蔡世娟 蘇曉靜 秦壘 曹天光

摘要 利用12C6+重離子對(duì)自交系黃瓜種子（18C-1）進(jìn)行60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy劑量輻射，通過(guò)對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率、植株性狀和功能、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)以及SSR分子標(biāo)記分析，探究重離子輻射黃瓜M1代種子生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果表明，從輻射種子活力和成苗率上分析，輻射對(duì)種子活力和成苗率有顯著地抑制作用，且隨輻射劑量增加呈現(xiàn)先降后升變化趨勢(shì)；從植株性狀和功能上分析，高劑量輻射（100 Gy和120 Gy）植株受損嚴(yán)重不利于后代有效變異篩選；從株型的差異顯著性和單株聚類(lèi)圖上分析，輻射對(duì)幼苗株型影響效應(yīng)顯著，且輻射劑量越接近影響效應(yīng)越相似；從果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)上分析，60 Gy組篩選到果實(shí)性狀優(yōu)良、品質(zhì)高的正向突變株；從SSR分子標(biāo)記上分析，重離子輻射能誘發(fā)黃瓜基因組變異，其中120 Gy組尤為突出，60 Gy次之。綜上所述，12C6+輻射對(duì)黃瓜M1代生物學(xué)性狀和基因組DNA都產(chǎn)生顯著影響，確定60 Gy為最適誘變劑量并篩選出正向突變株。本研究將為后續(xù)黃瓜誘變育種研究以及種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

關(guān) 鍵 詞 黃瓜；重離子輻射；種子萌發(fā)指標(biāo)；田間性狀；SSR分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào) Q947.9? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A

Study on mutagenic effect of 12C6+ radiation on M1 Generation of Cucumber

CAI Shijuan， SU Xiaojing， QIN Lei， CAO Tianguang

（School of Science， Hebei University of Technology， Tianjin 300401 China）

Abstract Using 12C6+ heavy ion to radiate the seeds of inbred Cucumber （18C-1） in 60 Gy， 80 Gy， 100 Gy and 120 Gy doses， the biological effects of heavy ion radiation on M1 Generation of Cucumber were studied by analyzing the seed germination potential， germination rate， germination index， seedling rate， plant character and function， fruit yield and quality and SSR molecular markers. The results showed that， from the perspective of radiation seed vigor and seedling rate， radiation significantly inhibited the seed vigor and seedling rate， and showed a trend of decreasing first and then increasing with the increase of radiation dose; from the analysis of plant character and function， high dose radiation （100 Gy and 120 Gy） seriously damaged the plants， which was not conducive to the effective variation screening of offspring; from the analysis of plant type difference significance and single plant cluster diagram， the results showed that the effect of radiation on the plant type of seedlings was significant， and the closer the radiation dose was， the much more similar the effect was; from the analysis of fruit yield and quality， the positive mutants with good fruit characters and high quality were screened from the 60 Gy group; from the SSR molecular marker analysis， the heavy ion radiation could induce Cucumber genome variation， especially in the 120 Gy group， followed by the 60 Gy group. In conclusion， 12C6+ radiation had a significant impact on the biological characteristics and genomic DNA of M1 Generation of Cucumber. 60 Gy was determined as the optimal mutagenic dose and the positive mutant was screened out. This study will lay a foundation for the further research of Cucumber mutation breeding and germplasm resource innovation.

Key words Cucumber; heavy ion radiation; seed germination index; field character; SSR molecular marker

0 引言

黃瓜屬葫蘆科黃瓜屬草本植物，世界十大重要蔬菜作物之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，由于自然侵蝕和長(zhǎng)期定向改良，黃瓜栽培品種的遺傳背景日漸狹窄，其遺傳多樣性遠(yuǎn)低于同屬甜瓜，對(duì)良種選育工作造成一定阻礙。輻射誘變育種具有突變頻率高、突變頻譜寬、育種周期短、打破不良性狀連鎖等優(yōu)勢(shì)[1]，其中重離子誘變技術(shù)因其獨(dú)特的物理學(xué)、生物學(xué)特性成為誘變育種研究中重要手段，在基因功能研究、優(yōu)質(zhì)材料選育及誘變生物學(xué)效應(yīng)上均取得顯著成效[2-4]。依據(jù)材料輻射敏感性確定最適誘變劑量是誘變育種工作的首要環(huán)節(jié)，其中種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率、植株性狀和功能（育性）以及果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)均是衡量植物輻射敏感性的重要指標(biāo)。以往研究表明，不同品種或同一品種不同基因型對(duì)同一誘變?cè)吹妮椛涿舾行源嬖陲@著差異[5]。因此針對(duì)供試材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)重新確定最適誘變劑量。此外，突變材料的篩選在功能基因研究、遺傳學(xué)分析、優(yōu)良品種培育上也發(fā)揮著重大作用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)誘變材料的評(píng)估已從早期的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記發(fā)展到DNA分子標(biāo)記，在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，SSR標(biāo)記技術(shù)具有豐富性、共顯性、穩(wěn)定性等諸多優(yōu)勢(shì)，在種群遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等諸多方面展現(xiàn)出強(qiáng)大功效[6-9]。在以往研究中，張俐等[10]采用SSR標(biāo)記研究12C6+輻射玉米自交系材料的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)重離子輻射對(duì)玉米遺傳變異有影響，并證實(shí)SSR是研究輻射玉米遺傳變異的有效工具；楊瑰麗等[11]采用SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)12C6+輻射水稻后代突變株和原材料遺傳多樣性存在顯著差異。然而到目前為止，利用SSR標(biāo)記對(duì)12C6+輻射誘變黃瓜的遺傳多樣性研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以不同劑量12C6+輻射黃瓜種子為實(shí)驗(yàn)材料，將種子發(fā)芽試驗(yàn)、田間試驗(yàn)、生理實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)相結(jié)合分析輻射黃瓜M1代生物學(xué)效應(yīng)，確定種子輻射敏感性并篩選正向突變株，以期選育出產(chǎn)量高、品質(zhì)好的新品種，并為后續(xù)黃瓜誘變育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

輻射實(shí)驗(yàn)材料：河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院生物物理研究所選育的黃瓜自交系種子18C-1。

果實(shí)Vc材料：從對(duì)照組和輻射組采摘生長(zhǎng)8 d商品瓜果實(shí)。

分子實(shí)驗(yàn)材料：從對(duì)照組和輻射組隨機(jī)采集幼嫩芽尖，ddH2O沖洗干凈吸水紙吸干表面水分后置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。

1.2 輻射實(shí)驗(yàn)

將供試黃瓜種子用橡皮泥固定在塑料盤(pán)上，胚乳朝上單層放置正對(duì)真空封口膜，采用蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室HIRFL加速器產(chǎn)生的低能12C6+束流經(jīng)過(guò)鎳窗、電離室、空氣后對(duì)種子胚部進(jìn)行輻射處理，注入劑量依次為60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy，以未經(jīng)輻射的同批種子為對(duì)照。輻射參數(shù)為：離子能量為80 MeV·um-1，傳能線密度LET= 30 keV·um-1，射程17 mm，劑量率為60 Gy·min-1。

1.3 發(fā)芽和種植實(shí)驗(yàn)

將5組種子（每組40粒）55～60 ℃溫湯浸種10 min[12]，期間定向勻速攪拌，自然降溫到30 ℃放置到恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃）浸泡8 h，撈出瀝干用濕潤(rùn)紗布包裹放置培養(yǎng)皿中，隨后置于恒溫箱中（30 ℃）進(jìn)行常規(guī)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。以根長(zhǎng)2 mm為發(fā)芽標(biāo)志，每12 h統(tǒng)計(jì)一次，以第1天、第3天發(fā)芽數(shù)量計(jì)算各組種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)，隨后種植于V草炭∶V蛭石=5∶1的育苗穴盤(pán)中。期間常規(guī)栽培管理。在幼苗生長(zhǎng)18 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各組成苗率、株高、莖粗?jǐn)?shù)據(jù)并觀測(cè)幼苗田間性狀。

發(fā)芽勢(shì)（GE）= 第1天發(fā)芽數(shù)/播種數(shù)（40粒）×100% ， （1）

發(fā)芽率（GP）= 第3天發(fā)芽數(shù)/播種數(shù)（40粒）×100% ， （2）

發(fā)芽指數(shù)（GI）=ΣGt/Dt ， （3）

成苗率（SR）=18天成苗數(shù)/播種粒數(shù)（40粒）×100% ， （4）

式中：Gt指時(shí)間t的發(fā)芽數(shù)；Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.4 果實(shí)維生素C含量測(cè)定

將采摘的黃瓜果實(shí)樣品進(jìn)行編號(hào)，對(duì)照組：K1、K2、K3；60 Gy組：A1、A5、A9；80 Gy組：B1、B2；120 Gy組：D3；100 Gy組植株全部為簇狀不育株，沒(méi)有果實(shí)樣品。將待測(cè)樣本ddH2O沖洗干凈并擦干，從果實(shí)中間位置沿徑向切取10 g果肉，利用Vc在紫外光下有明顯吸收在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定特性，在最大波長(zhǎng)245 nm處測(cè)定樣本溶液和堿處理溶液差值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Vc濃度，并依據(jù)Vc濃度計(jì)算Vc含量Vc（紫外分光光度法）[13]。

Vc（mg·100 g-1） = c·V總·V待測(cè)·100/V1·W總·1000 ， （5）

式中：c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Vc濃度（ug·mL-1）；V總=10 mL為吸取樣品定容后體積；V待測(cè) = 50 mL為待測(cè)樣品總體積；100為100 g黃瓜；V1 = 0.2 mL為測(cè)定吸光度時(shí)吸取樣品溶液體積；W總 = 10 g為測(cè)定黃瓜樣本質(zhì)量。

1.5 DNA提取與檢測(cè)

采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒（DP 305）離心吸附柱法對(duì)樣本DNA進(jìn)行提取，紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度、純度、完整性。

1.6 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

隨機(jī)選取40對(duì)引物[13]，純化方式為HPLC，由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：共25 ul；正、反向引物（10 umol）各1 ul；2·Reaction Mix 12.5 ul；Golden DNA Polymerase 0.2 ul；DNA模板1.25 ul；ddH2O 9.05 ul。反應(yīng)循環(huán)：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 S；50～60 ℃退火30 s（引物不同退火溫度不同）；72 ℃延伸1 min；共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用QIAxcel全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)每一個(gè)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小，QIAxcel ScreenGel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.7 數(shù)據(jù)與分析

利用Origin 9.1繪制各組種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率以及果實(shí)Vc含量變化曲線圖；利用Excel 2010對(duì)幼苗株型（株高、莖粗）進(jìn)行差異顯著性分析，P < 0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，利用R 3.5.3軟件（平均層次聚類(lèi)法）依據(jù)幼苗株高、莖粗?jǐn)?shù)據(jù)對(duì)各組幼苗進(jìn)行單株聚類(lèi)；多態(tài)性信息用多態(tài)性帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)百分比來(lái)評(píng)估，用POPGEN 1.32軟件對(duì)五組進(jìn)行聚類(lèi)分析（UPGMA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射對(duì)種子活力、成苗率影響

在輻射生物學(xué)研究中，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率是衡量輻射損傷效應(yīng)的重要指標(biāo)[15]，其中輻射引起幼苗約50%的致死劑量為輻射損傷半致死劑量（LD50），輻射引起幼苗成活約為40%的輻射劑量為輻射損傷臨界劑量（LD40）[16]。如圖1所示，重離子輻射對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率均有顯著抑制作用，說(shuō)明12C6+輻射對(duì)種子萌發(fā)狀態(tài)有影響，其中60 Gy輻射劑量下種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率均高于其它輻射組，依次為62.50%、87.50%、30.00%、60.00%，說(shuō)明60 Gy劑量為12C6+輻射黃瓜半致死劑量，種子活力較高，幼苗成苗率較高。80 Gy劑量輻射幼苗成苗率為35.00%為輻射損傷臨界劑量。

種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率均隨劑量增加呈先降后升變化趨勢(shì)，即表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中種子發(fā)芽勢(shì)和成苗率變化相似，在80 Gy處理下顯著低于對(duì)照且有最低值52.50%和35.00%，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)變化相似，在100 Gy處理下顯著低于對(duì)照且有最低值70.00%和25.00%。

2.2 輻射對(duì)植株性狀影響

植株田間性狀是探究輻射生物效應(yīng)的另一個(gè)重要指標(biāo)[17]，且在當(dāng)代就表現(xiàn)出一定的生理?yè)p傷和遺傳變異[18]。如圖2所示為各組植株幼苗期、成苗期、結(jié)果期的田間性狀。

對(duì)照組葉色正常、葉片平展、葉緣全緣、淺鋸齒、葉形心形、植株生長(zhǎng)茁壯、但果實(shí)瓜把較長(zhǎng)，如圖2a）、e）、j）。其中60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組均出現(xiàn)不等數(shù)量，不同程度變異，具體表現(xiàn)如下。

在幼苗期：生長(zhǎng)點(diǎn)消失，如圖2b），且均在后期生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸死亡；生長(zhǎng)畸形、葉片皺縮、殘缺，如圖2c），在后期生長(zhǎng)過(guò)程中葉片逐漸平展，成苗后植株葉片表現(xiàn)出如圖2g）的性狀；胚乳對(duì)稱出現(xiàn)白斑，如圖2d），在后期生長(zhǎng)過(guò)程中，白色斑點(diǎn)逐漸消失。

在成苗期：整株葉形不對(duì)稱生長(zhǎng)，如圖2f）；葉色深綠、葉面皺縮、葉緣殘缺，如圖2g）；葉片波浪狀，如圖2h）；難以正常生長(zhǎng)發(fā)育的簇狀不育株，如圖2i）。

在結(jié)果期：60 Gy組出現(xiàn)“瓜把變短”、“長(zhǎng)圓筒狀”的優(yōu)良果實(shí)變異株，如圖2k）；100 Gy組全部為簇狀不育株，如圖2i）；120 Gy組出現(xiàn)“瓜果短小”的負(fù)向突變株，如圖2r）和“雙生瓜”變異株，如圖2m），但“雙生瓜”株型整株生長(zhǎng)狀況不佳，在果實(shí)生長(zhǎng)后期由于營(yíng)養(yǎng)供給不足導(dǎo)致瓜果萎蔫死亡。

株高、莖粗是表征黃瓜株型的主要指標(biāo)。如表1所示。60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組株高較對(duì)照變化均達(dá)極顯著水平（P < 0.01）；60 Gy、80 Gy組徑粗較對(duì)照變化達(dá)顯著水平（P <0.05），100 Gy、120 Gy組達(dá)極顯著水平（P < 0.01），即輻射對(duì)黃瓜幼苗株型影響效應(yīng)顯著。

為進(jìn)一步探究各組幼苗株高、莖粗間關(guān)系，對(duì)113株幼苗進(jìn)行單株聚類(lèi)。如圖3所示，在歐式距離19左右處分為2類(lèi)，第1類(lèi)共25株，全部為對(duì)照組植株，占比（37株）67.56%，第2類(lèi)共88株幼苗，60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組共76株，對(duì)照組12株，其中76株幼苗均表現(xiàn)出不同程度的生物學(xué)損傷，對(duì)照組12株僅表現(xiàn)為幼苗生長(zhǎng)緩慢、植株矮小，莖較細(xì)。即對(duì)照組和輻射組顯著區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明12C6+輻射對(duì)幼苗整體生長(zhǎng)狀況及株高、莖粗影響效應(yīng)顯著。

在歐式距離12左右處，將第2類(lèi)進(jìn)一步分為3個(gè)亞類(lèi)。第1亞類(lèi)共41株，在CK、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組內(nèi)依次有0、9、4、13、15株，大部分100 Gy組幼苗和120 Gy組幼苗聚為一類(lèi)，分別占比68.42%（100 Gy）、78.95%（120 Gy），說(shuō)明100 Gy、120 Gy輻射對(duì)幼苗株高、莖粗影響效應(yīng)相似；第2亞群共21株，在CK、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組內(nèi)依次有1、5、8、4、3株，其中80 Gy組個(gè)體占比高達(dá)57.14%（80 Gy），說(shuō)明80 Gy組和其他組有較好區(qū)分度；第3亞類(lèi)共26株，在CK、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy組內(nèi)依次為11、10、2、2、1株，其中CK、60 Gy組幼苗分別占比29.73%（CK）、41.66%（60 Gy），說(shuō)明CK、60 Gy組幼苗在株高、莖粗上有較高的相似度，田間性狀也觀測(cè)出兩組幼苗生長(zhǎng)狀況較相近。說(shuō)明12C6+輻射劑量越接近對(duì)幼苗株高、莖粗影響效應(yīng)越相似。

2.3 輻射對(duì)果實(shí)維生素C（Vc）含量影響

Vc含量是衡量黃瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖4所示，不同劑量輻射組內(nèi)不同單株果實(shí)Vc含量呈波浪狀變化趨勢(shì)，對(duì)照組Vc含量分別為15.45 mg·100g-1、7.95 mg·100 g-1、15.19 mg·100 g-1均低于20 mg·100 g-1；在60 Gy組Vc含量出現(xiàn)驟增高達(dá)32.98 mg·100 g-1、40.34 mg·100 g-1，說(shuō)明不同劑量12C6+重離子輻射后，黃瓜可能產(chǎn)生可遺傳變異導(dǎo)致果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)Vc積累量發(fā)生變化。

2.4 DNA質(zhì)量

如圖5所示，基因組DNA樣品條帶明亮、整齊、完整性好；濃度在30 ng·uL-1左右，OD260/OD280在1.8～2.0之間。即樣本DNA濃度、純度、完整性完全符合下游PCR實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 擴(kuò)增多態(tài)性

40對(duì)引物中共篩選出12對(duì)明亮、清晰、無(wú)雜帶的多態(tài)性引物，多態(tài)性引物比例為30%。

PCR產(chǎn)物大小在100～500 bp之間，不同引物擴(kuò)增帶數(shù)2～4條不等。如圖6所示為35號(hào)引物擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管凝膠峰圖，與對(duì)照組（406 bp）相比，35號(hào)引物在60 Gy組檢測(cè)到兩條多態(tài)性條帶，在410 bp處增加一條，406 bp處缺失一條；80 Gy組檢測(cè)到一條多態(tài)性條帶，在419 bp處增加1條；100 Gy組無(wú)多態(tài)性條帶；120 Gy組有3條多態(tài)性條帶，在419 bp處增加2條，406 bp處缺失1條。

如表2所示，120 Gy組多態(tài)性條帶比例最高，60 Gy次之。

基于組間遺傳距離矩陣得出聚類(lèi)樹(shù)狀圖。如圖7所示，在組間距離上，對(duì)照組與100 Gy組遺傳距離最小D = 0.016 0，與80 Gy組遺傳距離次之D = 0.029 7，3組聚為1類(lèi)；其中120 Gy組顯著區(qū)分其他組，遺傳距離最遠(yuǎn)D = 0.210 0，表明其分子水平變異程度較大，60 Gy次之D = 0.048 8。

3 討論與分析

本研究中以種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)確定輻射對(duì)種子活力影響，以成苗率作為輻射損傷效應(yīng)及半致死劑量依據(jù)[19]。研究表明，輻射組種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照，即重離子輻射抑制種子活力。輻射組種子大部分能正常發(fā)芽（GPmin = 70%），但在后期生長(zhǎng)過(guò)程中（生長(zhǎng)點(diǎn)缺失或受損嚴(yán)重）部分幼苗逐漸死亡，導(dǎo)致種子發(fā)芽率和成苗率間存在差異。同時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)與成苗率有較高的相似性，說(shuō)明輻射后種子發(fā)芽勢(shì)與成苗率仍存在較強(qiáng)的相關(guān)性[20-21]。重離子輻射對(duì)種子造成非線性損傷效應(yīng)，即種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、成苗率隨劑量增加呈先降后升變化趨勢(shì)，與前人[22]研究結(jié)果有相似之處，原因可能是低劑量輻射對(duì)幼苗產(chǎn)生損傷或致死損傷，在中、高劑量輻射時(shí)誘發(fā)植物體內(nèi)損傷修復(fù)效應(yīng)[23-24]，而低劑量輻射不足以誘發(fā)修復(fù)致使種子活力差、成苗率低，繼續(xù)加大輻射劑量曲線是否出現(xiàn)下降趨勢(shì)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。與馮亮英[25]研究12C6+輻射對(duì)甜高粱發(fā)芽勢(shì)、成苗率影響趨勢(shì)存在差異，原因可能是輻射劑量、材料敏感性或生長(zhǎng)環(huán)境等綜合因素影響所致。

武振華等[26]研究輻射紫蘇M1代表型發(fā)現(xiàn)葉緣皺縮、葉片畸形、分支少、發(fā)育不良的負(fù)向突變株以及分支多、花期短、產(chǎn)量高的正向突變株；余麗霞等[18]研究大豆發(fā)現(xiàn)低劑量輻射下葉片、葉色、株高等發(fā)生變異，高劑量輻射下出現(xiàn)發(fā)育遲緩、苗弱現(xiàn)象，各劑量輻射下真葉均出現(xiàn)白化、黃化、斑點(diǎn)及皺縮、缺刻、畸形等現(xiàn)象，在生育期觀測(cè)到部分植株不育。本研究中輻射黃瓜田間性狀和上述研究有相似之處，表現(xiàn)在幼苗期、成苗期各組均出現(xiàn)不等數(shù)量、不同程度的葉形（皺縮、殘缺、畸形）、葉色（白化、斑點(diǎn)、深綠）及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、矮而弱的變異株。在60 Gy組篩選到瓜把短小、長(zhǎng)圓筒狀果實(shí)正向突變株，此突變性狀能提高果實(shí)食用部分，進(jìn)而間接提升果實(shí)產(chǎn)量，100 Gy組大部分幼苗在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸死亡，存活植株結(jié)構(gòu)和功能受損嚴(yán)重出現(xiàn)簇狀不育，120 Gy組植株難以維持果實(shí)正常生長(zhǎng)，不利于后代有效變異的篩選。此外，不同劑量重離子輻射對(duì)幼苗株高、莖粗均產(chǎn)生顯著地抑制作用，此結(jié)果與羅紅兵等[27]對(duì)自交系玉米的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，單株聚類(lèi)結(jié)果表顯示對(duì)照組、輻射組幼苗顯著區(qū)分開(kāi)，大部分輻射劑量相近的個(gè)體聚為一類(lèi)，原因可能是株高、莖粗屬植物生長(zhǎng)過(guò)程中的數(shù)量性狀，該性狀大部分是遺傳變異，少部分是環(huán)境飾變[28]，在此輻射誘變是造成幼苗生長(zhǎng)狀況差異的主要原因，而環(huán)境飾變導(dǎo)致每個(gè)聚類(lèi)組內(nèi)部個(gè)體由數(shù)量不等的五組幼苗個(gè)體組成。

黃瓜富含Vc、纖維素、礦質(zhì)元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。Vc具有穩(wěn)壓降脂、預(yù)防糖尿病、提升機(jī)體免疫力、抗氧化、防衰老等多種功效，其含量高低成為衡量黃瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)，但人類(lèi)由于自身基因缺陷，無(wú)法合成、儲(chǔ)存Vc需從果蔬中獲取，因此，測(cè)定誘變前后果實(shí)Vc含量變化對(duì)評(píng)定重離子誘變技術(shù)具有重要意義。研究表明，對(duì)照組黃瓜樣品Vc含量與以往測(cè)定結(jié)果相似均小于20 mg·100 g-1，其中60 Gy組樣品出現(xiàn)驟增，顯著高于其他各組，即60 Gy劑量輻射對(duì)黃瓜Vc含量產(chǎn)生良性誘變，以上這種變化具有進(jìn)一步遺傳分析的意義。與李姝汶等[29]研究重離子輻射對(duì)大蔥Vc含量產(chǎn)生顯著影響的結(jié)果相一致。此外，不同樣本Vc含量出現(xiàn)較大差異，原因可能是不同單株結(jié)果數(shù)量、水肥差異造成同一組不同樣本Vc含量存在較大差異，同時(shí)果蔬Vc受果蔬部位、儲(chǔ)存時(shí)間、儲(chǔ)存環(huán)境、生長(zhǎng)發(fā)育階段等多因素影響，

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基因組研究的基礎(chǔ)。研究表明，120 Gy組基因多樣性水平最高，60 Gy次之，聚類(lèi)樹(shù)狀圖也表明120 Gy和對(duì)照組遺傳距離最遠(yuǎn)，60 Gy次之，表明輻射后植株DNA較于對(duì)照產(chǎn)生顯著差異，該結(jié)果與葉小青等[30]、陳靜等[31]、劉勝洪等[32]利用SSR標(biāo)記研究輻射對(duì)誘變材料遺傳多樣性影響結(jié)果相似。并證實(shí)SSR標(biāo)記在研究輻射黃瓜分子鑒定上提供了有效方法，也為后續(xù)研究重離子輻射誘變黃瓜分子機(jī)制提供依據(jù)。

綜上所述，高輻射劑量（120 Gy）雖提高突變頻率、擴(kuò)寬遺傳圖譜，但大部分幼苗在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸死亡，成苗率低，同時(shí)，細(xì)胞嚴(yán)重受損致使植株不育或生長(zhǎng)狀態(tài)不佳難以供給果實(shí)正常生長(zhǎng)造成劣性突變，進(jìn)而掩蓋其他突變，不利于后代有效變異的選擇以及良種選育工作進(jìn)行。60 Gy組基因多樣性水平次之，同時(shí)篩選到果實(shí)性狀優(yōu)良、品質(zhì)高的正向突變株，但此性狀能否在后代中穩(wěn)定遺傳，尚需多代種植實(shí)驗(yàn)，以期培育出產(chǎn)量高、品質(zhì)好穩(wěn)定遺傳的黃瓜新品種。因此，既要確保幼苗一定的成活率又要在當(dāng)代和后代中篩選足夠多的正向突變類(lèi)型和突變株，從輻射種子活力、幼苗成苗率、植株性狀和功能、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)以及基因多樣性水平上綜合考慮，建議60 Gy為最適輻射劑量。

本研究采用不同劑量12C6+輻射黃瓜種子豐富了供試材料遺傳背景，同時(shí)，分析輻射黃瓜生物學(xué)效應(yīng)，確定最佳誘變劑量并篩選出正向突變株，也為后續(xù)12C6+輻射黃瓜育種在品種改良、進(jìn)化和生長(zhǎng)發(fā)育等重要生命課題研究上奠定一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝：蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室以及中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所李文建研究員，曲穎研究員在輻射試驗(yàn)中對(duì)本工作的幫助。

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