馬瑞欣 張鵬燕, 李雪萍 王曉靜 周凡 宋子瑾

摘 要：通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)比較了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物檢測方法GB 31656.13-2021和農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006公告的差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：GB 31656.13-2021中衍生時用0.5 mol/L鹽酸，蝦蟹樣品的AHD有干擾，造成AHD回收率偏高；農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006方法衍生時用0.2 mol/L鹽酸，檢測結(jié)果無干擾，四種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物回收率均在正常范圍，但對于蝦蟹類產(chǎn)品需在加入0.2 mol/L鹽酸的基礎(chǔ)上再加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 值1～2才能保證好的衍生效果。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品；硝基呋喃類代謝物；檢測方法

硝基呋喃類藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物，主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮。硝基呋喃類藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)代謝速度快，呋喃唑酮主要代謝物為3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮主要代謝物為5-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林主要代謝物為氨基脲（SEM）、呋喃妥因主要代謝物為1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）。由于硝基呋喃類代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留時間長，成為檢測硝基呋喃類藥物殘留的標(biāo)志物，檢測方法主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。AOZ、AMOZ、SEM和AHD四種代謝產(chǎn)物的分子量小，LC-MS/MS產(chǎn)生的二級離子太少，因此液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測時需用2-硝基苯甲醛衍生。

2006年12月19日，農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006 《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》實(shí)施［1］，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)其存在不足之處：1.試劑0.2 mol/L 鹽酸溶液的配制方法錯誤；2.對于甲殼類水產(chǎn)品衍生時0.2 mol/L 鹽酸酸度不夠，需再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值到1～2之間才能保證好的衍生效果；3.最后定容溶液渾濁，不易通過濾膜。4.由于內(nèi)源性物質(zhì)干擾，青蝦SEM易檢出、蝦和蟹等苗種帶殼處理時SEM也易檢出。2022年2月1日，GB 31656.13-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》實(shí)施［2］。GB 31656.13-2021表述更規(guī)范合理，操作步驟簡化，可操作性更強(qiáng)。目前兩種方法均現(xiàn)行有效。

為了更好地應(yīng)用上述兩種檢測方法，本文對這兩種檢測方法進(jìn)行了內(nèi)容比較和實(shí)驗(yàn)比對。

1 主要區(qū)別

兩種檢測方法在適用范圍、實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和方法學(xué)指標(biāo)上有不同，詳見表1。

2 實(shí)驗(yàn)比對

采用草魚、南美白對蝦、梭子蟹和海參四個樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，這四個樣品按照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性。本次實(shí)驗(yàn)加標(biāo)水平為1.0、2.0 μg/kg及10 μg/kg三個梯度，所有樣品和加標(biāo)梯度均進(jìn)行三個平行樣品實(shí)驗(yàn)，上機(jī)分析的儀器條件完全相同。

根據(jù)使用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006的經(jīng)驗(yàn)，本次使用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006時做了兩點(diǎn)改變：一是由于南美白對蝦和梭子蟹加入0.2 mol/L鹽酸衍生后衍生產(chǎn)物信號低，故需要在加入0.2 mol/L鹽酸基礎(chǔ)上再滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到1～2后，加入2-硝基苯甲醛進(jìn)行衍生；二是定容溶液由5%甲醇溶液改為超純水。其他操作完全按照783號公告-1-2006進(jìn)行。

使用GB 31656.13-2021時完全按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及改進(jìn)建議

3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線均配制了0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L 共6個點(diǎn)，分別按照兩個方法進(jìn)行衍生和提取凈化，線性擬合的結(jié)果見表2。標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

從線性看，雖然衍生時酸的強(qiáng)度以及提取凈化發(fā)生了變化，但線性并無明顯變化，r均大于0.995，滿足檢測需求。

從譜圖中峰的強(qiáng)度分析，四種代謝產(chǎn)物衍生時受酸度的影響變化為：AMOZ＞AOZ＞AHD＞SEM；對應(yīng)內(nèi)標(biāo)變化與其一致。GB 31656.13 -2021酸度增強(qiáng)，有利于AMOZ和AOZ及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的衍生， AHD及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)影響不太明顯，SEM及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)基本不受影響。

3.2 回收率及精密度

兩種方法的回收率和精密度見表2。

由表2可以看出，采用GB 31656.13 -2021方法，除南美白對蝦和梭子蟹的AHD回收率均偏高，其它均滿足要求；而農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006方法的所有回收率均在正常范圍內(nèi)。

為進(jìn)一步查找原因，對三個南美白對蝦樣品和一個梭子蟹樣品分別按兩種方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)按照GB 31656.13 -2021方法檢測時，這四個樣品均可出現(xiàn)AHD干擾，見圖2第一行譜圖中保留時間為3.21 min的峰；而按照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006方法檢測時AHD均無干擾，見圖2第二行譜圖。分析原因?yàn)椋篏B 31656.13 -2021衍生時加入0.5 mol/L 鹽酸，溶液pH＜1；農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006衍生時加入0.2 mol/L鹽酸溶液并調(diào)節(jié)pH 值到1～2。說明衍生酸度增大至0.5 mol/L時對AHD產(chǎn)生了干擾。

由于四種衍生產(chǎn)物極易溶于水，實(shí)驗(yàn)最后定容溶液用水，經(jīng)證實(shí)對離子的質(zhì)量色譜圖強(qiáng)度和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無影響。

3.3 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)建議

鑒于兩種檢測方法的比對結(jié)果，對兩種檢測方法的衍生和提取凈化步驟取長補(bǔ)短，優(yōu)化如下：

取試料2 g（精確至±0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入混合內(nèi)標(biāo)工作液100 μL（內(nèi)標(biāo)的量可根據(jù)儀器靈敏度進(jìn)行改變），渦旋混合1 min，加入0.2 mol/L鹽酸溶液5 mL（甲殼類需要再滴入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值到1～2）、0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混合1 min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃避光振蕩16 h。

取出離心管冷卻至室溫，加入磷酸氫二鉀溶液3～5 mL調(diào)pH值到7.0～7.5，加入乙酸乙酯8 mL，渦旋振蕩30 s，6 000 r/min離心5 min，取上清液至10 mL離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.0 mL水溶解殘留物，再將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，過0.22 μm濾膜供LC-MS/MS分析。優(yōu)化后的方法回收率和精密度均滿足檢測要求，見表3。

4 結(jié)論

硝基呋喃類代謝物用2-硝基苯甲醛衍生時用0.5 mol/L鹽酸對蝦蟹等甲殼類樣品AHD有干擾。建議仍采用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006方法的0.2 mol/L鹽酸進(jìn)行衍生，但對蝦蟹等甲殼類注意調(diào)節(jié)其衍生前溶液pH值在1～2之間，這樣既保證了衍生產(chǎn)物的信號強(qiáng)度，也消除了AHD的干擾。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006[S].北京，中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：1-8.

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB 31656.13-2021[S].北京，中國農(nóng)業(yè)出版社，2022：1-6.

（收稿日期：2022-05-07）