邱楚雯，施永海，王韓信，袁新程，徐嘉波

復(fù)合生物保鮮劑對(duì)冰鮮菊黃東方鲀微生物多樣性變化的影響

邱楚雯，施永海*，王韓信，袁新程，徐嘉波

(上海市水產(chǎn)研究所，上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

為探究4種復(fù)合生物保鮮劑對(duì)冰鮮菊黃東方鲀的作用效果，測(cè)定了菌落總數(shù)并采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序方法對(duì)復(fù)合生物保鮮劑處理的菊黃東方鲀肌肉細(xì)菌的16S rRNA基因的2個(gè)高變區(qū)（V3～V4）進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，復(fù)合生物保鮮劑A（0.5%茶多酚+ 0.2%乳酸鏈球菌素+ 0.3%溶菌酶）可使菊黃東方鲀貯藏期間的菌落總數(shù)顯著降低（< 0.05）。冰鮮18 d時(shí)的細(xì)菌群落多樣性最高，表明復(fù)合生物保鮮劑A可將菊黃東方鲀冰鮮保存時(shí)間延長(zhǎng)到18 d或以上。復(fù)合生物保鮮劑B（0.5%茶多酚+ 0.2%乳酸鏈球菌素）、C（0.2%乳酸鏈球菌素+ 0.3%溶菌酶）和D（0.5%茶多酚+ 0.3%溶菌酶）可將菊黃東方鲀冰鮮保存時(shí)間貨架期延長(zhǎng)至15 d左右。冰鮮條件下菊黃東方鲀肌肉5組15個(gè)樣品細(xì)菌分布于21門187屬，優(yōu)勢(shì)菌門分別為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，主要優(yōu)勢(shì)菌屬包括假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬與紅球菌屬。復(fù)合生物保鮮劑改變了菊黃東方鲀肌肉的群落結(jié)構(gòu)，菊黃東方鲀特定腐敗菌可能為假單胞菌屬。試驗(yàn)結(jié)果為后期開展菊黃東方鲀保鮮技術(shù)研究提供了理論參考。

菊黃東方鲀；冰鮮；復(fù)合生物保鮮劑；菌群結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序

菊黃東方鲀()為鲀科東方鲀屬水產(chǎn)魚類，主要分布于東海、黃海和渤海灣沿岸水域[1]。因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、口感鮮美被認(rèn)為是我國(guó)最具經(jīng)濟(jì)效益的魚類之一。菊黃東方鲀無(wú)毒的肌肉具有獨(dú)特味道，其主要成分為甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸和5-磷酸肌苷(5 -IMP)等氨基酸和核苷酸相關(guān)化合物[2-3]。然而，菊黃東方鲀高蛋白質(zhì)和脂肪酸含量的特點(diǎn)，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了條件，使其極易腐敗，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量損失，降低了經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-5]。同時(shí)，魚類死后會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)功能性流失等生化變化，由于內(nèi)源酶與微生物的代謝活動(dòng)，使魚類感官和營(yíng)養(yǎng)特性發(fā)生變化，導(dǎo)致魚體腐敗，縮短了貨架期[6]。因此，有必要采取相應(yīng)保鮮處理手段延緩水產(chǎn)品的品質(zhì)劣變，延長(zhǎng)貯藏貨架期。

目前，延長(zhǎng)魚類貨架期的方法有很多，如低溫保鮮、化學(xué)處理、輻照保鮮、高壓保鮮和氣調(diào)貯藏等[7]。低溫保鮮是最常用的魚類保鮮技術(shù)之一，能有效保持魚肉品質(zhì)。然而，冷藏只能減緩微生物的生長(zhǎng)速度，不能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[8]。腐敗菌能產(chǎn)生水解酶、脂肪酶和蛋白酶，對(duì)魚肉產(chǎn)生不良影響。抑制微生物生長(zhǎng)是延緩菊黃東方鲀腐爛的關(guān)鍵問(wèn)題?；瘜W(xué)防腐劑已被用于魚類以抑制不良細(xì)菌的生長(zhǎng)，但過(guò)度使用化學(xué)防腐劑已引起消費(fèi)者的關(guān)注[9]。生物保鮮劑是指從生物（動(dòng)物、植物、微生物等）中提取或利用生物技術(shù)獲得的具有保鮮作用且對(duì)人體安全的物質(zhì)。近年來(lái)，生物保鮮劑因其殺菌效果好且天然安全等特點(diǎn)，得到研究人員普遍重視[10]。目前，茶多酚（tea polyphenols, TP）、乳酸鏈球菌素（nisin，NIS）、溶菌酶（lysozyme, LYS）等符合GB2760—2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的天然保鮮劑，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮當(dāng)中[11]。TP是一種從綠茶中提取的天然化合物，具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等有較強(qiáng)的抑制作用[12]。TP可通過(guò)與金屬離子螯合，抑制氧化酶活動(dòng)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[13]。NIS是由乳酸乳球菌亞種產(chǎn)生的一種細(xì)菌素[14]，它的抗菌活性機(jī)制涉及細(xì)菌表面陰離子磷脂的相互作用和孔隙的形成，以及細(xì)菌膜上質(zhì)子動(dòng)力的耗散[15]。它可以抑制許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括食源性病原體(如單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌)和腐敗細(xì)菌(如乳酸菌、芽孢桿菌)的生長(zhǎng)[16]，但單用NIS對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌作用較弱[17]。LYS是一種從牛奶和雞蛋等食物中提取堿性酶，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有抗菌活性，但其作用機(jī)制與NIS有所不同。LYS能水解細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖中-乙酰胞壁酸和-乙酰氨基葡萄糖之間的β 1, 4-糖苷鍵。LYS水解破壞了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性，最終破壞細(xì)菌細(xì)胞[18]。由于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的結(jié)構(gòu)不同，LYS不能通過(guò)革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖(LPS)層直接接觸其內(nèi)部的肽聚糖[19-20]，因而LYS對(duì)革蘭氏陰性菌沒(méi)有明顯的抑菌作用。

生物保鮮劑的特異性表明在食品保鮮中使用單一的保鮮劑很難獲得預(yù)期的效果。將不同來(lái)源的天然保鮮劑進(jìn)行組合具有降低抗菌劑量、降低成本和拓寬抗菌譜等優(yōu)點(diǎn)[21]。0.4%大蒜素、0.32%茶多酚和0.34%葡萄籽提取物組成的復(fù)合生物保鮮劑可明顯延緩鱸魚脂質(zhì)氧化，對(duì)大口黑鱸魚肉有較好的保鮮效果[22]。NIS和蕎麥胰蛋白酶抑制劑聯(lián)合使用可有效抑制鱸魚魚糜4℃貯藏過(guò)程中微生物生長(zhǎng)[23]。在原位合成納米Si Ox/CS涂膜中加入LZM、TP兩種保鮮劑，其保鮮性能最優(yōu)，魚片的貨架期可延長(zhǎng)8～10 d[24]。目前，尚未有探索茶多酚、溶菌酶以及乳酸鏈球菌素復(fù)合對(duì)菊黃東方鲀保鮮效果的研究。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了復(fù)合保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響。對(duì)菊黃東方鲀微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的分析，可為復(fù)合保鮮劑的作用效果提供理論參考，將有助于開發(fā)有效、無(wú)毒的保鮮劑來(lái)延長(zhǎng)菊黃東方鲀的貨架期。由于菊黃東方鲀大多在冰鮮條件下進(jìn)行運(yùn)輸，因而研究冰鮮條件下復(fù)合生物保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀的作用效果更有意義。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮活菊黃東方鲀（體重157.4 g ± 36.6 g，體長(zhǎng)18.3 cm ± 1.3 cm），當(dāng)日早晨捕撈于上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地池塘，為基地人工繁養(yǎng)樣品。原料經(jīng)冰猝死后，保持冰鮮運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。菊黃東方鲀運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，切取魚肌肉，用無(wú)菌冷水清洗干凈，用吸水紙將肉表面的水分吸干，浸泡在不同種類復(fù)合生物保鮮劑溶液中5 min，撈出置于不銹鋼網(wǎng)籃中自然瀝干至肉塊表面無(wú)水滴，裝于自封袋內(nèi)冰鮮保存（0 ℃），保存時(shí)間分別為0、3、6、9、12、15和18 d 。對(duì)照組（CK組）直接裝袋冰鮮保存。課題組此前在不同濃度茶多酚、乳酸鏈球菌素和溶菌酶對(duì)菊黃東方鲀保鮮效果的試驗(yàn)中，確定了0.5% TP、0.2% NIS及0.3% LYS為最適濃度[25]。根據(jù)此前研究結(jié)果，設(shè)置復(fù)合生物保鮮劑處理組，共分為4組，分別是：A組為0.5% TP + 0.2% NIS + 0.3% LYS；B組為0.5% TP + 0.2% NIS；C組為0.2% NIS + 0.3% LYS；D組為0.5% TP + 0.3% LYS；CK組為空白對(duì)照組。其中冰鮮保存6、12和18 d的不同處理組與對(duì)照組用于進(jìn)行高通量測(cè)序分析，分別表示為A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，CK1、CK2、CK3。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數(shù)的測(cè)定 按照GB4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定[26]。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和Miseq測(cè)序 每個(gè)樣品(12.5 g)放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入25 mL無(wú)菌生理鹽水(0.85 g·100 mL-1)，均質(zhì)10 min。經(jīng)200目無(wú)菌紗布過(guò)濾后，濾液1 000 r·min-1離心10 min后，將上清液于10 000 r·min-1離心10 min后棄上清液，沉淀重懸浮于1 mL TE buffer中，﹣70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)DNA提取試劑盒(FastDNA?SPIN Kit) (MP Biomedicals, 美國(guó))說(shuō)明書進(jìn)行菊黃東方鲀肌肉樣品DNA抽提，DNA純度和濃度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為338F (5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和806R (5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將擴(kuò)增片段構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用UPARSE version 7.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)97%相似度水平對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)聚類，對(duì)物種進(jìn)行注釋與評(píng)估。使用RDP Classifier version 2.2對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類，置信閾值為0.7。利用Mothur v.1.30.1程序計(jì)算Alpha多樣性。使用QIIME軟件進(jìn)行Beta多樣性分析(主成分分析、群落Heatmap圖)。利用SPSS16.0 進(jìn)行方差分析，顯著性水平設(shè)< 0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀菌落總數(shù)的影響

由表1可知，A組、B組、C組和D組樣品在貯藏18 d的菌落總數(shù)分別為4.25、5.73、6.25和6.47l lg (CFU·g-1)顯著低于對(duì)照組（< 0.05）。C組樣品在貯藏12 d的菌落總數(shù)分別為3.37 lg(CFU·g-1)顯著低于對(duì)照組（< 0.05），B組、C組和D組樣品在貯藏18 d的菌落總數(shù)差異不顯著（> 0.05）。根據(jù)本課題組此前研究結(jié)果，當(dāng)菊黃東方鲀菌落總數(shù)為5 lg（CFU·g-1）左右則接近食用上限，據(jù)此可推測(cè)保存時(shí)間[10]。表明復(fù)合生物保鮮劑具有一定保鮮作用，A組可延長(zhǎng)至18 d或以上，B組、C組和D組可延長(zhǎng)至15 d左右，而CK組的保鮮時(shí)間為12 d左右。

2.2 復(fù)合保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀微生物多樣性影響

2.2.1 16S rRNA基因測(cè)序的特點(diǎn) 高通量測(cè)序結(jié)果顯示，5組15個(gè)樣本的平均序列數(shù)為46 020條。97%相似度水平下OTUs數(shù)為510個(gè)，涵蓋了21個(gè)門，39綱，91目，135科，187屬。不同樣本的OTUs數(shù)為25～204個(gè)；有關(guān)群落豐富度的Ace指數(shù)為43.53～273.15，Chao指數(shù)在38.20～222.00；有關(guān)群落多樣性的香農(nóng)Shannon指數(shù)從0.26到0.95，Simpson指數(shù)為0.52～0.90，樣本中物種覆蓋度大于99.87%（從99.87%～99.97%）（表2），表明本次測(cè)序基本代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

表1 復(fù)合生物保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀菌落總數(shù)的影響

注：A組為0.5 T+ 0.2 N+ 0.3 L；B組為0.5 T + 0.2 N；C組為0.2 N + 0.3 L；D組為0.5 T + 0.3 L；CK組為對(duì)照組。A1-CK1: 6 d;A2-CK2:12 d; A3-CK3:18 d。同列數(shù)據(jù)中標(biāo)有不同字母表示差異顯著（< 0.05）。

Ace指數(shù)和Chao指數(shù)反映了菌群豐度；而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則反映的是菌群的多樣性。樣本中細(xì)菌的豐富度總體上排序?yàn)椋築組>D組>A組>C組>CK組（表2）。隨著貯藏時(shí)間的增加，A組和D組菌群豐度呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，C組和CK組總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；A組、C組及CK組細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；B組和D組樣本中細(xì)菌的多樣性則呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。復(fù)合生物保鮮劑處理的菊黃東方鲀肌肉樣品中，A組在冰鮮18 d時(shí)Shannon指數(shù)最高，Simpson值最低，表明此時(shí)細(xì)菌多樣性最高。推測(cè)可能是由于復(fù)合生物保鮮劑（0.5%TP + 0.2%NIS + 0.3%LYS）處理后菊黃東方鲀冰鮮12 d前致腐菌生長(zhǎng)受到一定抑制，而在12～18 d，此時(shí)菊黃東方鲀的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)仍較為豐富，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速。

表2 在97%相似度水平上樣品中細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)

注：A組為0.5 T + 0.2 N + 0.3 L；B組為0.5 T + 0.2 N；C組為0.2 N + 0.3L；D組為0.5 T + 0.3 L；CK組為對(duì)照組。A1-CK1: 6 d;A2-CK2: 12 d;A3-CK3: 18 d。

圖1 基于門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

Figure 1 The bacterial community structure at the phylum levels

圖2 除了變形菌門外基于門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

Figure 2 The bacterial community structure except Proteobacteria at the phylum levels

圖3 基于屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

Figure 3 The bacterial community structure at the genus classification levels

2.2.2 細(xì)菌群落組成的差異 菊黃東方鲀的15個(gè)樣品細(xì)菌分布于21個(gè)門，其中3個(gè)門的豐度大于1%（至少有一組豐度大于1%）。如圖1所示，優(yōu)勢(shì)菌門分別為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteriota和厚壁菌門Firmicutes。按占10%以上為優(yōu)勢(shì)菌門統(tǒng)計(jì)，不同復(fù)合保鮮劑處理后的菊黃東方鲀肌肉樣品中變形菌門始終占據(jù)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為96.99%～99.72%。菊黃東方鲀?cè)诒r條件下貯藏6、12和18 d后，A組細(xì)菌群落中變形菌門占比呈現(xiàn)先減少后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，占比分別為98.89%、98.41%和99.08%；B組、C組及CK組細(xì)菌群落中變形菌門占比的變化趨勢(shì)與A組相同。D組有所不同，細(xì)菌群落中變形菌門占比分別為98.12%、99.99%和99.06%。如圖2所示，A組、B組、D組及CK組細(xì)菌群落中放線菌門的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后較少的特點(diǎn)。放線菌門和厚壁菌門在C組和D組的占比相對(duì)較大。C組、D組中貯藏12 d樣品細(xì)菌群落中厚壁菌門的占比分別為1.57%和1.92%。unclassified k norank d Bacteria菌門在貯藏12 d的B組樣品中占比較高（1.11%），而在其他組樣品中的占比較低。

圖4 除了假單胞菌屬外基于屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

Figure 4 The bacterial community structure exceptat the genus classification levels

5組15個(gè)樣品的細(xì)菌分布于187個(gè)屬，其中5個(gè)屬的豐度>1%。如圖3所示，假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬r和紅球菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，還包括unclassified_k_norank_d_Bacteria和芽孢桿菌。不同樣品組的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（豐度大于5%的細(xì)菌）有假單胞菌屬和無(wú)色桿菌屬。貯藏6和12 d樣品中C組的無(wú)色桿菌屬占比相對(duì)較低（圖4）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)色桿菌屬和紅球菌屬占比減少，假單胞菌屬占比增加。表明菊黃東方鲀冰鮮條件下肌肉的主要腐敗菌為假單胞菌屬。

主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖5所示：PCA獲得主成分PC1的方差貢獻(xiàn)率為98.17%，主成分PC2的方差貢獻(xiàn)率為1.55%。菊黃東方鲀冰鮮6、12和18 d的樣品之間距離較近，表明不同保存時(shí)間的菊黃東方鲀肌肉微生物群落組成較為相似。不同復(fù)合生物保鮮劑處理組的樣品各自分開，表明微生物群落分布不同。

圖5 基于OTU水平上的主成分分析

Figure 5 The principal component analysis (PCA) of the bacterial community at OTU level

Heatmap圖用于分析和比較所有樣品的細(xì)菌群落的組成及動(dòng)態(tài)變化。 如圖6所示，A組、B組、C組和D組冰鮮保存18 d的樣本與CK組不同保存時(shí)間的樣本群落結(jié)構(gòu)相似性較高，表明復(fù)合生物保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀肌肉群落結(jié)構(gòu)的改變起到一定的作用。

圖6 基于屬水平的菊黃東方鲀肌肉群落Heatmap圖分析

Figure 6 Community heatmap analysis at the genus-level of different microbiota inmuscle

3 討論與結(jié)論

微生物的作用是導(dǎo)致水產(chǎn)品變質(zhì)的重要原因之一[27]。由于微生物可以在低溫下存活和增殖[28]，抑制或延緩微生物的生長(zhǎng)可防止水產(chǎn)品變質(zhì)。新鮮水產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)為2～4lg (CFU·g-1)，初期腐敗TVC為6 lg (CFU·g-1)左右，當(dāng)增加到7～8 lg (CFU·g-1)時(shí)，便會(huì)感到強(qiáng)烈的腐敗臭味。但不同水產(chǎn)品腐敗時(shí)細(xì)菌總數(shù)不完全相同。此前本課題組研究認(rèn)為菊黃東方鲀當(dāng)菌落總數(shù)為5 lg (CFU·g-1)左右則接近食品上限[25]。本研究中復(fù)合生物保鮮劑（TP、NIS和LYS）能夠顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，菊黃東方鲀貯藏18 d菌落總數(shù)僅為4.25 lg (CFU·g-1)，表明菊黃東方鲀貯藏18 d 仍未達(dá)到食用上限。Wang等研究發(fā)現(xiàn)曲酸和TP可將花鱸的保鮮期延長(zhǎng)5～6 d[29]。Li等利用TP和迷迭香浸出物有效抑制鯽魚的微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其冷藏貨架期6～8 d[30]。Ju等研究發(fā)現(xiàn)真空包裝與茶多酚相結(jié)合分別在0 ℃和4 ℃條件下的延長(zhǎng)貨架期4～6 d和3～4 d[31]。Zhang等研究認(rèn)為雖然使用牛至和/或NIS并沒(méi)有改變草魚樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，但它們顯著降低了總活菌數(shù)，延長(zhǎng)了草魚的貨架期[32]。本研究與此前研究結(jié)果類似，復(fù)合保鮮劑可延長(zhǎng)水產(chǎn)品的貨架期，但延長(zhǎng)天數(shù)略有不同。與對(duì)照組相比，復(fù)合生物保鮮劑A（TP+NIS+LYS）可將冰鮮（0 ℃）條件下菊黃東方鲀的保存時(shí)間延長(zhǎng)3 d以上。保鮮劑對(duì)水產(chǎn)品貨架期的影響不同，這可能是由于不同保鮮劑對(duì)不同水產(chǎn)品的作用效果不同。復(fù)合保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀的貨架期的影響有待結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)一步研究確定。

本研究中A、C組12 d樣品的菌落總數(shù)分別為3.14和3.37 lg（CFU·g-1）；而A、C組18 d樣品的菌落總數(shù)分別為3.63和4.84 lg（CFU·g-1）。C組為NIS和LYS的組合，主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，表明貯藏前期菊黃東方鲀的主要腐敗菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，貯藏后期由于A組中添加了具有廣譜抗菌性TP，TP是對(duì)NIS、LYS的補(bǔ)充，提高了整體的保鮮效果。表明冰鮮貯藏后期菊黃東方鲀的腐敗菌以革蘭氏陰性菌為主。B、D組15 d的菌落總數(shù)分別為4.59、4.49 lg（CFU·g-1），顯著低于C組，抑菌效果優(yōu)于C組但不及A組，推測(cè)可能是B、D組加入了具有廣譜抗菌作用的TP，提高了復(fù)合保鮮劑的作用效果，彌補(bǔ)了NIS、LYS的不足。此外，高通量測(cè)序結(jié)果表明，CK組在6、12 d時(shí)細(xì)菌的豐度和多樣性較高，而在18 d其豐度和多樣性大幅降低。表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，腐敗菌生長(zhǎng)加快，但由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解后降低了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值導(dǎo)致細(xì)菌的豐度下降。A組豐富度和多樣性始終維持在較高水平，表明菊黃東方鲀中相關(guān)的特定腐敗菌并未形成優(yōu)勢(shì)菌群。高通量測(cè)序分析結(jié)果與菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果互相補(bǔ)充，測(cè)定菌落總數(shù)可反映樣本中可培養(yǎng)細(xì)菌的總體數(shù)量；高通量測(cè)序分析是對(duì)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行整體分析，可為復(fù)合保鮮劑對(duì)菊黃東方鲀保鮮效果提供理論參考。

冷藏魚特有的腐敗菌主要是革蘭氏陰性菌，如假單胞菌和希瓦氏菌。假單胞菌是需氧冷藏條件下水產(chǎn)品的主要破壞因素[33]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)，植酸和植酸與LYS復(fù)合作用可顯著降低假單胞菌的比例[34]。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍與TP配合作用可抑制假交替單胞菌()、冷桿菌()和肉桿菌()的生長(zhǎng)。本研究推測(cè)菊黃東方鲀冰鮮條件下肌肉的主要腐敗菌為假單胞菌屬，這與之前的研究結(jié)果類似。Nie等研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用海藻酸鈉相比，添加TP可有效提高日本鱸魚的保鮮效果[35]。Hui等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖與NIS復(fù)合作用能減少大黃魚腐敗氣味、抑制微生物生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)分解等[36]。Wang等在冷藏 (4 ℃) 下利用膠原-LYS涂層可抑制新鮮三文魚片的細(xì)菌生長(zhǎng)[37]。同樣，LYS和殼聚糖的包衣能有效地維持大黃魚貯藏期間的品質(zhì)[38]。Boyac?等使用含有LYS和LYS+綠茶提取物GTE的凝膠墊能防止冷熏鮭魚上的病原菌李斯特菌Listeria的生長(zhǎng)[39]。Zhang等利用TP與LYS的復(fù)合制劑協(xié)同抑制常見腐敗菌希瓦氏菌和熒光假單胞菌的生長(zhǎng)[40]。Sozbilen等研究發(fā)現(xiàn)LYS和NIS復(fù)合的抑菌活性優(yōu)于LYS和NIS單獨(dú)使用組[41]。本研究發(fā)現(xiàn)C組（NIS和LYS）的細(xì)菌多樣性低于其他處理組，假單胞菌的占比高于A、B、D組，這可能是由于NIS和LYS主要是抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，而對(duì)革蘭氏陰性菌的作用較弱；但TP和NIS組也存在同樣的問(wèn)題，可見多種保鮮劑的復(fù)合使用有助于彌補(bǔ)單一保鮮劑的不足。

冰鮮條件下，菊黃東方鲀特定腐敗菌是假單胞菌屬。三者復(fù)合的生物保鮮劑（茶多酚、乳酸鏈球菌素和溶菌酶）使得菊黃東方鲀魚肉保持了較高水平的微生物多樣性，可將其冰鮮保存時(shí)間延長(zhǎng)到18 d或以上。茶多酚與乳酸鏈球菌素、茶多酚與溶菌酶、乳酸鏈球菌素與溶菌酶兩者復(fù)合的生物保鮮劑可將菊黃東方鲀魚肉冰鮮保存時(shí)間延長(zhǎng)至15 d左右。

[1] JI Y, LIU Y, GONG Q L, et al. Toxicity of cultured puffer fish and seasonal variations in China[J]. Aquac Res, 2011, 42(8): 1186-1195.

[2] HWANG D F, CHEN T Y, SHIAU CY, et al. Seasonal variations of free amino acids and nucleotide-related compounds in the muscle of cultured Taiwanese puffer Takifugu rubripes[J]. Fisheries Sci, 2000, 66 (6): 1123-1129.

[3] YANG L, DAI B N, AYED C, et al. Comparing the metabolic profiles of raw and cooked pufferfish (Takifugu flavidus) meat by NMR assessment[J]. Food Chem, 2019, 290: 107-113.

[4] YU D W, WU L Y, REGENSTEIN J M et al. Recent advances in quality retention of non-frozen fish and fishery products: A review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2020, 60(10): 1747-1759.

[5] RAMEZANI Z, ZAREI M, RAMINNEJAD N. Comparing the effectiveness of chitosan and nanochitosan coatings on the quality of refrigerated silver carp fillets[J]. Food Control,2015, 51: 43-48.

[6] OLATUNDE O O, BENJAKUL S. Natural preservatives for extending the shelf-life of seafood: A revisit[J]. Compr Rev Food Sci Food Saf, 2018, 17(6): 1595-1612.

[7] SAMPELS S. The effects of storage and preservation technologies on the quality of fish products: A review[J]. J Food Process Preserv, 2015, 39(6): 1206-1215.

[8] CAI L Y, WU X S, LI X X, et al. Effects of different freezing treatments on physicochemical responses and microbial characteristics of Japanese sea bass () fillets during refrigerated storage[J]. LWT Food Sci Technol,2014, 59(1): 122-129.

[9] CHAHAD O B, EL BOUR M, CALO-MATA P, et al. Discovery of novel biopreservation agents with inhibitory effects on growth of food-borne pathogens and their application to seafood products[J]. Res Microbiol, 2012, 163(1): 44-54.

[10] NING Y W, YAN A H, YANG K, et al. Antibacterial activity of phenyllactic acid againstandby dual mechanisms[J]. Food Chem, 2017, 228: 533-540.

[11] 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn): GB 2760—2014[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2015.

[12] YANG C S, LAMBERT J D, SANG S M. Antioxidative and anti-carcinogenic activities of tea polyphenols[J]. Arch Toxicol, 2009, 83(1): 11-21.

[13] EFENBERGER-SZMECHTYK M, NOWAK A, CZYZO- WSKA A.Plant extracts rich in polyphenols: antibacterial agents and natural preservatives for meat and meat products[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2021, 61(1): 149-178.

[14] LIU W, HANSEN J N. Some chemical and physical properties of nisin, a small-protein antibiotic produced by Lactococcus lactis[J]. ASM Environ Microbiol, 1990, 56(8): 2551-2558.

[15] SUDAGIDAN M, YEMENICIO?LU A. Effects of nisin and lysozyme on growth inhibition and biofilm formation capacity of Staphylococcus aureus strains isolated from raw milk and cheese samples[J]. J Food Prot, 2012, 75(9): 1627-1633.

[16] HARRIS L J, FLEMING H P, KLAENHAMMER T R. Developments in nisin research[J]. Food Res Int, 1992, 25(1): 57-66.

[17] DELVES-BROUGHTON J, BLACKBURN P, EVANS R J,et al. Applications of the bacteriocin, nisin[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1996, 69(2): 193-202.

[18] PROCTOR V A, CUNNINGHAM F E,FUNG D Y C.The chemistry of lysozyme and its use as a food preservative and a pharmaceutical[J]. C R C Crit Rev Food Sci Nutr, 1988, 26(4): 359-395.

[19] MASSCHALCK B, MICHIELS C W. Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetative bacteria[J]. Crit Rev Microbiol, 2003, 29(3):191-214.

[20] CALLEWAERT L, VAN HERREWEGHE J M, VANDERKELEN L, et al. Guards of the great wall: bacterial lysozyme inhibitors[J]. Trends Microbiol, 2012, 20(10): 501-510.

[21] ISEPPI R, CAMELLINI S, SABIA C, et al. Combined antimicrobial use of essential oils and bacteriocin bacLP17 as seafood biopreservative to control Listeria monocytogenes both in planktonic and in sessile forms[J]. Res Microbiol, 2020, 171(8): 351-356.

[22] 白嬋, 許萍, 黃敏, 等. 復(fù)配生物保鮮劑對(duì)大口黑鱸冷藏保鮮效果的影響[J]. 食品科技, 2021, 46(2): 103-111.

[23] 李晨, 牛澤潔, 李文婕, 等. BTI和Nisin復(fù)合涂膜液對(duì)鱸魚魚糜的保鮮效果[J]. 食品研究與開發(fā), 2021, 42(22): 8-13.

[24] 武嬌, 楊華, 張家濤, 等. 原位合成納米SiOx/溶菌酶/茶多酚/殼聚糖復(fù)合保鮮涂膜對(duì)海鱸魚魚片保鮮性能的影響[J]. 食品科學(xué), 2020, 41(23): 181-189.

[25] 邱楚雯, 施永海, 劉智禹, 等. 三種生物保鮮劑結(jié)合冷藏對(duì)菊黃東方鲀的保鮮效果[J]. 漁業(yè)研究, 2021, 43(5):494-501.

[26] 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì), 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定: GB 4789.2—2016[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2017.

[27] GRAM L, HUSS H H. Microbiological spoilage of fish and fish products[J]. Int J Food Microbiol, 1996, 33(1): 121-137.

[28] ANACARSO I, MESSI P, CONDò C, et al. A bacteriocin-like substance produced from Lactobacillus pentosus 39 is a natural antagonist for the control ofandin fresh salmon fillets[J]. LWT Food Sci Technol, 2014, 55(2): 604-611.

[29] WANG R F, HU X Y, AGYEKUMWAA A K,et al. Synergistic effect of kojic acid and tea polyphenols on bacterial inhibition and quality maintenance of refrigerated sea bass () fillets[J]. LWT, 2021, 137: 110452.

[30] LI T T, LI J R, HU W Z, et al. Shelf-life extension of crucian carp () using natural preservatives during chilled storage[J]. Food Chem, 2012, 135(1): 140-145.

[31] JU J, LIAO L, QIAO Y, et al. The effects of vacuum package combined with tea polyphenols (V+TP) treatment on quality enhancement of weever () stored at 0?°C and 4?°C[J]. LWT, 2018, 91: 484-490.

[32] ZHANG J, LI Y, YANG X, et al. Effects of oregano essential oil and nisin on the shelf life of modified atmosphere packed grass carp ()[J]. LWT, 2021, 147: 111609.

[33] MACé S, JOFFRAUD J J, CARDINAL M, et al. Evaluation of the spoilage potential of bacteria isolated from spoiled raw salmon () fillets stored under modified atmosphere packaging[J]. Int J Food Microbiol, 2013, 160(3): 227-238.

[34] SUN X, HONG H,JIA S, et al. Effects of phytic acid and lysozyme on microbial composition and quality of grass carp () fillets stored at 4?°C[J]. Food Microbiol, 2020, 86: 103313.

[35] NIE X B, WANG L H, WANG Q, et al. Effect of a sodium alginate coating infused with tea polyphenols on the quality of fresh Japanese Sea bass () fillets[J]. J Food Sci, 2018, 83(6): 1695-1700.

[36] HUI G H, LIU W, FENG H L, et al. Effects of chitosan combined with nisin treatment on storage quality of large yellow croaker ()[J]. Food Chem, 2016, 203: 276-282.

[37] WANG Z, HU S F, GAO Y P, et al. Effect of collagen-lysozyme coating on fresh-salmon fillets preservation[J]. LWT, 2017, 75: 59-64.

[38] WU T T, GE Y J, LI Y, et al. Quality enhancement of large yellow croaker treated with edible coatings based on chitosan and lysozyme[J]. Int J Biol Macromol, 2018, 120: 1072-1079.

[39] BOYAC? D, YEMENICIO?LU A.Development of gel-based pads loaded with lysozyme and green tea extract: Characterization of pads and test of their antilisterial potential on cold-smoked salmon[J]. LWT,2020, 128: 109471.

[40] ZHANG J T, LI Y C, ZHANG X, et al. Physicochemical properties and antibacterial mechanism of TP microcapsules/LZM-PVA gradual sustained-release composite coatings[J]. Prog Org Coat, 2020, 146: 105740.

[41] SOZBILEN G S, YEMENICIO?LU A. Antilisterial effects of lysozyme-nisin combination at temperature and pH ranges optimal for lysozyme activity: test of key findings to inactivate Listeria in raw milk[J]. LWT, 2021, 137: 110447.

Effects of compound biological preservative on microbial community diversity ofduring chilled storage

QIU Chuwen, SHI Yonghai, WANG Hanxin, YUAN Xincheng, XU Jiabo

(Shanghai Fisheries Technical Extension Station, Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433)

The effects of compound biological preservative on microbial community diversity ofduring chilled storage were investigated. The aerobic plate count was measured and Illumina MiSeq high-throughput sequencing method was used to analyze the two high-variation regions (V3-V4) of 16S rRNA gene of microbial structure of themuscle treated with the compound biological preservatives. The results showed that compound biopreservative A (0.5% tea polyphenol + 0.2% nisin + 0.3% lysozyme) significantly reduced the aerobic plate count (< 0.05). The diversity of the bacterial community was the highest at the18thday, which indicated that compound biological preservative A could prolong the preservation time of freshto 18 days or more. Compound biopreservatives B (0.5% tea polyphenol + 0.2% nisin), C (0.2% nisin + 0.3% lysozyme) and D (0.5% tea polyphenol + 0.3% lysozyme) could prolong the preservation time of freshto about 15 days. Fifteen samples from five groups ofmuscle under chilled storage were distributed in 187 genera, 21 phyla, with dominant phyla including Proteobacteria, Actinobacteriota and Firmicutes.,andwere the dominant genera. The compound biological preservatives could change the community structure ofmuscle, andmay be the specific spoil organisms of. This study provides theoretical references for the future research on preservation technology of.

; chilled; compound biological preservative; bacterial community structure; high-throughput sequencing

S983

A

1672-352X (2023)02-0267-08

2022-06-02

福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2019fjscq09)資助。

邱楚雯，工程師。E-mail：nanqiuchuwen.05@163.com

通信作者:施永海，研究員。E-mail：yonghais@163.com

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.009

2023-05-12 10:27:12

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1152.018.html