駱慧婷　歐陽威　王旭易　顏紅　陳姿延　吳慧　李濤　肖丹

〔摘要〕 目的 制備葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質(zhì)體（FA-BF-CLs），并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)及抗肝癌研究。方法 采用薄膜-超聲分散法制備FA-BF-CLs，以粒徑、Zeta電位及包封率等為指標(biāo)，采用單因素和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)處方及工藝進(jìn)行優(yōu)化。透射電鏡觀察脂質(zhì)體顯微形態(tài)，并考察其體外釋放過程、溶血性及空白陽離子脂質(zhì)體體外細(xì)胞安全性。采用CCK-8法比較FA-BF-CLs、BF-CLs（未加葉酸修飾的蟾毒靈陽離子脂質(zhì)體）及BF-solution（蟾毒靈溶液）的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果 最佳條件為磷脂與藥物質(zhì)量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質(zhì)量比3.8∶1、超聲時(shí)間13 min，制備得到脂質(zhì)體粒徑（135.5±1.40） nm，多分散系數(shù)0.192±0.025，Zeta電位（16.23±0.46） mV，包封率69.42%±2.18%。體外釋放研究表明，F(xiàn)A-BF-CLs具有明顯的緩釋效果，溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示該載體材料無溶血現(xiàn)象。體外細(xì)胞安全性結(jié)果顯示陽離子脂質(zhì)體濃度在0～20 μmol/L范圍內(nèi)安全無毒。體外細(xì)胞毒性表明FA-BF-CLs對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用大于BF-CLs和BF-solution（P<0.0.1）。結(jié)論 制備得到的FA-BF-CLs外觀均一穩(wěn)定、具有緩釋性能，空白陽離子脂質(zhì)體安全無毒，F(xiàn)A-BF-CLs具有更強(qiáng)的體外抗肝癌研究，可用于進(jìn)一步的研究。

〔關(guān)鍵詞〕 蟾毒靈；陽離子脂質(zhì)體；葉酸；Box-Behnken響應(yīng)面分析法；肝癌

〔中圖分類號(hào)〕R283.6? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.010

Preparation and evaluation in vitro of folic acid-modified bufalin cationic liposomes

LUO Huiting， OUYANG Wei， WANG Xuyi， YAN Hong CHEN Ziyan， WU Hui， LI Tao， XIAO Dan

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To prepare folic acid-modified bufalin cationic liposomes （FA-BF-CLs） and to evaluate their quality and anti-liver cancer. Methods FA-BF-CLs were prepared by thin-film ultrasonic dispersion method. Moreover， the formulation and process of FA-BF-CLs were optimized by single factor and Box-Behnken response surface analysis with particle size， Zeta potential and encapsulation rate as indexes. The micromorphology of liposomes was observed by transmission electron microscopy， and the in vitro release process， hemolysis and in vitro cell safety of blank cationic liposomes were investigated. The in vitro cytotoxicity of FA-BF-CLs， BF-CLs （bufalin cationic liposomes without folic-acid modification） and BF-solution （bufalin solution） was compared by the CCK-8 method. Results The optimum conditions were as follows： the mass ratio of phospholipid to drug was 14.17∶1， the mass ratio of phospholipid to cholesterol was 3.8∶1， and the ultrasonic time was 13 min. The particle size of liposomes was （135.5±1.40） nm， the polydispersity index was 0.192±0.025， the Zeta potential was （16.23±0.46） mV， and the encapsulation rate was 69.42%±2.18%. The in vitro release study showed that FA-BF-CLs had an obvious sustained release effect， and hemolysis test showed that the carrier material had no hemolysis. The in vitro cell safety result showed that the cationic liposomes were safe and non-toxic in the concentration range from 0 to 20 μmol/L， and the in vitro cytotoxicity tests demonstrated that the inhibitory effects of FA-BF-CLs on HepG2 hepatoma cells were greater than those of BF-CLs and BF-solution （P<0.01）. Conclusion The prepared FA-BF-CLs appears uniform and stable， and possesses sustained release properties， of which the blank cationic liposomes are safe and non-toxic. Moreover， FA-BF-CLs have stronger anti-liver cancer in vitro and can be used for further research.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 bufalin; cationic liposomes; folic acid; Box-Behnken response surface analysis; anti-liver cancer

肝癌，包括原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌，是最為常見的惡性腫瘤之一，目前臨床常采用化療和手術(shù)治療肝癌，雖然顯著延長了患者的生存時(shí)間，但可能會(huì)引起其他正常細(xì)胞的死亡以及多藥耐藥性等毒副作用[1]。蟾毒靈（Bufalin， BF）是從蟾酥干燥皮中提取的有效的抗腫瘤單體[2]，研究表明，蟾毒靈可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、分化和自噬，抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)治療肝腫瘤效果更為顯著[3-5]。陽離子脂質(zhì)體是一種新型給藥載體，主要由陽離子型材料、中性磷脂及膽固醇組成，可有效地包載藥物[6]。因其表面帶有正電荷，能與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂質(zhì)產(chǎn)生靜電吸附作用，通過細(xì)胞內(nèi)吞或膜融合的方式將藥物導(dǎo)入細(xì)胞從而發(fā)揮作用[7]。葉酸受體是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的膜糖蛋白，其在大多腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，而在正常細(xì)胞表面少量表達(dá)甚至不表達(dá)[8]。葉酸及其衍生物與葉酸受體之間具有高度親和力，兩者可特異性結(jié)合形成復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的主動(dòng)靶向。此外，有研究[9]顯示陽離子脂質(zhì)體除了可包載藥物，還可作為基因遞送載體，具有生產(chǎn)成本低、安全性高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是非常具有發(fā)展前景的遞送基因載體之一。

本研究以葉酸為靶向分子，陽離子脂質(zhì)體為納米載體，制備葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質(zhì)體（FA-BF-CLs），優(yōu)化了其處方及工藝條件，對(duì)其外觀、顯微形態(tài)、粒徑、藥物釋放特性等進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并開展了體外抗肝腫瘤活性的研究，為后續(xù)共遞送蟾毒靈及基因的陽離子脂質(zhì)體的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為探索蟾毒靈肝靶向新型給藥系統(tǒng)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 儀器

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；01A418型超聲細(xì)胞粉碎（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；HT-7800透射電鏡[日立科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、Forma Steri-Cycle i250高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2? 試劑與藥物

蟾毒靈對(duì)照品（批號(hào)：111981-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%，中國食品藥品檢定研究院）；蟾毒靈原料藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%寶雞市辰光生物科技有限公司）；大豆卵磷脂（批號(hào)：SY-SO-20081）、膽固醇（CHO-HP，批號(hào)：C0073）、DOTAP [（2，3-二油?；?丙基）-三甲基氯化銨，批號(hào)：RD-01917]（上海艾韋拓醫(yī)藥科技有限公司）；葉酸（FA-PEG2000-DSPE）（上海梵碩生物有限公司）；乙腈（色譜純，美國斯百全公司）；三氯甲烷、甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3? 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞株（批號(hào)：CL-0103，武漢普諾賽生命科技有限公司）；人正常肝細(xì)胞L-O2細(xì)胞株，上海生博生物醫(yī)藥公司（批號(hào)：SEC1048）。CCK-8試劑盒（批號(hào)：E-CK-A362）（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；胎牛血清（FBS，批號(hào)：164210-50）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：PM150210）、青鏈霉素雙抗（批號(hào)：PB180120）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1? HPLC測(cè)定蟾毒靈含量

2.1.1? 色譜條件? Waters Xselect HSS T3反相色譜柱（4.6 m×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）；檢測(cè)波長296 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2? 蟾毒靈對(duì)照品、FA-BF-CLs供試品及陰性溶液的制備? 精密稱取蟾毒靈對(duì)照品2.00 mg，甲醇定容至10 mL，即得200 μg/mL的蟾毒靈對(duì)照品溶液；精密移取葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質(zhì)體（FA-BF-CLs）樣品1.0 mL，加入甲醇定容至10 mL破乳，靜置過夜，超聲30 min，過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，備用。同樣方法處理空白陽離子脂質(zhì)體（CLs）樣品作為陰性溶液。

2.1.3? 線性關(guān)系考察? 精密移取蟾毒靈對(duì)照品溶液，用甲醇定容，得到系列質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其回歸方程A=17.65C-10.776，r2=0.999 1。結(jié)果表明，蟾毒靈在10～120 μg/mL與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.4? 專屬性考察? 按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣蟾毒靈對(duì)照品溶液、FA-BF-CLs供試品溶液、陰性溶液。結(jié)果顯示，該處方其他輔料成分對(duì)蟾毒靈測(cè)定無干擾，對(duì)照品溶液與供試品溶液的峰形良好，出峰時(shí)間一致，表明該測(cè)定方法專屬性良好。

2.1.5? 精密度試驗(yàn)? 精密吸取“2.1.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算蟾毒靈的RSD值。結(jié)果顯示BF的RSD值為0.29%（n=6），該儀器精密度良好，符合相關(guān)要求。

2.1.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密移取FA-BF-CLs供試品溶液1 mL，用甲醇破乳后，于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算蟾毒靈的RSD值。結(jié)果顯示，蟾毒靈的RSD值為1.75%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7? 重復(fù)性試驗(yàn)? 精密吸取FA-BF-CLs樣品1 mL，共6份，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，并計(jì)算蟾毒靈的平均含量與RSD值。測(cè)定蟾毒靈平均含量為19.86 μg/mL，RSD值為0.22%（n=6），表明該測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.8? 加樣回收率試驗(yàn)? 精密吸取9份空白CLs溶液，每份0.5 mL，分為3組，精密加入適量蟾毒靈對(duì)照品溶液，搖勻，加入甲醇破乳定容，配成低、中、高質(zhì)量濃度10、60、120 μg/mL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率與RSD值。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率分別為100.87%、99.00%、101.88%，RSD值分別為1.31%、0.44%、0.11%。

2.2? 陽離子脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散-超聲法[10]制備FA-BF-CLs，精密稱取處方量大豆卵磷脂、膽固醇、DOTAP[（2，3-二油?；?丙基）-三甲基氯化銨]、葉酸（FA-PEG2000-DSPE）、蟾毒靈于250 mL茄形瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（8∶2）溶解完全后，于50 ℃水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑完全揮干，瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，向其中加入pH 6.4 PBS緩沖液，55 ℃下水合，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下探頭超聲，過0.22 μm微孔濾膜得到FA-BF-CLs。同樣方法制備不加葉酸的陽離子脂質(zhì)體（BF-CLs）、空白陽離子脂質(zhì)體（CLs）樣品。

2.3? 陽離子脂質(zhì)體包封率測(cè)定

經(jīng)過文獻(xiàn)研究和摸索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，透析法在測(cè)定FA-BF-CLs包封率時(shí)具有準(zhǔn)確性高、簡單快捷等優(yōu)勢(shì)[11-12]。精密移取pH 6.4的PBS 100 mL作為透析介質(zhì)，吸取FA-BF-CLs1 mL放入透析袋中，于30 ℃、磁力攪拌（300 r/min）下透析，透析6 h后吸取3 mL透析介質(zhì)，加適量甲醇，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，按“2.1.1”項(xiàng)下進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算包封率。包封率=[（總藥量-游離藥量）/總藥量]×100%

2.4? FA-BF-CLs制備工藝的單因素考察

2.4.1? DOTAP與磷脂質(zhì)量比? 稱取30.00 mg磷脂，為DOTAP與磷脂的質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1，并稱取處方量蟾毒靈2.000 mg、膽固醇7.500 mg、FA-PEG2000-DSPE 2.000 mg溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項(xiàng)下制備FA-BF-CLs，考察粒徑、電位及包封率等變化。結(jié)果顯示，隨著DOTAP與大豆卵磷脂質(zhì)量比增大，電位分別為108.5、112.7、117.5 mV，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)；包封率分別為66.93%、61.61%、58.25%，包封率逐漸減小，因而選用質(zhì)量比為1∶1進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.4.2? 磷脂與藥物質(zhì)量比? 以脂質(zhì)體粒徑、電位、包封率及外觀為指標(biāo)，稱取2.000 mg蟾毒靈，依次設(shè)定磷脂與蟾毒靈的質(zhì)量比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，稱取處方量DOTAP 30.00 mg、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項(xiàng)下制備FA-BF-CLs，結(jié)果表明當(dāng)磷脂與蟾毒靈質(zhì)量比為5∶1、10∶1、15∶1時(shí)，包封率逐漸增大至58.86%；20∶1時(shí)包封率下降至最小值23.9%，隨后包封率逐漸增大。此外，隨著磷脂與蟾毒靈質(zhì)量比逐漸增大，當(dāng)15∶1時(shí)，粒徑最小103.0 nm，隨后粒徑逐漸增大。綜上所述，選用比例15∶1進(jìn)行后面的處方優(yōu)化。

2.4.3? 磷脂與膽固醇質(zhì)量比? 稱取磷脂30.00 mg，依次設(shè)定磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2項(xiàng)下”制備FA-BF-CLs，考察脂質(zhì)體粒徑、電位及包封率的變化。結(jié)果顯示，隨著比例增大，包封率逐漸減小，粒徑分別為141.4、126.1、110.1、100.5、120.6、123.6 nm，綜合考慮采用比例為4∶1來進(jìn)行后續(xù)的處方優(yōu)化。

2.4.4? 超聲時(shí)間? 超聲是脂質(zhì)體整粒的過程，合適的粒徑大小（100～200 nm）可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定重要基礎(chǔ)。以粒徑、電位及包封率的變化為指標(biāo)，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）中，按照“2.2”項(xiàng)下以不同超聲時(shí)間（15、20、25、30 min）制備FA-BF-CLs。結(jié)果顯示超聲時(shí)間為15、20、25 min時(shí)，粒徑逐漸減小，超聲時(shí)間30 min時(shí)，粒徑增大至146.3 nm，且隨著超聲時(shí)間增加，包封率逐漸減小，故采用超聲時(shí)間為15 min。

2.4.5? 水合時(shí)間? 稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，改變水合時(shí)間（30、45、60 min），按照“2.2”項(xiàng)下制備FA-BF-CLs，考察脂質(zhì)體粒徑、電位及包封率的變化。結(jié)果顯示，隨著水合時(shí)間增加，包封率分別為65.91%、66.93%、65.27%，粒徑與電位相差不大，故選用水合時(shí)間45 min。

2.4.6? 水合介質(zhì)? 以粒徑、電位及包封率的變化為指標(biāo)，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項(xiàng)下以水合介質(zhì)（水、pH 6.4 PBS、pH 6.8 PBS、pH 7.0 PBS、pH 7.2 PBS、pH 7.4 PBS）制備FA-BF-CLs。結(jié)果顯示，水合介質(zhì)種類的不同對(duì)粒徑以及電位影響不顯著，包封率先增大后減小，綜合粒徑、電位及包封率等采用pH 6.4 PBS水合介質(zhì)。

2.4.7? FA與磷脂質(zhì)量比? 稱取磷脂30.00 mg，依次設(shè)定FA-PEG2000-DSPE與磷脂質(zhì)量比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，并稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2項(xiàng)下”制備FA-BF-CLs，考察脂質(zhì)體粒徑、電位及包封率的變化。結(jié)果顯示，粒徑及電位相差不大，包封率分別為55.94%、61.47%、62.56%、54.22%，故采用比例為1∶15。

2.5? Box-Behnken響應(yīng)面分析法

2.5.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 根據(jù)文獻(xiàn)及單因素考察結(jié)果，選擇對(duì)FA-BF-CLs評(píng)價(jià)指標(biāo)較顯著的3個(gè)因素作為考察對(duì)象，即磷脂與藥物質(zhì)量比（X₁）、磷脂與膽固醇質(zhì)量比（X₂）、超聲時(shí)間（X₃），以包封率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1—2。

2.5.2? ?模型擬合及方差分析? 采用Design-Expert V12.0 軟件，以包封率（Y）對(duì)X₁、X₂、X₃進(jìn)行二次項(xiàng)式回歸方程擬合?；貧w方程為：Y=68.19-1.72X₁-2.95X₂-4.45X₃+2.73X₁X₂+2.27X₁X₃-3.47X₂2X₃-9.25 X₁²-5.62X₂²-5.70X₃²。方差分析結(jié)果表明，回歸模型P＜0.0001，失擬項(xiàng)水平不顯著（P＞0.05），說明模型擬合良好。此外，磷脂與藥物質(zhì)量比（X₁）、磷脂與膽固醇質(zhì)量比（X₂）、超聲時(shí)間（X₃）對(duì)包封率均具有顯著影響（P＜0.05），各因素之間交互作用不顯著（X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃的P＞0.05），且各因素均不是單純的一次關(guān)系，而是二次關(guān)系。以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的各因素交互作用響應(yīng)圖，見圖1。利用Design-Expert V12.0軟件對(duì)上述所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行綜合分析，保證Y與擬合度均最高的前提下，最終確定了各因素的最佳取值：磷脂與藥物質(zhì)量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質(zhì)量比3.8∶1、超聲時(shí)間13 min。

2.5.3? 驗(yàn)證試驗(yàn)? 按上述優(yōu)化后的處方，采用薄膜-超聲分散法以DOTAP與磷脂比1∶1、磷脂與藥物質(zhì)量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質(zhì)量比3.8∶1及FA與磷脂比1∶1，用三氯甲烷∶甲醇（8∶2）溶解，于50 ℃水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑完全揮干，瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，向其中加入pH 6.4 PBS，55 ℃下水合45 min，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下探頭超聲13 min，過0.22 μm微孔濾膜得到FA-BF-CLs。測(cè)得平均包封率為69.35%（n=3），接近理論包封率69.42%（n=3），實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值較為接近，相對(duì)偏差低于3%，說明Box-Behnken響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果可靠，該工藝優(yōu)化方法具有可行性。

2.6? FA-BF-CLs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.6.1? FA-BF-CLs的外觀及形態(tài)? 在室溫下觀察最佳工藝制備得到的FA-BF-CLs，其外觀澄清透明，呈淡藍(lán)色乳光。取FA-BF-CLs適量，滴到銅網(wǎng)上5 min后，用濾紙吸去上面的多余液體，再向銅網(wǎng)滴上1%的磷鎢酸負(fù)染2 min，吸干多余液體后在透射電子顯微鏡（TEM）下觀察脂質(zhì)體的顯微形態(tài)。FA-BF-CLs呈規(guī)則的球形。詳見圖2。

2.6.2? FA-BF-CLs的粒徑與電位考察? 取FA-BF-CLs適量，用馬爾文粒度測(cè)定分析儀測(cè)定脂質(zhì)體粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位的大小及分布情況，平行測(cè)定3次，得到脂質(zhì)體粒徑為（135.50±1.40） nm，多分散系數(shù)為（0.19±0.03），Zeta電位為（16.23±0.46） mV。

2.6.3? 體外釋放性能考察? 采用透析擴(kuò)散法[13]測(cè)定考察FA-BF-CLs、BF-CLs、蟾毒靈溶液的體外釋放性能。取上述樣品1 mL，分別裝入透析袋中，放置于裝有100 mL釋放介質(zhì)為PBS溶液（pH=7.4）中，置于37 ℃水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行釋放，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h取出1 mL溶出介質(zhì)，加入甲醇溶液破乳，并立即補(bǔ)加相同體積的37 ℃空白溶出介質(zhì)，按照“2.1.1”下測(cè)定BF含量并按照以下公式計(jì)算累積釋放率（Q/%）。以累積釋放率（Q/%）對(duì)時(shí)間/t繪制曲線并進(jìn)行方程擬合，見表3、圖3。結(jié)果顯示游離BF溶液12 h的累積釋放率達(dá)到97.86%±0.04%以上，而FA-BF-CLs和BF-CLs 12 h累積釋放率分別為75.70%±0.12%、82.59%±0.06%；48 h后FA-BF-CLs、BF-CLs的累積釋放率分別為93.94%±0.04%和99.11%±0.03%，達(dá)到最大累積釋放量。相比于游離BF溶液，F(xiàn)A-BF-CLs、BF-CLs兩種陽離子脂質(zhì)體均表現(xiàn)出一定的緩釋特性。此外，根據(jù)表中可知FA-BF-CLs更符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（R2=0.956 9），具有緩釋性能。

2.6.4? 溶血試驗(yàn)? 根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》四部通則“1148溶血與凝聚檢查法”考察FA-BF-CLs、BF-CLs、CLs對(duì)紅細(xì)胞的溶血情況，為后續(xù)靜脈給藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。取潔凈透明試管27只，分為3組，每組9只，編號(hào)，每組中1～6號(hào)管為供試品管，7號(hào)管為陰性對(duì)照管，8號(hào)管為陽性對(duì)照管，9號(hào)管為供試品對(duì)照管。依次加入2％紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、去離子水，混勻后，立即置于（37±0.5） ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育。通過紫外分光光度法測(cè)定溶血率，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示三種制劑溶血率均小于5%，三種制劑均符合2020版《中華人民共和國藥典》對(duì)靜脈注射給藥的要求。

2.6.5? 體外細(xì)胞安全性考察? 陽離子脂質(zhì)體作為最常用的非病毒基因載體之一，具有低免疫原性、組織靶向性等優(yōu)點(diǎn)，但其本身與負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生靜電吸附作用，可能會(huì)引起細(xì)胞膜的毒性[14]，故采用CCK-8法考察含DOTAP的空白陽離子脂質(zhì)體對(duì)L-O2和HepG2細(xì)胞的毒性作用。取對(duì)數(shù)生長期的L-O2、HepG2細(xì)胞以5000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同培養(yǎng)基稀釋的含DOTAP的空白陽離子脂質(zhì)體（濃度為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L），每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加CCK-8溶液，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)各孔的吸光度值（OD），結(jié)果見圖4。不同濃度的空白陽離子脂質(zhì)體作用24 h后，L-O2細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的抑制作用，且經(jīng)SPSS 26.0軟件分析組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。濃度為0～20 μmol/L的空白陽離子脂質(zhì)體作用24 h后，HepG2細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的抑制作用，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)濃度為40 μmol/L時(shí)，相較于其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。綜上所述，空白陽離子脂質(zhì)體在濃度為0～20 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)L-O2及HepG2細(xì)胞無明顯的毒性作用。

2.7? 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用CCK-8法考察FA-BF-CLs、BF-CLs、BF-solution（蟾毒靈藥液組，用0.1%二甲基亞砜溶解）對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以5000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同培養(yǎng)基稀釋的FA-BF-CLs、BF-CLs、BF-solution（蟾毒靈濃度為0.2、0.5、1.0、10、20 μmol/L），每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加CCK-8溶液，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)各孔的吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率及IC50，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，給藥48 h后，與BF-solution相比，F(xiàn)A-BF-CLs、BF-CLs濃度為0.5～20 μmol/L時(shí)HepG2細(xì)胞的存活率均顯著性降低（P<0.05），表明兩種載藥陽離子脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞生長抑制作用明顯優(yōu)于蟾毒靈藥液組，且經(jīng)過葉酸修飾的載藥陽離子脂質(zhì)體的HepG2細(xì)胞活性明顯低于未修飾的載藥陽離子脂質(zhì)體。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)，蟾毒靈在pH 5.8環(huán)境中油水分配系數(shù)logP值為3.36，屬于疏水性藥物[15]。薄膜-超聲分散法是脂溶性藥物制備脂質(zhì)體的常用方法，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用此方法制備FA-BF-CLs。單因素考察結(jié)果表明，隨著DOTAP與大豆卵磷脂質(zhì)量比增大，電位逐漸升高，參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]，并綜合考慮DOTAP的價(jià)格，采用比例為1∶1進(jìn)行制備。當(dāng)大豆磷脂與藥物質(zhì)量比為15∶1和30∶1時(shí)，兩者的粒徑、包封率等結(jié)果相差不大，考慮大豆磷脂組成復(fù)雜，加入過多可能影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，故而選用大豆磷脂與藥物質(zhì)量比為15∶1。膽固醇可防止磷脂氧化，對(duì)提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性起到重要作用[17]，結(jié)合單因素考察的結(jié)果選用大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4∶1。薄膜-超聲分散法制備得到的陽離子脂質(zhì)體粒徑較大，且分布不均勻[18]，在制備過程中探頭超聲起著至關(guān)重要的作用，其目的是使陽離子脂質(zhì)體分散均勻，增加其穩(wěn)定性，但因探頭超聲過程中會(huì)釋放一定的能量造成局部產(chǎn)熱影響脂質(zhì)體的形成，故選用超聲時(shí)間為15 min。

包封率是脂質(zhì)體重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，常用的測(cè)定方法有透析法、離心法、葡聚糖凝膠柱層析法、超濾離心法等。預(yù)試驗(yàn)中比較了透析法、離心法以及葡聚糖凝膠柱層析法，但離心法和葡聚糖凝膠柱法均不能使包載藥物的脂質(zhì)體與游離藥物分離，故對(duì)透析法進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示透析法的加樣回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，且RSD值小于3%，故選用此法測(cè)定陽離子脂質(zhì)體的包封率。體外釋放實(shí)驗(yàn)中，兩種陽離子脂質(zhì)體均體現(xiàn)了藥物在模擬人體液中緩慢釋放的性能，達(dá)到藥物緩釋的效果。溶血試驗(yàn)顯示空白陽離子脂質(zhì)體、BF-CLs、FA-BF-CLs均沒有出現(xiàn)棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，無溶血現(xiàn)象，為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)注射給藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究顯示[19]陽離子脂質(zhì)體與細(xì)胞膜靜電作用可能會(huì)顯示出細(xì)胞毒性，因此對(duì)其進(jìn)行體外細(xì)胞安全性考察，結(jié)果顯示空白陽離子脂質(zhì)體濃度為0～20 μmol/L范圍內(nèi)，L-O2、HepG2細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯毒性作用，該載體安全無毒，為后續(xù)與基因結(jié)合時(shí)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。體外細(xì)胞毒性結(jié)果顯示兩種載藥陽離子脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞生長抑制作用明顯優(yōu)于蟾毒靈藥液組，表明陽離子脂質(zhì)體能更精準(zhǔn)靶向HepG2細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；經(jīng)過葉酸修飾的載藥陽離子脂質(zhì)體的HepG2細(xì)胞活性明顯低于未修飾的載藥陽離子脂質(zhì)體，可能是 FA-BF-CLs攜帶的葉酸與HepG2細(xì)胞膜上的葉酸受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)該載體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而將藥物釋放。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)制備葉酸修飾共遞送蟾毒靈和基因陽離子脂質(zhì)體奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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