張瓊　汪琪琦　王仁昊　肖文巖　蔣藝銘　李勝利

摘 要：主要介紹安徽大學專門為國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃設計的“多光子吸收四苯乙烯三吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”實驗教學實施結果與探討。以四苯乙烯三聯(lián)吡啶Fe（II）配合物的合成為基礎，圍繞創(chuàng)新和創(chuàng)業(yè)兩大目標，實現(xiàn)配合物多光子吸收性質創(chuàng)新，探索配合物的ROS性能，評估化學動力學治療效果。全文以實驗為依據(jù)，對結果進行分析、反思、判斷。結合實驗結果，探索配合物在癌癥治療方面的實際應用，使其具有創(chuàng)業(yè)潛力。

關鍵詞：無機及分析化學；鐵配合物；多光子吸收；ROS檢測

中圖分類號：G642.1；O614.7? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）02-0098-04

在我國當前的教學改革中，如何把創(chuàng)新發(fā)展的思想融入大學的日常教學，培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的大學生是核心問題。綜合化學實驗可以把基礎化學與基礎實驗技能有機地結合起來，使學科的研究前沿與其融為一體，能充分體現(xiàn)學科交叉發(fā)展，培養(yǎng)學生的創(chuàng)造性[1，2]。

在無機及分析化學教學中，d區(qū)元素相關內容通常在學期中旬之后講解，內容多，學時少[3]。在本科階段無機及分析化學實驗課程中，有關d區(qū)鐵錳配合物的實驗更是少之又少。在學生完成了無機及分析化學理論及實驗課程的學習后，我們專門安排了大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃，即組織和引導學生從配合物制備入手，圍繞配合物的合成及性質，以配合物詳細的制備流程和光譜性質為基礎，實驗結果為依據(jù)，鞏固學生的理論知識。結合長期積累的實驗與教學工作經驗，專門為國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃量身定制“多光子吸收四苯乙烯α三聯(lián)吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”實驗，系統(tǒng)研究構效關系，探索配合物在生物醫(yī)藥方面的實際應用，使其具有創(chuàng)業(yè)潛力。

三聯(lián)吡啶（tpy）是N^N^N型三齒配體，在配位化學領域中占據(jù)重要的地位[4，5]。三聯(lián)吡啶和其衍生物具有三個N-配位點，三聯(lián)吡啶衍生物及其組裝的配合物材料可以按照用途的要求，通過制備新配體和選擇合適的金屬中心離子，以此調整控制配合物的功能。因此，在催化、光電功能材料、生物傳感、醫(yī)療診斷等領域有著廣泛的應用價值[6，7]。

該創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃以多光子吸收過渡金屬配合物的生物成像應用為導向，設計合成多光子吸收有機配體，通過引入四苯乙烯基團來增強配體的生物相容性，由于四苯乙烯是經典的聚集誘導發(fā)光特征配體[8]，配合物大共軛體系可促進產生非線性光學活性；同時鐵配合物中Fe2+可與H2O2發(fā)生芬頓反應，產生羥基自由基（·OH），這也使得其具有化學動力學治療的潛力。

1 實驗部分

1.1 實驗目的

通過科研前沿成果，了解配合物基本概念及鐵系配合物最新研究進展，掌握鐵系配合物的合成方法及光物理性質，學會使用大型儀器進行光物理性質測試及分析測試數(shù)據(jù)。

1.2 試劑、儀器

藥品和試劑：配體FA，六氟磷酸鉀，無水乙腈，二氯化鐵，溶劑均為分析純，并按照標準方法進行干燥和純化后使用。

儀器：手持LED燈（美國GE公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet FT-IR NEXUS 870 spectrometer）、紫外可見分光光度計（UV-265）、質譜儀（Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer）、全自動協(xié)調飛秒激光器（Ti：95藍寶石，80MHz，140fs，Chameleon Ⅱ 680nm-900nm）。

1.3 雙光子吸收截面

論文通過開孔Z-掃描對配合物FA-Fe-FA的雙光子吸收性質進行探索，通過Z掃描測試可以直接得到入射功率和出射功率，并進一步得到測試樣品的透過率T（z），基于空間和時間高斯脈沖，歸一化的能量透射率T（z）由以下方程得到：

λ是入射光波長，ω0為入射光束腰的半徑，α0為樣品在工作激光下的線性吸收系數(shù)，Z為樣品距離焦點的位移，是曲線的橫坐標，I0為焦點處的入射光強度，Leff是有效樣品厚度，雙光子吸收截面：

式中的h為普朗克常數(shù)，γ為入射光的頻率，NA=6.02×1023為阿伏伽德羅常數(shù)，d為樣品濃度。

通過此公式計算得出雙光子吸收系數(shù)β以及雙光子吸收截面σ的值。

1.4 合成與表征

FA的合成步驟：在250mL圓底燒瓶，依次加入3.6g（0.03mol）2-乙?；拎?，少量無水乙醇，以及2.8gKOH水溶液，常溫攪拌15min，逐滴加入30mL氨水，回流3h，冷卻后抽濾得到2.0g的黃色固體粉末，產率84%。ESI-MS：calculated： for [M+H]+;564.24，found：564.24

FA-Fe-FA合成路線如下：

配合物FA-Fe-FA的合成：將配體FA（0.563g，0.001mol）加入100mL圓底燒瓶中，再向圓底燒瓶中加入適量的無水乙腈（懸浮液）在80℃條件下逐滴滴加二氯化鐵（0.08g，0.0005mol）的無水乙腈（10mL）溶液，充分反應2小時后，向其中加入過量的六氟磷酸鉀，冷卻至室溫，過濾，干燥、得紫色固體0.48g，產率：82%。ESI-MS M/2： 591.42 calcd for： M/2： 591.42，found： 591.42 FT-IR（KBr，cm-1）： 3906（m），3857（m），3762（m），3654（m），3565（m），3050（m），2371（m），1660（m），1564（m），1392（s），1164（m），1075（m），1017（m），846（s），751（s），707（s），548（m）。

由于金屬鐵具有磁性，無法得出配合物完整的13C和1H譜。對于含磁性金屬中心的配合物，通常采用質譜，紅外來確定物質結構。例如質譜：通過ChemDraw模擬可得FA-Fe-FA的分子量為591.42 （M/2），ESI-MS的結果為591.42（M/2）與ChemDraw結果一致。

2 配合物的光物理性質研究

2.1 紫外-可見吸收光譜

如圖3紫外-可見吸光光譜所示，配合物FA-Fe-FA具有兩個比較明顯的特征吸收峰，在300nm左右存在一個強吸收峰，在580nm存在一個弱吸收峰，300nm處的中等強度吸收峰為配體（FA）的π-π*躍遷。配合物FA-Fe-FA在580nm處的吸收峰歸則因于LMCT[π*（FA）-dπ（Fe）]特征吸收峰。

2.2 配合物的雙光子吸收性質

經過前面的教學，我們發(fā)現(xiàn)學生對“配合物的應用”章節(jié)極為感興趣，故在實驗教學最后，增加了配合物多光子吸收性質研究，通過引導學生查閱文獻，以翻轉課堂形式進行配合物實際應用趣味教學，調動學生的積極性參與到教學過程中。什么是雙光子吸收？雙光子吸收是指材料分子在強脈沖激光激發(fā)下同時吸收兩個以上光子達到虛擬中間態(tài)（virtue state）的過程[9，10]。與單光子吸收相比，雙光子吸收（2PA）激發(fā)光的波長近似等于單光子激發(fā)的兩倍。而這種近紅外波段的長波激發(fā)光具有穿透深度深、光穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[11-14]。

在進行配合物的雙光子吸收性質教學時，需要介紹進行雙光子吸收性質測試的實驗方法，包括熒光對比法和Z-掃描法。熒光對比法通常針對具有熒光的分子，而不具有熒光性質的分子使用Z掃描方法來測試其雙光子吸收性質[15-17]。

由圖4及公式計算可知，配合物FA-Fe-FA在900nm激發(fā)波長下具有良好的雙光子吸收信號，雙光子吸收系數(shù)β為0.3496cm/GM；雙光子吸收截面為4774.5GM，表明這一配合物具有優(yōu)良的雙光子吸收活性，可進一步應用于生物探索。

3 生物應用探索

大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練突出創(chuàng)新和創(chuàng)業(yè)兩大目標，為了研究該實驗所獲得產物的應用價值，實現(xiàn)創(chuàng)業(yè)目標，我們將FA-Fe-FA應用于生物體系，研究配合物ROS能力，評估其是否存在進行腫瘤診療的潛力。在腫瘤細胞中，過氧化氫（H2O2）的濃度較高，而在鐵配合物中的二價鐵可與H2O2進行芬頓反應，生成羥基自由基（·OH），由此提高細胞內活性氧（ROS）的含量[18-20]。最終導致Ferroptosis（鐵死亡），誘導癌細胞凋亡。

通過羥基自由基指示劑（對苯二甲酸）對羥基自由基（·OH）進行測定，向2mL（10-4mol/L）FA-Fe-FA溶液中加入20μL H2O2的溶液，經過5min的孵育，然后將1mL（10-3mol/L）對苯二甲酸添加到該溶液中，對425nm處的熒光發(fā)射峰（對苯二甲酸的特征發(fā)射峰）進行檢測，如圖5a所示，對苯二甲酸的特征發(fā)射峰熒光強度隨著時間不斷增強。如圖5b，緊接著檢測不同的量的H2O2的溶液中對苯二甲酸的熒光，可以看出H2O2的量越高，其熒光強度也越高。

以上測試結果表明FA-Fe-FA中的Fe2+與H2O2發(fā)生芬頓反應生成羥基自由基（·OH），增加了細胞內活性氧（ROS）的水平。

在體外測試的結果支持下，進行了細胞成像實驗，進一步研究鐵死亡的性能。如圖6所示，利用FA-Fe-FA對HeLa細胞進行連續(xù)10分鐘的孵育，在細胞膜周圍出現(xiàn)FITC的熒光信號和PI信號。根據(jù)實驗結果，在孵育10min左右時，細胞開始出現(xiàn)凋亡。孵育時間越長，羥基自由基產生的量越多，使細胞膜的完整性被損害。PI信號明顯。孵育期為30min時，通過兩種商染染色及細胞形態(tài)進行分析，HeLa細胞的凋亡率接近百分之百。綜上而言，F(xiàn)A-Fe-FA有產生羥基自由基的能力，提升細胞內活性氧（ROS）的含量，最后引起鐵死亡，在腫瘤診斷和治療方面都有很大的潛力。

4 結論

結合最新學術進展，為國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃設計了一個綜合化學實驗，以四苯乙烯三聯(lián)吡啶為主配體，設計合成配合物FA-Fe-FA，發(fā)現(xiàn)FA-Fe-FA具有較大的雙光子吸收截面。研究了鐵配合物產生·OH能力，配合物中Fe2+可與H2O2進行芬頓反應，生成羥基自由基（·OH），提高細胞內活性氧（ROS）含量，促進癌細胞凋亡，達到化學動力學治療效果。本實驗體現(xiàn)了對無機化學及分析化學中涉及d區(qū)元素部分基礎知識與實驗操作的綜合性要求，圍繞創(chuàng)新與創(chuàng)業(yè)兩大目標，實驗步驟設計合理，實驗結果明確，理論與實踐相結合，使學生產生濃厚的學習興趣，實驗包含有大型儀器操作和數(shù)據(jù)分析等，提高了學生綜合運用知識分析實際問題的能力，同時也為本科畢業(yè)設計奠定了基礎。

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收稿日期：2022-10-07

通訊作者：李勝利（1968-），男，漢族，安徽巢湖人，博士，教授。研究方向：非線性光學材料。

基金項目：國家自然科學基金（21871003）；安徽省自然科學基金（2008085QB52）；安徽大學質量工程（2022）項目