張倩 張文博 陳瀅竹 姜旭 湯璐 王剛 李艷麗

摘要：蛋白質(zhì)是一種保證機(jī)體健康的營養(yǎng)物質(zhì)，具有多種功效。以榛蘑粉末為原料，榛蘑蛋白提取率為指標(biāo)，采用堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白，利用響應(yīng)面法優(yōu)化榛蘑蛋白提取工藝，等電點(diǎn)法和鹽析法相結(jié)合沉淀榛蘑蛋白。結(jié)果表明，液料比47∶1、堿提pH 10.0、堿提時(shí)間1.55 h、堿提溫度80 ℃、超聲功率200 W、超聲pH 9.0、超聲溫度30 ℃的條件下，榛蘑蛋白的提取率為（76.59±0.23）%。榛蘑蛋白質(zhì)沉淀的方法為先進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀（pI=3.7），然后用90%的飽和硫酸銨進(jìn)行鹽析。試驗(yàn)表明堿提和超聲分步提取的方法與傳統(tǒng)堿提法相比，可有效提高蛋白提取率。等電點(diǎn)法結(jié)合鹽析法可提高蛋白得率。該試驗(yàn)結(jié)果為榛蘑蛋白的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：榛蘑；蛋白提??；響應(yīng)面法；等電點(diǎn)法；鹽析法

中圖分類號：TS201.21? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0118-07

Abstract： Protein is a nutrient that keeps the body healthy and has various functions. Using Armillaria mellea powder as the raw material and Armillaria mellea protein extraction rate as the index， Armillaria mellea protein is extracted by alkaline extraction and ultrasonic stepwise extraction， Armillaria mellea protein extraction process is optimized by response surface method， and Armillaria mellea protein is precipitated by the combination of isoelectric point method and salting out method. The results show that under the conditions of liquid-solid ratio 47∶1， alkaline extraction pH 10.0， alkaline extraction time 1.55 h， alkaline extraction temperature 80 ℃， ultrasonic power 200 W， ultrasonic pH 9.0 and ultrasonic temperature 30 ℃， the extraction rate of Armillaria mellea protein is （76.59±0.23）%. The precipitation method of Armillaria mellea protein is isoelectric point precipitation （pI=3.7） firstly， and then salting out with 90% saturated ammonium sulfate. The results show that compared with the traditional alkaline extraction method， the method of alkaline extraction and ultrasonic stepwise extraction could effectively improve the extraction rate of protein. Isoelectric point method combined with salting out method can improve the protein yield. The results have laid a foundation for the development and utilization of protein from Armillaria mellea.

Key words： Armillaria mellea; protein extraction; response surface methodology; isoelectric point method; salting out method

收稿日期：2022-11-09

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳項(xiàng)目（20200404052YY）；2021省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202101108SJ）

作者簡介：張倩（1998－），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

*通信作者：李艷麗（1978-），女，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：功能性食品。

蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)，缺乏蛋白質(zhì)將會(huì)對人體健康造成影響[1]。現(xiàn)今，根據(jù)聯(lián)合國最新一輪全球人口估計(jì)和預(yù)測，2080年世界人口將達(dá)到峰值104億左右。隨著人口數(shù)量的增長，對蛋白質(zhì)的需求量也相應(yīng)地大幅增長，許多發(fā)展中國家面臨蛋白緊缺的問題，所以蛋白的制備受到廣泛關(guān)注[2-3]。

在蛋白提取的研究中，傳統(tǒng)的方法一般采用堿提法[4]，但研究發(fā)現(xiàn)加入一些其他的輔助方法可以增加蛋白的提取率，比如超聲波輔助法，它可穿透細(xì)胞壁，使蛋白質(zhì)溶出[5-6]。并且超聲波輔助法操作簡便，因此已在蛋白提取領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[7-9]。

榛蘑又稱蜜環(huán)菌，與天麻共生，為長白山特色食用菌之一，目前尚無法進(jìn)行人工栽培。研究表明，榛蘑中包含萜類、多糖和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)，具有抗高血壓、降血糖、抗氧化等藥理作用[10]。Lin等以小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)了其水提取物對抑郁行為有抑制作用[11]。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)從蜜環(huán)菌中得到的水溶性多糖可以有效地抑制腫瘤生長，具有非常高的開發(fā)價(jià)值[13-14]。此外，榛蘑富含蛋白質(zhì)，且含有人體全部必需氨基酸，極具營養(yǎng)價(jià)值，是一種非常優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。但是，目前其蛋白質(zhì)的提取工藝尚未見報(bào)道。

本研究以榛蘑蛋白為研究對象，采用堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白，等電點(diǎn)法和鹽析法沉淀榛蘑蛋白，目的是提高榛蘑蛋白的提取率，為榛蘑蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮榛蘑：購自延吉市綠之源松茸特產(chǎn)品經(jīng)營部。

1.2 主要試劑

BCA試劑盒：索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸：北京化工廠。

1.3 儀器與設(shè)備

SIN415-2903酶標(biāo)儀 Omega公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG2-16B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Alpha 2-4LD Plus凍干機(jī) Marin Christ公司；PHSJ-3F pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JA1003分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；Kjeltec-8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器有限公司；GX-04粉碎機(jī) 浙江省永康市昌發(fā)工具廠；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；GHP-9080恒溫培養(yǎng)箱 常州隆和儀器制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 材料預(yù)處理

將新鮮的榛蘑洗凈，晾干，磨碎后過80目篩，得到榛蘑粉，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 榛蘑蛋白含量的測定方法

榛蘑干粉中總蛋白含量采用凱氏定氮法測定[15]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，按照BCA試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀測定在562 nm處的吸光值，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用BCA試劑盒法測定提取液中蛋白質(zhì)含量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)濃度。

1.4.3 蛋白提取率的計(jì)算公式

蛋白提取率計(jì)算公式如下：

蛋白提取率（%）=上清液中蛋白濃度×上清液體積原料質(zhì)量×原料中蛋白質(zhì)含量×100%。

1.4.4 堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白的工藝流程

首先進(jìn)行堿法提取榛蘑蛋白，即稱取榛蘑干粉，按1∶47的比例加入蒸餾水，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為10.0，于80 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)，1.55 h后以10 000 r/min離心20 min，收集上清液。然后進(jìn)行超聲提取，即向堿提后的殘?jiān)屑尤肱c堿提相同比例的蒸餾水，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH為9.0，在超聲溫度為30 ℃、功率為200 W的條件下超聲反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，以10 000 r/min離心20 min，收集上清液。將兩次離心后的上清液合并，用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為3.7，4 ℃靜置12 h，以10 000 r/min離心20 min。收集沉淀，向上清液中加入90%的飽和硫酸銨，4 ℃靜置12 h，以10 000 r/min離心20 min。收集沉淀，將兩次離心后的沉淀用PBS緩沖液溶解，得榛蘑蛋白質(zhì)溶液。

1.4.4.1 堿提法提取榛蘑蛋白的單因素試驗(yàn)

按照1.4.4中的方法，以蛋白提取率為指標(biāo)，考察堿提各因素對蛋白提取的影響。

pH的影響：溫度70 ℃，時(shí)間1 h，液料比35∶1，調(diào)節(jié)pH為7.0，8.0，9.0，10.0。

液料比的影響：溫度70 ℃，時(shí)間1 h，pH 10.0，調(diào)節(jié)液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1。

堿提溫度的影響：時(shí)間1 h，pH 10.0，液料比45∶1，調(diào)節(jié)溫度為60，70，80，90 ℃。

堿提時(shí)間的影響：溫度80 ℃，pH 10.0，液料比45∶1，調(diào)節(jié)時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。

1.4.4.2 超聲提取榛蘑蛋白的單因素試驗(yàn)

按照1.4.4中的方法，在堿提基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲提取。以蛋白提取率為指標(biāo)，考察超聲各因素對蛋白提取率的影響。

超聲時(shí)間的影響：溫度30 ℃，超聲功率200 W，pH 9.0，調(diào)節(jié)時(shí)間為5，10，15，20 min。

超聲pH的影響：超聲時(shí)間15 min，溫度30 ℃，超聲功率200 W，調(diào)節(jié)pH為7.0，8.0，9.0，10.0。

1.4.4.3 堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

按照1.4.4中的方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液料比（A）、堿提時(shí)間（B）、超聲pH（C）為影響因子，蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），對堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

1.4.4.4 榛蘑蛋白等電點(diǎn)的確定

將堿提和超聲分步提取的榛蘑蛋白上清液用0.1 mol/mL的HCl調(diào)節(jié)pH分別為 3.1，3.3，3.5，3.7，3.9，4.1，4.3，4.5，4 ℃靜置12 h，以10 000 r/min離心20 min。采用考馬斯亮藍(lán)法測定沉淀中蛋白含量，確定榛蘑蛋白的等電點(diǎn)。

1.4.4.5 榛蘑蛋白鹽析飽和硫酸銨的濃度的確定

取等電點(diǎn)法沉淀后的上清液加入飽和硫酸銨溶液。4 ℃靜置12 h，以10 000 r/min離心20 min。采用考馬斯亮藍(lán)法測定沉淀中蛋白含量，確定所需飽和硫酸銨的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛蘑蛋白粉總蛋白含量

利用凱氏定氮法測得榛蘑干粉中蛋白含量為20%。

2.2 堿提榛蘑蛋白的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿提pH的影響

由圖1可知，隨著pH的增大，榛蘑蛋白提取率逐漸上升。堿濃度的升高會(huì)加大榛蘑細(xì)胞壁的破裂，使榛蘑蛋白溶出，提高榛蘑蛋白的提取率。當(dāng)堿提pH值在9.0～10.0之間時(shí)，蛋白提取率上升趨勢緩慢。因此，將堿提pH值確定為10.0。

2.2.2 液料比的影響

由圖2可知，隨著液料比的增大，榛蘑蛋白提取率呈逐漸上升趨勢。在液料比達(dá)到45∶1時(shí)，榛蘑蛋白提取率不再上升，這可能是因?yàn)樵谝毫媳冗_(dá)到45∶1之前，隨著液體體積的增加，液體和固體之間的接觸面積增大，從而榛蘑蛋白提取率增加。因此，最適液料比為45∶1。

2.2.3 堿提溫度的影響

由圖3可知，隨著堿提溫度的升高，榛蘑蛋白提取率先上升后下降。在堿提溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，榛蘑蛋白提取率達(dá)到最高值，這可能是因?yàn)闇囟鹊纳叽龠M(jìn)了對榛蘑細(xì)胞壁的破壞，從而提高了榛蘑蛋白的提取率，在80 ℃時(shí)達(dá)到峰值。繼續(xù)升高堿提溫度，蛋白提取率呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因?yàn)檫^高的溫度使已經(jīng)提取出的榛蘑蛋白變性[16]，從而使蛋白提取率下降。因此，最適堿提溫度為80 ℃。

2.2.4 堿提時(shí)間的影響

由圖4可知，隨著堿提時(shí)間的不斷增加，榛蘑蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在時(shí)間為1.5 h時(shí)，榛蘑蛋白提取率達(dá)到最大，后續(xù)隨著時(shí)間的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)下降的趨勢，原因可能是在80 ℃處理下，堿提時(shí)間的增加會(huì)破壞榛蘑蛋白，從而導(dǎo)致蛋白提取率下降。因此，最適堿提時(shí)間為1.5 h。

2.3 超聲提取榛蘑蛋白的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間的影響

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的增加，榛蘑蛋白提取率先上升后下降。在超聲時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，榛蘑蛋白提取率達(dá)到最高，后續(xù)隨著超聲時(shí)間的增加，蛋白提取率逐漸下降，造成這種情況的原因是超聲波可以破碎細(xì)胞壁[17]，使蛋白提取率增大，之后隨著超聲時(shí)間的增加，超聲波會(huì)破壞溶解出的蛋白，使榛蘑蛋白提取率下降。因此，最適超聲時(shí)間為15 min。

2.3.2 超聲pH的影響

由圖6可知，隨著pH的逐漸增大，榛蘑蛋白提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。這是因?yàn)閜H的升高會(huì)加大榛蘑細(xì)胞壁的破裂，使榛蘑蛋白溶出，提高榛蘑蛋白的提取率。當(dāng)超聲pH值達(dá)到9.0時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大，之后pH增大對已溶出的蛋白造成了破壞，使蛋白提取率下降。因此，提取榛蘑蛋白的最適超聲pH為9.0。

2.4 不同蛋白提取方法的比較

比較了單獨(dú)堿提法、單獨(dú)超聲法（提取條件同堿提和超聲分步提取法中的超聲提取法）、堿提和超聲分步法、超聲和堿提分步法（超聲條件同單獨(dú)超聲法，堿提條件同單獨(dú)堿提法）4種方法對榛蘑蛋白的提取率，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，單獨(dú)超聲法蛋白提取率最低，為23.33%，單獨(dú)堿提法提取率次之，為43.28%，先超聲后堿提法提取率第三，為66.72%，先堿提后超聲法提取率最高，為74.70%。因此，本試驗(yàn)確定的堿提和超聲分步提取法提取榛蘑蛋白獲得了最佳的提取率。

2.5 堿提和超聲分步提取榛蘑蛋白的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果

對榛蘑蛋白進(jìn)行堿提和超聲分步提取，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)執(zhí)行二次多項(xiàng)式的逐步回歸擬合。最終的數(shù)學(xué)模型為Y=77.58－0.35A+0.68B+0.042C－0.6AB+0.2AC－0.28BC－1.76A2－1.55B2－1.74C2。回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型的F值為139.81，P值<0.05，差異顯著，其中A、B、AB、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，說明一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對榛蘑蛋白的提取率均具有顯著影響。失擬項(xiàng)的P值為0.317 8>0.05，表現(xiàn)為不顯著，說明擬合效果較好，并且R2=0.994 5>0.9，所以模型的結(jié)果符合實(shí)際，可以用來對榛蘑蛋白提取率進(jìn)行預(yù)測和優(yōu)化。

2.5.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析

響應(yīng)面可以直觀地體現(xiàn)各個(gè)參數(shù)之間的相互作用[18]。3D曲面圖表面越平緩，表明此因子對結(jié)果的影響越??；表面越陡峭，表明此因子對結(jié)果的影響越大。等高線圖形狀越接近橢圓，則相關(guān)性越大；而越接近法線圓，則相關(guān)性越小[19]。

2.5.2.1 液料比與堿提時(shí)間的交互作用

由圖8可知，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明液料比和堿提時(shí)間之間的相關(guān)性很大。固定堿提時(shí)間不變，增大液料比時(shí)，蛋白提取率先上升后下降；固定液料比不變，增加堿提時(shí)間時(shí)，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.2.2 液料比與超聲pH的交互作用

由圖9可知，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明液料比和超聲pH之間的相關(guān)性很大。固定液料比不變，增大超聲pH時(shí)，蛋白提取率先上升后下降；固定超聲pH不變，增大液料比時(shí)，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.2.3 堿提時(shí)間與超聲pH的交互作用

由圖10可知，等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明堿提時(shí)間和超聲pH之間的相關(guān)性很大。固定堿提時(shí)間不變，增加超聲pH時(shí)，蛋白提取率先上升后下降；固定超聲pH不變，增加堿提時(shí)間時(shí)，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.3 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果，預(yù)測提取榛蘑蛋白的最佳參數(shù)為液料比47.78∶1、堿提pH 10.0、堿提時(shí)間1.55 h、堿提溫度80 ℃、超聲功率200 W、超聲pH 9.04、超聲溫度30 ℃，此條件下的蛋白提取率為76.86%。根據(jù)試驗(yàn)的可行性，將條件調(diào)整為液料比47∶1、堿提pH 10.0、堿提時(shí)間1.55 h、堿提溫度80 ℃、超聲功率200 W、超聲pH 9.0、超聲溫度30 ℃，得到蛋白提取率（76.59±0.23）%。蛋白提取率與預(yù)測值無明顯差異，說明建立的模型與實(shí)際情況擬合良好。

2.6 榛蘑蛋白等電點(diǎn)的測定

由圖11可知，當(dāng)pH為3.7時(shí)，吸光度值最大，即蛋白含量最高，在此pH下，蛋白沉淀最多，所以確定pI=3.7為榛蘑蛋白的等電點(diǎn)。

2.7 鹽析法沉淀蛋白硫酸銨濃度測定

由圖12可知，當(dāng)飽和硫酸銨濃度為90%時(shí)，吸光度值最大，此時(shí)蛋白沉淀也最多，所以鹽析時(shí)選取的飽和硫酸銨濃度為90%。

2.8 不同蛋白沉淀方法的比較

分別采用單獨(dú)等電點(diǎn)法、單獨(dú)鹽析法、鹽析法和等電點(diǎn)法聯(lián)用、先鹽析后等電點(diǎn)法與先等電點(diǎn)后鹽析法5種方法進(jìn)行蛋白沉淀，結(jié)果見表4。

由表4可知，等電點(diǎn)法結(jié)合鹽析法總體上高于單獨(dú)等電點(diǎn)法和單獨(dú)鹽析法，其中，先等電點(diǎn)后鹽析法所得蛋白最多，而單獨(dú)等電點(diǎn)法所得蛋白最少。

3 討論與結(jié)論

超聲輔助堿提取蛋白法在目前食用菌蛋白提取中已有報(bào)道。姜伊悅等[20]研究表明，超聲輔助堿提法有利于元蘑蛋白的提取，弓志青等[21]采用超聲輔助堿提法提取了香菇柄蛋白。因此，先超聲后堿提法的結(jié)合可以更有效地提取食用菌蛋白。本試驗(yàn)結(jié)果表明，先超聲后堿提法所得榛蘑蛋白的提取率為66.72%，高于單獨(dú)堿提法的43.28%和單獨(dú)超聲法的23.33%。為進(jìn)一步提高提取率，進(jìn)行了先堿提后超聲法的實(shí)踐，并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面分析法是一種統(tǒng)計(jì)方法，能夠分析多種變量之間交互影響問題[22]。結(jié)果表明，先堿提后超聲相結(jié)合與單獨(dú)堿提法相比，蛋白提取率提高了76.96%。說明兩種方法之間有促進(jìn)作用，進(jìn)而使蛋白提取率有所提高。

傳統(tǒng)的蛋白沉淀方法多為等電點(diǎn)法[23]或鹽析法[24]。本試驗(yàn)將二者結(jié)合，結(jié)果表明，比單獨(dú)等電點(diǎn)和鹽析所得蛋白含量有明顯提高。其中，先等電點(diǎn)后鹽析所得蛋白的含量比單獨(dú)等電點(diǎn)法提高1.81倍。

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化法對超聲和堿提分步提取榛蘑蛋白工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到榛蘑蛋白的最佳提取工藝為液料比47∶1、堿提pH 10.0、堿提時(shí)間1.55 h、堿提溫度80 ℃、超聲功率200 W、超聲pH 9.0、超聲溫度30 ℃，此條件下蛋白的提取率為（76.59±0.23）%。榛蘑蛋白質(zhì)沉淀的方法為先進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀（pI=3.7），然后用90%的飽和硫酸銨進(jìn)行鹽析。本研究結(jié)果為榛蘑蛋白的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]OLSON B， MARKS D L， GROSSBERG A J. Diverging metabolic programmes and behaviours during states of starvation， protein malntrition， and cachexia[J].Journal of Cachexia， Sarcopenia and Muscle，2020，11（6）：1429-1446.

[2]TILMAN D， BALZER C， HILL J， et al. Global food demand and the sustainable intensification of agriculture[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（50）：20260-20264.

[3]SINGH M， TRIVEDI N， ENAMALA M K， et al. Plant-based meat analogue （PBMA） as a sustainable food： a concise review[J].European Food Research and Technology，2021，247（10）：2499-2526.

[4]CUI Q Y， NI X H， ZENG L， et al. Optimization of protein extraction and decoloration conditions for tea residues[J].Horticultural Plant Journal，2017，3（4）：172-176.

[5]ZHAO Y J， WEN C T， FENG Y Q， et al. Effects of ultrasound-assisted extraction on the structural， functional and antioxidant properties of Dolichos lablab L. protein[J].Process Biochemistry，2021，101：274-284.

[6]LUQUE-GARCIA J L， LUQUE DE CASTRO M D. Ultrasound： a powerful tool for leaching[J].Trends in Analytical Chemistry，2003，22（1）：41-47.

[7]李根，任國艷，李倩，等.超聲輔助提取鯢皮膠原蛋白工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)特征分析[J].食品工業(yè)科技，2021，42（22）：160-168.

[8]LI W Y， YANG H R， COLDEA T E， et al. Modification of structural and functional characteristics of brewer's spent grain protein by ultrasound assisted extraction[J].LWT-Food Science and Technology，2021，139：110582.

[9]GAO J L， WANG Y， YAN Y X， et al. Ultrasonic-alkali method for synergistic breakd own of excess sludge for protein extraction[J].Journal of Cleaner Production，2021，295：126288.

[10]楊林，王傳華，劉盼盼，等.天麻蜜環(huán)菌選擇性共生機(jī)理研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2020，40（15）：13-16.

[11]LIN Y E， WANG H L， LU K H， et al. Water extract of Armillaria mellea （Vahl） P. Kumm. alleviates the depression-like behaviors in acute- and chronic mild stress-induced rodent models via anti-inflammatory action[J].Journal of Ethnopharmacology，2021，265：113395.

[12]WU J， ZHOU J X， LANG Y G， et al. A polysaccharide from Armillaria mellea exhibits strong in vitro anticancer activity via apoptosis-involved mechanisms[J].International Journal of Biological Macromolecules，2021，51（4）：663-667.

[13]聶維.黑龍江榛蘑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及生長環(huán)境調(diào)查探究[J].種子科技，2021，39（5）：110-112.

[14]陳州莉，伍賢進(jìn)，田玉橋，等.蜜環(huán)菌活性成分及產(chǎn)品開發(fā)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品，2019（21）：25-29.

[15]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定：GB 5009.5－2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[16]劉俊紅，袁冰倩，李爽，等.超聲波-堿法提取小麥麩皮蛋白質(zhì)的工藝研究[J].食品工業(yè)，2018，39（9）：5-8.

[17]CHEMAT F， ROMBAUT N， SICAIRE A G， et al. Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms， techniques， combinations， protocols and applications－a review[J].Ultrasonics Sonochemistry，2016，34：540-560.

[18]袁莉婷，劉玉德，石文天，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助堿法提取海帶蛋白工藝[J].中國食品添加劑，2021，32（4）：23-33.

[19]吳興雨，馬佳，姚玥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取亞麻蛋白工藝[J].食品工業(yè)科技，2020，41（14）：166-171.

[20]姜伊悅，張小勇，崔泰花，等.元蘑蛋白的超聲輔助提取及結(jié)構(gòu)分析[J].食品科技，2019，44（8）：228-234.

[21]弓志青，王延圣，張璐，等.超聲波輔助提取香菇柄蛋白工藝優(yōu)化研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（11）：138-141.

[22]GEBRELUEL T， HE M L， ZHENG S Y， et al. Optimization of enzymatic degradation of deal ginated kelp waste through response surface methodology[J].Journal of Applied Phycology，2020，321：529-537.

[23]孫會(huì)剛，陳志軒，周中馳，等.響應(yīng)面法優(yōu)化大豆分離蛋白提取及復(fù)合酶解制備活性肽[J].中國調(diào)味品，2022，47（3）：82-87.

[24]彭志杰，杜嬌，張羽婷，等.提取方法對灰樹花粗蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（21）：161-166.