彭歡 黃宇希 黎睿君

摘 要：2021年11月，遼寧大連某養(yǎng)殖場紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）出現(xiàn)死亡。通過對(duì)患病紅鰭東方鲀病灶部位進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌革蘭氏染色、以及細(xì)菌16S rDNA 序列分析，從患病紅鰭東方鲀中共分離出3株優(yōu)勢菌且均為弧菌，分別為哈維弧菌（Vibrio harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、費(fèi)氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。藥敏檢測結(jié)果表明，費(fèi)氏弧菌對(duì)復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素3種抗生素敏感；大菱鲆源弧菌僅對(duì)恩諾沙星敏感；哈維弧菌對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星5種抗生素敏感。3種優(yōu)勢菌對(duì)16種抗生素的藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種優(yōu)勢菌均為多重耐藥菌。結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究，推薦聯(lián)合多西環(huán)素與山蒼子植物精油對(duì)紅鰭東方鲀體表潰爛病進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞：紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）；體表潰爛；優(yōu)勢菌；分離鑒定

2021年11月，大連地區(qū)某養(yǎng)殖場發(fā)生紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）病害并有大量死亡，主要癥狀為患病魚體表明顯潰爛，形成圓斑，肌肉暴露。病魚解剖后可見肝臟出血，腸脹氣。筆者對(duì)患皮膚潰爛病的紅鰭東方鲀進(jìn)行了優(yōu)勢菌分離，并通過形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、16S rDNA 序列分析對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)通過分離菌株的藥敏檢測結(jié)果為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年11月，遼寧省大連市某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀病魚10尾被送至大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測，送檢魚體長約為15 cm左右。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病魚解剖與優(yōu)勢菌分離 將患病紅鰭東方鲀體表用生理鹽水沖洗3遍后，放置于已消毒的托盤中，無菌條件下解剖魚體。分別在病魚體表潰爛處、腸道內(nèi)容物、肝臟、鰓、脾臟、腹腔黏液中沾取樣本，于NA固體培養(yǎng)基平板劃線接種，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后在體表潰爛處、腸道內(nèi)容物、鰓、腹腔黏液共分離到4株優(yōu)勢菌，將分離菌落分別在NA固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)一步純化，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 將純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，置于光學(xué)顯微鏡（CX21FS1，奧林巴斯）下觀察。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，使用16s rDNA通用引物，正向引物：5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物：5- TACGGCTACCTTGT TACGACTT-3［1］，擴(kuò)增16 srDNA基因。

PCR 反應(yīng)體系25 μL：DNA 模板1 μL，正向、反向引物各1 μL，rTaq DNA Polymerase 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL，無菌純水18.25 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72? ℃ 延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72? ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物，并將 PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，將測得的16S rDNA 序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過 Blast 檢索比對(duì)分析。

1.2.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用常規(guī) Kriby‐Bauer 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株菌液涂布于NA平板上，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用游標(biāo)卡尺測量各種藥物的抑菌圈直徑，以判定菌株對(duì)抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床解剖結(jié)果

患病紅鰭東方鲀體表明顯潰爛，形成圓斑，肌肉暴露，鰭條和唇部出現(xiàn)潰爛。解剖后可見肝臟出血，腸脹氣，腸炎較嚴(yán)重（見封三圖1）。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.2.1 革蘭氏染色結(jié)果 革蘭氏染色結(jié)果表明從體表潰爛處分離的優(yōu)勢菌1號(hào)、鰓分離的優(yōu)勢菌2號(hào)、腸道內(nèi)容物分離的優(yōu)勢菌3號(hào)、腹腔黏液分離的優(yōu)勢菌4號(hào)均為革蘭氏陰性菌。菌體為桿狀，彎曲呈弧狀（見封三圖2）。

2.2.2 16S rDNA分離鑒定結(jié)果 將病魚體表、鰓、腸、腹部中分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化及擴(kuò)培后，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。以細(xì)菌基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列，電泳檢測結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約1 500 bp處有明顯的條帶（圖3）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過序列測定，并經(jīng)NCBI基因序列比對(duì)結(jié)果表明，體表和鰓潰爛處分離的優(yōu)勢菌1號(hào)、2號(hào)均為哈維弧菌（Vibrio harveyi），腸道內(nèi)容物分離的優(yōu)勢菌3號(hào)為大菱鲆源弧菌（Vibrio scophthalmi），腹腔黏液分離的優(yōu)勢菌4號(hào)為費(fèi)氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。

2.3 優(yōu)勢細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)

16種抗菌類藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種優(yōu)勢菌均為多重耐藥菌。費(fèi)氏弧菌對(duì)復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素3種抗菌藥敏感，但對(duì)卡那霉素、青霉素、環(huán)丙沙星等9種抗生素耐藥；大菱鲆源弧菌對(duì)慶大霉素敏感，但對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、阿莫西林等12種抗生素耐藥；哈維弧菌對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、四環(huán)素、恩諾沙星6種抗菌藥敏感，但對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、頭孢他啶等10種抗生素耐藥，詳見表1。

3 討論

本研究從患病紅鰭東方鲀中共分離出3株優(yōu)勢菌且均為弧菌，分別為哈維弧菌（V. harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、費(fèi)氏弧菌（A. fischeri），推測紅鰭東方鲀體表潰爛病由3種弧菌混合感染所引起。哈維弧菌是海洋微生物區(qū)系中的一員，同時(shí)也是海洋動(dòng)物的致病菌之一。在適宜條件下，哈維弧菌可以大量繁殖，通過傷口和消化道感染，導(dǎo)致動(dòng)物傷口肌肉潰爛化膿和內(nèi)臟嚴(yán)重病變，引起動(dòng)物死亡［2-4］。本實(shí)驗(yàn)從紅鰭東方鲀的體表潰爛處和鰓均分離到哈維弧菌，且患病魚體表潰爛形成圓斑，表明了哈維弧菌對(duì)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀同樣可以引起皮膚潰爛癥狀，這與目前哈維弧菌的致病機(jī)制研究一致。本研究中從患有腸脹氣和腸炎的紅鰭東方鲀腸道內(nèi)容物里分離出大菱鲆源弧菌，大菱鲆源弧菌最早由西班牙學(xué)者自養(yǎng)殖大菱鲆仔魚腸道中分離并鑒定為弧菌屬細(xì)菌的一個(gè)新種，而之前的研究表明，可引發(fā)腹水癥、腸炎病等［5-6］。費(fèi)氏弧菌是一種生長在海洋中的革蘭氏陰性菌，是某些海洋魚類的致病菌［7］，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌群密度達(dá)到一定閾值時(shí)費(fèi)氏弧菌會(huì)產(chǎn)生集體發(fā)光現(xiàn)象，任何對(duì)細(xì)胞代謝機(jī)制的抑制作用都會(huì)導(dǎo)致其發(fā)光的減少，所以費(fèi)氏弧菌目前被普遍作為環(huán)境測試指標(biāo)［8］。因此，我們推測3種弧菌在紅鰭東方鲀體表潰爛病發(fā)病過程中均發(fā)揮了重要作用，關(guān)于3種優(yōu)勢菌回歸感染實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步開展。

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，費(fèi)氏弧菌對(duì)復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素3種抗菌藥敏感，對(duì)氟苯尼考最敏感，抑菌圈直徑為26 mm；哈維弧菌對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、四環(huán)素、恩諾沙星6種抗菌藥敏感，對(duì)環(huán)丙沙星最敏感，抑菌圈直徑為26 mm；大菱鲆源弧菌僅對(duì)慶大霉素敏感，抑菌圈直徑為19 mm，可以看出大菱鲆源弧菌在3種優(yōu)勢菌中表現(xiàn)出最強(qiáng)的耐藥性，我們推測大菱鲆源弧菌因分離自腸道，紅鰭東方鲀養(yǎng)殖周期較長，這與養(yǎng)殖過程中抗生素的頻繁使用，造成分離的腸道細(xì)菌具有非常強(qiáng)的耐藥性。為了進(jìn)一步控制該疾病，我們推薦了聯(lián)合植物精油進(jìn)行該病的防治，目前的研究表明富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛等成分的植物精油能夠很好地抑制大菱鲆弧菌［9］。關(guān)于大菱鲆源弧菌的耐藥機(jī)制值得進(jìn)一步研究，有研究表明大菱鲆源弧菌臨床分離株均能產(chǎn)生生物被膜［1］，這可能也與其耐藥性有關(guān)。為此，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦使用抗菌譜廣、抗全身性感染和安全性較高的鹽酸多西環(huán)素粉（水產(chǎn)用）藥物進(jìn)行拌料投喂來治療紅鰭東方鲀體表潰爛病。具體治療方案為，每1 kg魚體重投喂20 mg鹽酸多西環(huán)素粉，每日1次，同時(shí)日糧中添加0.1%山蒼子精油，連續(xù)用藥5 d。值得一提的是，長期以來，由于基層從業(yè)人員對(duì)于抗生素的使用缺乏正確認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致大量的濫用和誤用抗生素。建議生產(chǎn)部門在緊急使用抗生素前，針對(duì)優(yōu)勢病原開展藥敏實(shí)驗(yàn)，根據(jù)藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)用藥，同時(shí)聯(lián)合使用中草藥治療相關(guān)疾病。

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Isolation，identification and treatment of dominant bacteria of Takifugu rubripes skin ulceration disease

PENG Huan，HUANG Yuxi，LI Ruijun

（ College of Fisheries and Life Science，Liaoning Key Laboratory of Marine Animal Immunology，

Dalian Key Laboratory of Marine Animal Disease Control and Prevention，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：In November 2021，Takifugu rubripes emerged skin ulceration disease in an aquaculture farm located in Dalian，Liaoning Province. After dissection of diseased T. rubripes，hemorrhaging liver ，flatulence intestinal and severe enteritis were observed. By bacterial isolation and culture，Gram staining，and bacterial 16S rDNA sequence analysis，three dominant strains of Vibrio were isolated and identified from infected T. rubripes. They were respectively Vibrio harveyi，Vibrio scophthalmi and Aliivibrio fischeri. The results of drug sensitivity test showed that A. fischeri was sensitive to three antibiotics， including compound sulfamethoxazole，florfenicol and doxycycline，respectively. V. scophthalmi could only be inhibited by enrofloxacin.In addition，ciprofloxacin，cotrimoxazole，florfenicol，doxycycline and enrofloxacin had antibacterial activity against V. harveyi. In the experiment of 16 antibiotics sensitivity test，the three dominant bacteria were all multi-drug resistant bacteria. Based on the results of drug sensitivity experiment and related studies，it is recommended to combine usage with doxycycline and Litsea cubeba plant essential oil to prevent and control the skin ulceration disease of T. rubripes.

Key words：Takifugu rubripes; body surface ulceration; dominant bacteria; isolation and identification

（收稿日期：2022-07-11）