宋來生 郭蕾 孫浩 洪厚勝 郭會明

摘要：利用醋酸菌轉(zhuǎn)化食用酒精是生產(chǎn)高酸度醋的主要方法。目前，我國生產(chǎn)的高酸度酒精醋同國際領(lǐng)先水平還有差距?？s小差距、生產(chǎn)出酸度與質(zhì)量更高的酒精醋是國內(nèi)行業(yè)研究的熱題。酒精醋生產(chǎn)過程中使用的醋酸菌與營養(yǎng)鹽是影響發(fā)酵的重要因素。文章通過對高產(chǎn)酸醋酸菌的選育和酒精醋營養(yǎng)鹽的研究進行了綜述，為高酸度酒精醋的工業(yè)發(fā)展提供了一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高酸度醋；酒精醋；醋酸菌；營養(yǎng)鹽

中圖分類號：TS264.22? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0198-04

Abstract： Using acetic acid bacteria to convert edible alcohol is the main method to produce high-acidity vinegar. At present， there is still a gap between the high-acidity vinegar produced in China and the international leading level. Narrowing the gap and producing alcoholic vinegar with higher acidity and quality is a hot topic in domestic industry.Acetic acid bacteria and nutritive salt used in the production of alcoholic vinegar are important factors affecting fermentation. In this paper， the breeding of high acid-producing acetic acid bacteria and the research on alcoholic vinegar nutritive salt are reviewed， which has provided some references for the industrial development of high-acidity alcoholic vinegar.

Key words： high-acidity vinegar; alcoholic vinegar; acetic acid bacteria; nutritive salt

收稿日期：2022-11-27

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2012AA021201）

作者簡介：宋來生（1999-），男，碩士，研究方向：食品發(fā)酵技術(shù)。

*通信作者：郭會明（1967-），男，副教授，碩士，研究方向：生化反應工程。

古語有云“開門七件事，柴米油鹽醬醋茶”，由此可知在人們?nèi)粘Ｉ钪?，食醋具有十分重要的作用[1]。食醋不僅是餐桌上的酸性調(diào)味品，還能開胃消食，消毒殺菌，促進人體新陳代謝，消除疲勞，抑制血糖、血脂、血壓升高，預防動脈硬化，提高機體免疫力，同時還有延緩衰老，抑制脂肪積累等功能[2-4]。而高濃度的醋因其儲存運輸方便、殺菌能力強等特點，在食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、美容和家庭保潔業(yè)等方面有著廣泛的應用[5]。

高酸度醋主要有酒精醋與蒸餾醋。由于液態(tài)發(fā)酵設備的不斷改進以及國家頒布代糧發(fā)酵政策，酒精醋將成為我國食醋工業(yè)的主要支柱。因此，用食用酒精代替糧食發(fā)酵成醋是目前食醋行業(yè)研究的一大熱點[6]。涂志英等[7]報道了芥末、番茄醬和沙司等食品需要消耗大量的酒精醋。而目前我國番茄醬的消費仍呈上升趨勢，這也增加了酒精醋的需求量。酒精醋采用液態(tài)深層發(fā)酵直接轉(zhuǎn)化95%食用酒精為醋酸，時間、人力、成本都呈大幅下降趨勢，且極易推廣[8]，這些都將給酒精醋的發(fā)展帶來機遇。但生產(chǎn)高濃度的酒精醋，我國同德國、日本等國家還有較大差距。酒精醋發(fā)酵過程中所用的菌種和營養(yǎng)鹽，都會對最終產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。本文將對高酸度酒精醋發(fā)酵的菌種和營養(yǎng)鹽的相關(guān)研究進行綜述，為高酸度酒精醋的生產(chǎn)提供研究思路。

1 高產(chǎn)酸醋酸菌選育

醋酸菌是食醋釀造中的主要微生物，雖然它的比生長速率比較依賴乙醇的濃度，但高濃度的乙醇或醋酸會嚴重影響發(fā)酵過程中的醋酸菌。因此，選育出具有較強乙醇氧化能力、耐受性較好的菌種，可以提高產(chǎn)酸量，對高酸度酒精醋的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。目前對菌種的選育主要有3種方法：自然選育、誘變育種和基因工程技術(shù)[9]。

1.1 自然選育

自然選育是指對微生物群體不經(jīng)過處理而直接進行分離篩選的方法，又稱單菌落分離。對醋酸菌的自然選育是從醋醅中采集醋樣，用生理鹽水稀釋成不同濃度的發(fā)酵液，在含有碳酸鈣或溴甲酚紫的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，選取菌落形態(tài)較好的單菌落進行純化培養(yǎng)，直至得到大小形態(tài)一致的菌落，并斜面保藏，對斜面保藏的菌種進行產(chǎn)酸定性及定量分析，得到高產(chǎn)酸的純化醋酸菌種。

楊杰等[10]從廣西民間醋醅中初步篩選出5株產(chǎn)酸醋酸菌，經(jīng)過產(chǎn)酸分析，乙醇耐受、乙酸耐受及溫度耐受實驗，發(fā)現(xiàn)KDA-2產(chǎn)酸能力最強，且耐受性最好。在30 ℃時產(chǎn)酸量最大，為39.9 g/L，在36 ℃、9%乙醇條件下仍然可以較好地產(chǎn)酸。馮荊舒等[11]使用含溴甲酚紫的培養(yǎng)基從鎮(zhèn)江香醋醋醅中初步篩選出41株醋酸菌，經(jīng)過產(chǎn)酸定量實驗發(fā)現(xiàn)H3的產(chǎn)酸量始終高于其他菌株，為44.16 g/L，能夠耐受9%的乙醇和3%的乙酸。

經(jīng)過自然選育得到的菌株，雖然方式簡單，但菌株突變率很低，無法獲得新的醋酸菌，篩選出的菌種性狀往往不如工業(yè)上使用的純種AS1.41和滬釀1.01。

1.2 誘變育種

誘變育種在醋酸菌的工業(yè)化育種中發(fā)揮著重要作用，它是通過使用各種物理或化學誘變劑來增加突變率，然后產(chǎn)生陽性突變菌株，進而篩選出耐受性好、產(chǎn)酸高的菌株的一種方法。

野生型工業(yè)醋酸菌經(jīng)過酸性脅迫和紫外線誘變處理，得到的突變體進化出更高的耐性和產(chǎn)酸能力。突變體可耐受60 g/L的初始酸度，比野生型增加了33%。在搖瓶中發(fā)酵時，最大乙酸積累量達到103.81 g/L，同時突變株的ADH和ALDH活性比野生型高20%～40%[12]。李文等[13]在腐爛的獼猴桃中篩選出一株產(chǎn)酸量高且耐醇耐溫較好的菌株，利用能量為10 keV，劑量為70×2.6×1013 ions/cm2的N+進行誘變試驗，從變異菌株后代中篩選出一株產(chǎn)酸高、能耐40 ℃高溫、耐高醇12%且遺傳穩(wěn)定的菌種。產(chǎn)酸量較傳統(tǒng)釀造提高了30.54%，醇酸轉(zhuǎn)化率提高了18.81%。鄧洪鈞等[14]從山西老陳醋醋醅中篩選出一株耐受40 ℃的巴氏醋桿菌，利用常溫等離子體對菌株進行誘變處理，選育出較高產(chǎn)酸的菌株進行發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)誘變后的菌株比誘變前發(fā)酵效率提高了10%。Wei等[15]使用鹽酸羥胺和紫外線誘變產(chǎn)生兩個突變?nèi)后w。然后，通過融合兩個群體的原生質(zhì)體，對兩個突變?nèi)后w的基因組進行重組，并在乙醇濃度較高的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。獲得了一株能在含13%乙醇的液體培養(yǎng)基中生長、產(chǎn)酸能力是野生型菌株2倍的突變醋酸菌。

使用誘變育種對醋酸菌進行選育，突變頻率較高，可以獲得新的菌株，但無法控制突變方向，耗時較長，產(chǎn)生負突變的菌株占有較大的比例。

1.3 基因工程技術(shù)

基因工程對于醋酸菌的改良是極具潛力的一種技術(shù)，它可以通過對某一基因片段的擴增或敲除來精確修飾醋酸菌的基因，從而實現(xiàn)有目的的菌種改良，得到產(chǎn)酸高、耐性優(yōu)良的醋酸菌[16]。一般來說，對醋酸菌的基因改造可分為以下幾個方面：優(yōu)化代謝途徑、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和提高耐受性[17]。

1.3.1 優(yōu)化代謝途徑

通過優(yōu)化代謝途徑，可以提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，并減輕底物或產(chǎn)物的反饋抑制。隨著醋酸持續(xù)發(fā)酵，乙酸引起的酸脅迫會破壞細胞膜，抑制多種酶和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)活性，大大降低醋酸菌的生產(chǎn)效率。依賴于吡咯喹啉醌（PQQ）的膜結(jié)合乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）是醋酸菌將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸的兩種關(guān)鍵酶，而且在耐酸醋酸菌中ADH的含量明顯高于其他菌株[18]。因此，通過過度表達ADH、ALDH或PQQ，優(yōu)化醋酸的代謝途徑，可以有效地提高醇酸轉(zhuǎn)化率，增加醋酸產(chǎn)量。宋山等[19]對醋酸菌的乙醇脫氫酶通過PCR技術(shù)進行基因擴增，使得乙醇脫氫酶得以過表達。結(jié)果表明，在相同條件下，改良后的醋酸菌在醇酸轉(zhuǎn)化率和乙醇耐受程度上都高于原始菌。Beppu[20]對一株耐酸醋酸菌的ALDH基因進行擴增，發(fā)酵結(jié)果表明醋酸發(fā)酵速率由1.8 g/（L·h）提高至4.0 g/（L·h），產(chǎn)生醋酸最大濃度為96.9 g/L，與對照相比高出了1.4倍左右。Gao等[21]對巴氏醋桿菌中乙醇氧化途徑和PQQ合成途徑中兩個模塊的基因進行各種組合過度表達，來平衡脫氫酶與輔助因子的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)同時過表達ADH與pqqABCDE的巴氏醋桿菌相較其他過表達菌株在含有3%初始乙酸的培養(yǎng)基中生長速率最高，在半連續(xù)發(fā)酵過程中啟動時間最短，平均生產(chǎn)率最高。

由于醋酸菌耐酸機制中對醋酸的同化作用，當A.aceti在含有1%乙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，三羧酸循環(huán)（TCA）中烏頭酸酶會顯著上調(diào)。于是Nakano等[22]對該現(xiàn)象進行了深入研究，通過對烏頭酸酶的基因進行擴增，使烏頭酸酶的活性增強，優(yōu)化三羧酸循環(huán)途徑，進而生產(chǎn)更高濃度的醋酸，并縮短生長滯后時間。Yang等[23]首次發(fā)現(xiàn)乙酸濃度增加時，2-甲基檸檬酸循環(huán)相關(guān)的操縱子基因明顯上調(diào)，推測2-甲基檸檬酸循環(huán)可能對醋酸菌的耐酸性具有潛在的貢獻。雖然沒有通過修飾基因來證實這一結(jié)論，但可以為醋酸菌的基因工程育種提供一定經(jīng)驗。

1.3.2 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子

當醋酸菌所處的外界環(huán)境發(fā)生變化時，可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡對環(huán)境變化作出反應，并優(yōu)化其代謝以適應新的條件。近年來，許多研究人員試圖通過工程轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白直接或間接地操縱轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，來增強醋酸菌的生產(chǎn)效率及耐受能力[24]。在G. intermedius中發(fā)現(xiàn)了一種基于N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）的群體感應系統(tǒng)GinI/GinR。其中GinI用來指導3種具有不同?；湹腁HL的合成，而GinR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，通過與AHL結(jié)合參與抑制乙酸和葡萄糖酸的產(chǎn)生。Iida等[25]為了提高G. intermedius在含乙醇的培養(yǎng)基中的生長速度，對GinI和GinR進行了破壞，破壞后的菌株的乙酸和葡萄糖酸產(chǎn)量分別比原始菌株提高了42%和16%，而且具有更強的消泡能力。

1.3.3 提高耐受性

在醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌不可避免地暴露在各種應激源中，比如高溫、乙醇和醋酸，這些因素會抑制醋酸菌的生長和代謝。但當醋酸菌受到刺激時，一些熱休克蛋白和核苷酸修復蛋白會被反復上調(diào)，以此提高醋酸菌的耐受性，提升醋酸產(chǎn)量。因此，可以通過對應激蛋白基因的修飾，對醋酸菌耐溫，耐酸有關(guān)的因素進行定向的構(gòu)建和表達，優(yōu)化醋酸菌的耐受性，得到抗逆性狀優(yōu)良的菌種。

DnaK、DnaJ和GrpE是醋酸菌耐熱機制中研究較多的熱休克蛋白，三者相互作用，一起調(diào)節(jié)分子伴侶的活性，當醋酸菌受到外部環(huán)境變化刺激時會做出應激反應。Ishikawa等[26]對不同應激源下巴氏醋桿菌GrpE、DnaK和DnaJ 3個基因的相對表達水平進行了測定，在溫度從30 ℃變?yōu)?2 ℃過程中，3種基因的mRNA水平均有提高。在4%乙醇刺激下，也得到了相同結(jié)論。然后對不同應激條件下3種基因過度表達，來觀察對醋酸菌生長的影響，結(jié)果顯示，當GrpE與DnaK-DnaJ共同過度表達時，即使在42 ℃高溫環(huán)境下，醋酸菌的生長行為與最適條件下幾乎相同。Zheng等[27]發(fā)現(xiàn)乙酸能上調(diào)核酸修復蛋白UvrA的表達，于是構(gòu)建了UvrA敲除菌株和過表達菌株讓其在含有乙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過度表達UvrA菌株的生長量明顯高于敲除菌株，即使在6%乙酸條件下，前者的存活率也高于后者。同時，過度表達UvrA的巴氏醋桿菌較野生型菌的醋酸轉(zhuǎn)化率提高了21.7%。

醋酸菌細胞膜上存在一種由乙酸誘導的蛋白質(zhì)AatA，它是一種ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白，可以利用ATP水解的能量使細胞內(nèi)的有毒化合物排出，使細胞內(nèi)乙酸濃度處于較低水平，避免大量乙酸引起的反饋抑制使細胞凋亡。 Nakano等[28]通過對醋酸菌中AatA基因的過表達，增強了醋酸菌的耐酸性，使得過表達后的醋酸菌在90 g/L醋酸濃度下的產(chǎn)酸速率與40 g/L條件下幾乎相同，最終產(chǎn)酸量達到117 g/L。

相較于自然選育與誘變育種，基因工程技術(shù)具有高效、快捷的優(yōu)越性，不僅可以精確修飾微生物靶基因，還可以將分離出的基因?qū)氲搅硪痪w中，從而準確有效地構(gòu)建出性狀更為優(yōu)良的醋酸工程菌，對推動高酸度酒精醋的工業(yè)發(fā)展有重要意義。

2 高酸度酒精醋發(fā)酵營養(yǎng)鹽

酒精醋發(fā)酵液中除了乙醇外，沒有任何其他物質(zhì)。而乙醇不能夠滿足醋酸菌的生長代謝，所以在酒精醋發(fā)酵過程中需要添加其他營養(yǎng)物質(zhì)來支持醋酸菌的生理活動，如碳源、氮源、生長因子等[29]。醋酸菌的發(fā)酵效果與醋的品質(zhì)皆受到營養(yǎng)鹽的影響，因此，想要生產(chǎn)高酸度的酒精醋就要使用能夠提升醋酸菌發(fā)酵效率的營養(yǎng)鹽。當前食醋行業(yè)一般使用德國Frings營養(yǎng)鹽，價格昂貴，經(jīng)濟成本較高。因此，國內(nèi)也對研制出一種既能使醇酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸速率提高，又能減少生產(chǎn)成本的營養(yǎng)鹽做了許多研究。

無機元素作為構(gòu)成生物體的重要組成成分，有著維持酸堿平衡與滲透壓的作用。因此，以葡萄糖為碳源，酵母粉為氮源，添加無機離子的營養(yǎng)鹽成為許多工作者的研究方向。張錦林等[30]發(fā)明了一種醋酸菌營養(yǎng)素用于液態(tài)食醋發(fā)酵酸化過程，其配方為葡萄糖76.3%、水解酵母粉15.2%、磷酸銨4.0%、硫酸銨2.0%、醋酸銨1.25%、檸檬酸銨1.25%。楊海麟等[31]優(yōu)化的營養(yǎng)鹽產(chǎn)酸速率達到2 g/（L·h），相對當時的國內(nèi)生產(chǎn)水平提高了33%，其組成為44.8%葡萄糖、26.5%酵母粉、15.5%檸檬酸銨、3.7% NaH2PO4、4.2% KH2PO4、5.3% MgSO4。張曉輝等[32]則采用自制營養(yǎng)鹽與Frings營養(yǎng)鹽以8∶2的比例混合進行發(fā)酵，發(fā)酵周期相當?shù)耐瑫r節(jié)約了13.7%的成本。除此之外，也可以通過添加某些氨基酸或醋酸菌代謝過程中相關(guān)因子的前體來配制營養(yǎng)鹽，實現(xiàn)高效率發(fā)酵。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，在細胞生長代謝中起著重要的作用，而且培養(yǎng)基中游離的氨基酸是醋酸菌的良好氮源。Yin等[33]在葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基中分別添加了16種氨基酸，發(fā)現(xiàn)Asp、Glu能顯著促進細胞生長，生物量分別比對照組高1.04倍和0.51倍，產(chǎn)酸量分別提高了1.45倍和0.6倍。通過蛋白組學分析，添加Asp和Glu后可以通過促進磷酸戊糖和NADPH的生成來提高巴氏桿菌的抗酸應激能力，從而在整個磷酸戊糖途徑（PPP）中合成核酸、脂肪酸和谷胱甘肽（GSH），加強氨基酸脫氨作用，提高細胞內(nèi)氨濃度，維持細胞內(nèi)pH的穩(wěn)定性，促進核酸合成和修復酸脅迫損傷引起的受損DNA，提高醋酸菌的耐受性，使產(chǎn)酸量增加。

添加代謝過程中相關(guān)因子的前體，醋酸菌不需要通過自身合成便可直接利用前體物質(zhì)，可以減輕在代謝過程中的壓力，發(fā)酵效率也會因此而提升。血紅素廣泛存在于乙醇呼吸系統(tǒng)的酶中，并通過氧化還原電位變化在電子傳遞中發(fā)揮主要作用，而亞鐵離子是構(gòu)成血紅素的物質(zhì)之一。輔酶Q是醋酸桿菌乙醇呼吸鏈中唯一可自由穿梭的電子傳遞載體，β-羥基苯甲酸是輔酶Q的前體之一。因此，可以向培養(yǎng)基中加入這些前體物質(zhì)來增強乙醇呼吸鏈，提高醋酸發(fā)酵效率。Qi等[34]在葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基中加入FeSO4與β-羥基苯甲酸，縮短了發(fā)酵時間，產(chǎn)酸速率較原始水平提升了20%，并且ADH、ALDH活性與輔酶Q9的含量分別提高了31%、33%和102%。Yin等[35]認為亞鐵離子和葛根花提取物對ADH和ALDH的代謝有激活促進作用，于是向葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基中分別加入FeSO4與葛根花提取物，產(chǎn)酸量分別提升了17.3%和13.2%。以上工作雖然沒有研究營養(yǎng)鹽的具體配方，但表明了向發(fā)酵液中加入醋酸菌代謝過程中相關(guān)因子前體或相關(guān)酶的促進劑，可以改善發(fā)酵效率，提高醋酸產(chǎn)量，為后續(xù)營養(yǎng)鹽的研發(fā)提供了經(jīng)驗。

3 結(jié)論與展望

醋酸菌是一種催化乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜岬纳锎呋瘎胍岣甙l(fā)酵效率就要對催化劑進行優(yōu)化，即對產(chǎn)酸量高、耐受性好的醋酸菌進行篩選育種。目前主要有3種技術(shù)：自然選育、誘變育種和基因工程技術(shù)。其中，基因工程技術(shù)是培育優(yōu)良醋酸菌比較好的方法，具有較強的針對性，可以對醋酸菌代謝過程中某些相關(guān)基因進行定向修飾，對高酸度酒精醋的發(fā)展具有重要意義。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因分離、克隆和重組等技術(shù)，對醋酸菌各功能基因進行人為構(gòu)建，得到在常溫條件下產(chǎn)酸更高的菌株將成為可能。

營養(yǎng)鹽是影響高酸度酒精醋發(fā)酵的一個重要因素，目前國內(nèi)酒精醋行業(yè)一般使用的是德國Frings營養(yǎng)鹽，但是生產(chǎn)成本較高。國內(nèi)也對酒精醋營養(yǎng)鹽做了許多研究，雖然成本具有一定優(yōu)勢，但發(fā)酵效果與Frings營養(yǎng)鹽還有差距。因此，基于醋酸菌生長代謝的營養(yǎng)需求研發(fā)出一種達到國際水平且能降低生產(chǎn)成本的營養(yǎng)鹽，對我國高酸度酒精醋工業(yè)發(fā)展具有重要意義。

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