide reference for fluorescence probe technology to screen active ingredients in Chinese medicines.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 fluorescent probe; coumarin; glutathione; biological thiols; natural products; Xuetong

谷胱甘肽（glutathione， GSH）作為細(xì)胞中最豐富的生物硫醇，1～10 mmol/L的含量在維持人體正常生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用。因此，檢測體內(nèi)GSH具有重要意義[1-3]?，F(xiàn)有分析方法如高效液相色譜法[4-6]、質(zhì)譜法[7-9]、熒光探針法[10-12]、電化學(xué)法[13]和量熱法[14]已被廣泛用于GSH水平檢測。其中，熒光探針法具有操作方便、成本低和靈敏可視等特點(diǎn)，已成為目前檢測GSH的主要手段。GSH是細(xì)胞內(nèi)氧化還原活動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控的重要單位[15]，常為疾病診斷和治療的重要生物標(biāo)志物。癌癥、心臟病和肝損傷等疾病，可能都是由GSH水平異常引起的[16-17]。因此，開發(fā)定量檢測GSH水平的熒光探針方法具有重要的疾病診斷和治療意義[18-19]。

熒光探針主要由熒光團(tuán)、連接基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)組成，熒光團(tuán)可用來發(fā)射熒光信號(hào)，其結(jié)構(gòu)多含有共軛體系，識(shí)別基團(tuán)是熒光探針與分析物特異性識(shí)別的位點(diǎn)，連接基團(tuán)的作用是將熒光團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)連接起來[20]。熒光分子探針檢測方法具有選擇性高、靈敏度高、肉眼可見、操作簡單和成本低等特點(diǎn)，已成為生物學(xué)分析、有機(jī)合成與代謝和臨床診斷的重要手段之一[21]。香豆素的基本結(jié)構(gòu)是苯并吡喃環(huán)，為一種內(nèi)酯化合物，具有熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大和光學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)[22]。本實(shí)驗(yàn)以7-羥基香豆素為熒光基團(tuán)、2-氯-5-硝基嘧啶為熒光淬滅基團(tuán)，合成具有GSH識(shí)別位點(diǎn)的香豆素型探針HCN。研究通過合成一種開關(guān)型熒光探針，從而可視化地對(duì)細(xì)胞內(nèi)外GSH的水平變化進(jìn)行定量檢測，并據(jù)此快速地篩選具有GSH水平調(diào)控能力的中藥活性成分，為GSH相關(guān)疾病的調(diào)控尋找新的候選中藥活性分子。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)試劑

GSH（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z17S10C97807）；7-羥基香豆素（批號(hào)：I1818049）、2-氯-5-硝基嘧啶（批號(hào)：G2123334）均購自上海阿拉丁試劑公司；N，N-二甲基甲酰胺（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)：C13331861）；吡啶（批號(hào)：20150930）、二氯甲烷（批號(hào)：20220119）、石油醚（批號(hào)：20210914）、二甲基亞砜（批號(hào)：20220218）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清（批號(hào)：SA220415）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：WH0022D221）、青霉素-鏈霉素（雙抗，100×）（批號(hào)：WH0622G181）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；PBS（批號(hào)：20221101）、胰蛋白酶（批號(hào)：20220501）均購自北京賽文創(chuàng)新科技有限公司。天然產(chǎn)物來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥名族醫(yī)藥國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室從血筒葉中分離出來的化合物。

1.2? 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司，型號(hào)：F-7000）；紫外分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào)：UV-1800）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：FV1200）； NMR光譜（德國Brucker公司，型號(hào)：Bruker 600MHz）；微孔板檢測器（美國PerkinElmer公司，型號(hào)：Epire）；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)（美國賽默飛公司，型號(hào)：HERA CELL 150i、ST 8R）；雙目倒置相差顯微鏡（美國尼康公司，型號(hào)：TS2R）。

1.3? HCN的合成和表征

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向250 mL圓底燒瓶中分別加入7-羥基香豆素（10.5 mg）、2-氯-5-硝基嘧啶（28.6 mg）和吡啶（20 μL），加入10 mL無水N，N-二甲基甲酰胺中，在70 ℃下反應(yīng)7 h。將混合物蒸發(fā)，并通過二氯甲烷和石油醚（v/v，10/1）洗脫的硅膠色譜進(jìn)一步純化殘留物，以獲得HCN（白色固體，20.8 mg，53.3%）。HCN的氫譜數(shù)據(jù)顯示有7個(gè)氫，分別為δ_H9.47（s，2H）、8.11（1H，d，J=58 Hz）、7.85（1H，d，J=8.45 Hz）、7.49（1H，d，J=2.23 Hz）、7.33（1H，dd，J=8.46，2.28 Hz）、6.51（1H，d，J=9.61 Hz）。碳譜數(shù)據(jù)顯示有13個(gè)碳，分別為δ_C165.8、159.7、156.8、154.5、154.4、143.8、139.8、129.8、118.3、117.0、115.7、110.0、59.8。液質(zhì)數(shù)據(jù)LC-MS m/z[C₁₃H₇N₃O₅⁺]為286.3。

1.4? HCN的可行性和特異性實(shí)驗(yàn)

用去離子水制備GSH（10 mmol/mL）的儲(chǔ)存溶液，并稀釋至不同濃度。HCN儲(chǔ)備液用DMSO/PBS（1/9，v/v）制備，并將儲(chǔ)備液用去離子水稀釋至終濃度為20 μmol/mL，得到光譜測定溶液。用熒光分光光度計(jì)或紫外可見吸收分光光度計(jì)記錄不同分析物的熒光或紫外吸收光譜。

1.5? MTT實(shí)驗(yàn)

HL-7702和HepG2細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）在含有100 μL DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%鏈霉素、37 ℃，5% CO2）的96孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到 80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，將含不同濃度HCN的培養(yǎng)基（1%胎牛血清）加入96孔板中進(jìn)一步孵育48 h。HCN孵育結(jié)束后去除培養(yǎng)基，將含有MTT溶液（0.5 mg/mL）的100 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中，再孵育2～4 h。最后，棄掉含有MTT溶液的培養(yǎng)基，加入DMSO（100 μL），并在細(xì)胞活力測定前，在黑暗中低速搖動(dòng)15 min。

1.6? 細(xì)胞成像

將HepG2細(xì)胞（4×104個(gè)/孔）接種在鋪有爬片的12孔板上，用1 mL DMEM（10%胎牛血清、1%鏈霉素、37 ℃和5% CO₂）培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，用Mito-Tracker紅色染料（200 μL）孵育30 min。隨后用恢復(fù)至室溫的PBS 洗3遍，用不同濃度的HCN（0、40、80、100、200、300、400 μmol/mL）孵育30 min后，用PBS洗3遍，最后用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像。

1.7? GSH中藥調(diào)節(jié)劑的篩選

在含有200 μL PBS的EP管中依次加入16種血筒化合物（20 μmol/mL）和GSH（100 μmol/mL），室溫下反應(yīng)30 min。隨后加入HCN（20 μmol/mL），在37 ℃下反應(yīng)30 min。用熒光分光光度計(jì)測量熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射范圍為 400～550 nm。

1.8? 分子對(duì)接

研究HCN和血筒化合物（五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯、異南內(nèi)酯A）與GSH之間的潛在結(jié)合模式，使用Le Dock.win32軟件進(jìn)行分子對(duì)接。通過Chem 3D 20.0將HCN和血筒化合物結(jié)構(gòu)的2D模式轉(zhuǎn)換為3D模式，將HCN和血筒化合物（五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯、異南內(nèi)酯A）結(jié)構(gòu)能量質(zhì)子化并最小化，以獲得穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)，并以“moe file”形式保存。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載GSH（PDB代碼：1b4q）的氨基酸序列。用LeDock.win32軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1? HCN的檢測原理

香豆素類化合物具有熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)，是一種優(yōu)良的熒光基團(tuán)。同時(shí)，2-氯-5-硝基嘧啶作為一種經(jīng)典的熒光淬滅劑，具有穩(wěn)定可靠的熒光淬滅性能。本實(shí)驗(yàn)以7-羥基香豆素為熒光團(tuán)、2-氯-5-硝基嘧啶為淬滅基團(tuán)，成功合成了無熒光信號(hào)的HCN。HCN可特異性地與GSH反應(yīng)，釋放出熒光基團(tuán)7-羥基香豆素，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)從無到有的轉(zhuǎn)變。詳見圖1。

2.2? HCN的表征

為驗(yàn)證HCN是否成功合成，采用質(zhì)譜對(duì)其分子量進(jìn)行了分析。由圖2可見，HCN的分子量為286.3，與計(jì)算所得分子量286.2相符。同時(shí)，采用核磁技術(shù)進(jìn)一步確證了HCN的結(jié)構(gòu)。從氫譜中可以看出該探針含有7個(gè)氫，并且有2個(gè)氫化學(xué)位移相同，說明這2個(gè)氫在嘧啶基團(tuán)上空間位置相同，且香豆素上的7位羥基與嘧啶上的2位氯發(fā)生取代反應(yīng)。從碳譜可以看出該探針含有13個(gè)碳，故氫譜和碳譜數(shù)據(jù)表明HCN合成成功。

2.3? HCN的可行性和特異性

為了研究HCN對(duì)GSH的敏感性，研究特定濃度HCN（20 μmol/mL）和GSH（100 μmol/mL）的溫度和時(shí)間依賴性熒光響應(yīng)。溫度依賴性實(shí)驗(yàn)表明在37 ℃時(shí)其熒光強(qiáng)度最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)在37 ℃下進(jìn)行（見圖3A）。時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)中，在剛開始的10～100 min，可以發(fā)現(xiàn)其峰值發(fā)射強(qiáng)度迅速增加，120 min時(shí)達(dá)到平臺(tái)期后開始下降，因此，100 min為HCN與GSH的最佳反應(yīng)時(shí)間（見圖3B）。在紫外可見吸收光譜實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)HCN的溶液中含有GSH時(shí)，其紫外吸收峰和熒光團(tuán)7-羥基香豆素吸收峰位置相同，而不含GSH的溶液幾乎沒有紫外吸收，說明HCN與GSH反應(yīng)后釋放的熒光物質(zhì)為7-羥基香豆素，這與預(yù)期結(jié)果相符（見圖3C）。在離子選擇性實(shí)驗(yàn)中，HCN與各組分析物反應(yīng)后，HCN與GSH響應(yīng)最強(qiáng)，說明HCN可以特異性地響應(yīng)GSH而不受其他干擾因素的影響（見圖3D）。HCN對(duì)GSH的濃度依賴性實(shí)驗(yàn)中，在不含GSH時(shí)，幾乎沒有熒光發(fā)射峰，然而，隨著GSH（0～200 μmol/mL）濃度的增加，各發(fā)射光譜曲線在450 nm處的發(fā)射條帶逐漸增強(qiáng)，并與0～200 μmol/mL范圍內(nèi)的GSH濃度具有線性相關(guān)性（R²=0.9897）（見圖3E、3F）。分子對(duì)接結(jié)果表明，HCN和GSH通過氫鍵與GLN-65、ASN-66和ALA-67結(jié)合，形成了3個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，其結(jié)合能為-6.09 kcal/mol，說明HCN與GSH可以穩(wěn)定地結(jié)合（見圖4）。

2.4? HCN細(xì)胞毒性和成像

兩株細(xì)胞分別用不同濃度的HCN孵育48 h后，在HepG2細(xì)胞中，與0 μmol/mL相比，80 μmol/mL和100 μmol/mL的HCN降低了細(xì)胞活力（P<0.05），對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有影響。在HL-7702細(xì)胞中，與0 μmol/mL相比，各濃度的HCN對(duì)細(xì)胞活力影響微弱（P>0.05），對(duì)細(xì)胞增殖無影響。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN藍(lán)色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05），直到濃度達(dá)到400 μmol/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。詳見圖5—6。

2.5? GSH中藥調(diào)節(jié)劑的篩選及其分子對(duì)接

與control相比，化合物五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯和異南內(nèi)酯A的GSH水平下調(diào)（P＜0.05），而其他化合物對(duì)GSH水平變化的影響微弱（P>0.05）。分子對(duì)接結(jié)果表明，五內(nèi)酯B通過氫鍵與LYS-A：19和GLN-A：57結(jié)合，而南五內(nèi)酯通過氫鍵與VAL-A：29、TYR-A：24、CYS-A：22和LYS-A：19連接，異南內(nèi)酯A通過氫鍵與SER-A：83、GLN-A：57和ARG-A：67連接，各自形成了2個(gè)及以上穩(wěn)定的氫鍵，其結(jié)合能分別為-3.94、-3.64、-4.87 kal/mol。詳見表1、圖7。

3 討論

土家族藥物血筒[Kadsura heteroclita （Roxb.） Craib]為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬（Kadsura），是一種常綠攀緣型木質(zhì)藤本，主要藥用部位是莖和果實(shí)。目前，已經(jīng)有較多的文獻(xiàn)報(bào)道了中藥血筒中化學(xué)成分的研究，從中藥血筒莖中分離并鑒定的化合物主要有木脂素類、三萜類、倍半萜類、黃酮類、甾體類等化學(xué)成分[23-26]。藥理學(xué)研究也表明，中藥血筒中分離得到的單體化合物具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗HBV、抗HIV和抗癌等藥理活性[27]。本實(shí)驗(yàn)中篩選的化合物主要是從血筒葉中分離提取得到，除了傳統(tǒng)的抗炎和抗癌等藥理作用外，血筒化合物五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯和異南內(nèi)酯A 3個(gè)三萜化合物可以下調(diào)GSH的表達(dá)水平。

GSH是含量最多的一種生物硫醇，在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、抵御自由基和毒素方面起著重要作用。本研究成功合成了GSH響應(yīng)型HCN，其具有高選擇性、低細(xì)胞毒性和高靈敏度等特點(diǎn)。通過紫外、液相、熒光光譜和細(xì)胞成像等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCN可以靈敏地檢測細(xì)胞內(nèi)外GSH表達(dá)水平的變化，并通過HCN成功地從血筒化合物中篩選了中藥GSH調(diào)節(jié)劑五內(nèi)酯B、南五內(nèi)酯和異南內(nèi)酯A。綜上所述，本文主要以HCN為篩選工具，GSH為篩選靶標(biāo)，成功獲取了能下調(diào)GSH水平的中藥GSH調(diào)節(jié)劑，該研究為快速發(fā)現(xiàn)中藥活性成分提供了新思路。

參考文獻(xiàn)

[1] CHEN S， HOU P， SUN J W， et al. A new long-wavelength emission fluorescent probe for imaging biothiols with remarkable Stokes shift[J]. Spectrochimica Acta Part A， Molecular and Biomol？鄄ecular Spectroscopy， 2020， 241： 118655.

[2] SONG Y， ZHOU L Y， WANG J J， et al. Synthesis and application of benzoxazole derivative-based fluorescent probes for naked eye recognition[J]. Luminescence， 2020， 35（7）： 1010-1016.

[3] ZHONG Q， CHEN Y， SU A， et al. Synthesis of catalytically active carbon quantum dots and its application for colorimetric detection of glutathione[J]. Sensors and Actuators， 2018， 273： 1098-1102.

[4] LIU S， ANSARI N H， WANG C， et al. A rapid HPLC method for the quantification of GSH and GSSG in ocular lens[J]. Current Eye Research， 1996， 15（7）： 726-732.

[5] GIUSTARINI D， DALLE-DONNE I， COLOMBO R， et al. An improved HPLC measurement for GSH and GSSG in human blood[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2003， 35（11）： 1365-1372.

[6] DI PIETRA A M， GOTTI R， BONAZZI D， et al. HPLC determination of glutathione and L-cysteine in pharmaceuticals after derivatization with ethacrynic acid[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 1994， 12（1）： 91-98.

[7] ZHANG Y F， WANG Y， ZHANG K R， et al. Development and validation of a rapid， robust and sensitive UPLC-QQQ-MS/MS method for simultaneous quantification of GSH metabolism in lung cancer cells[J]. Journal of Chromatography B， 2020， 1148： 122145.

[8] HABERHAUER-TROYER C， DELIC M. Accurate quantification of the redox-sensitive GSH/GSSG ratios in the yeast Pichia pastoris by HILIC-MS/MS[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry， 2013， 405（6）： 2031-2039.

[9] HARWOOD D T， KETTLE A J， WINTERBOURN C C. Production of glutathione sulfonamide and dehydroglutathione from GSH by myeloperoxidase-derived oxidants and detection using a novel LC-MS/MS method[J]. The Biochemical Journal， 2006， 399（1）： 161-168.

[10] SEDGWICK A C， HAN H H， GARDINER J E， et al. The development of a novel AND logic based fluorescence probe for the detection of peroxynitrite and GSH[J]. Chemical Science， 2018， 9（15）： 3672-3676.

[11] LI X Q， HUO F J， YUE Y K， et al. A coumarin-based "off-on" sensor for fluorescence selectivily discriminating GSH from Cys/Hcy and its bioimaging in living cells[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 2017， 253： 42-49.

[12] LIU C， QI F， WEN F， et al. Fluorescence Detection of Glutathione （GSH） and Oxidized Glutathione （GSSG） in Blood with a NIR-Excitable Cyanine Probe[J]. Methods and Applications in Fluorescence， 2017， 25（4）： 580-586.

[13] XIE J， CHENG D， LI P， et al. Au/metal-organic framework nanocapsules for electrochemical determination of glutathione[J]. ACS Applied Nano Materials， 2021， 4（5）： 4853-4862.

[14] XIANYU Y L， XIE Y Z Y， WANG N X， et al. A dispersion-dominated chromogenic strategy for colorimetric sensing of glutathione at the nanomolar level using gold nanoparticles[J]. Small， 2015， 11（41）： 5510-5514.

[15] ZHAI L， SHI Z， TU Y， et al. A dual emission fluorescent probe enables simultaneous detection and discrimination of Cys/Hcy and GSH and its application in cell imaging[J]. Dyes and Pigments， 2019， 165： 164-171.

[16] LI X R， LIU W S， DENG M， et al. Fluorescent glutathione probe based on MnO2-Si quantum dots nanocomposite directly used for intracellular glutathione imaging[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 2018， 255： 1687-1693.

[17] 朱玉輝， 柴? 勁. 黃芪補(bǔ)氣湯聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)肝癌介入治療后患者肝功能、氧化應(yīng)激及炎癥的影響[J]. 陜西中醫(yī)， 2021， 42（5）： 570-572， 576.

[18] LIU Y， XIANG K， TIAN B， et al. A fluorescein-based fluorescence probe for the fast detection of thiol[J]. Tetrahedron Letters， 2016， 57（23）： 2478-2483.

[19] ZHANG J， WANG N， JI X， et al. Recent Progress in BODIPY-based Fluorescent Probes for Biothiols[J]. Chemistry， 2019， 26（19）： 4172-4192.

[20] 韓文強(qiáng). 羅丹明和香豆素類金屬離子熒光探針的合成及光譜性能研究[D]. 南昌： 南昌大學(xué)， 2017.

[21] 陳祥根. 香豆素類多反應(yīng)位點(diǎn)的活性硫熒光探針：設(shè)計(jì)合成與應(yīng)用[D]. 合肥： 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 2022.

[22] 商理超. 用于檢測肝細(xì)胞肝癌患者GSH水平變化的香豆素?zé)晒馓结樇捌渖锍上駪?yīng)用[D]. 瀘州： 西南醫(yī)科大學(xué)， 2022.

[23] 李曉光， 羅煥敏. 南五味子屬植物化學(xué)成分及其活性研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志， 2003， 28（12）： 1120-1125.

[24] 陸曉珊， 胡勝濤， 唐? 琳， 等. 血筒化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J]. 中成藥， 2022， 44（10）： 3263-3268.

[25] 蘇? 維. 血筒氯仿部位的化學(xué)成分及其生物活性的研究[D]. 長沙： 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 2014.

[26] 羅藝萍， 王素娟， 趙靜峰， 等. 異型南五味子的化學(xué)成分研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009， 31（4）： 406-409.

[27] CAO L， SHEHLA N， LI B， et al. Schinortriterpenoids from Tujia ethnomedicine Xuetong-the stems of kadsura heteroclita[J]. Phytochemistry， 2020， 169： 112178.