董彩文 王明雷 何夢(mèng)宇 蔡祎珂 胡夢(mèng)瀟 魏濤

摘要：采用弱交變磁場(chǎng)輔助優(yōu)化植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵油菜蜂花粉，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了發(fā)酵溫度、植物乳桿菌菌液濃度、磁場(chǎng)處理時(shí)間、磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的影響。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃、菌液OD值為1.0、磁場(chǎng)處理時(shí)間為4.28 h、磁場(chǎng)強(qiáng)度為3.3 mT時(shí)，此條件下發(fā)酵后花粉提取液中的蛋白含量為9.534 mg/g，較空白組提高了44.1%，且與優(yōu)化條件下得到的理論值相差較小，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：交變磁場(chǎng)；固態(tài)發(fā)酵；植物乳桿菌；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS202.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）05-0189-05

Abstract： Using weak alternating magnetic field as an auxiliary way to optimize the solid-state fermentation of rape bee pollen by Lactobacillus plantarum， the effects of fermentation temperature， solution concentration of Lactobacillus plantarum， magnetic field treatment time and magnetic field intensity on the solid-state fermentation of bee pollen are investigated by single factor test. The results of the response surface optimization show that when the fermentation temperature is 35 ℃， the OD value of the bacterium solution is 1.0， the magnetic field treatment time is 4.28 h， and the magnetic field intensity is 3.3 mT， the protein content in the pollen extract after fermentation under such conditions is 9.534 mg/g， which is 44.1% higher than that in the blank group. The difference between the theoretical value and practical value is small， indicating that the optimized results are reliable.

Key words： alternating magnetic field; solid-state fermentation; Lactobacillus plantarum; respone surface design

收稿日期：2022-11-29

基金項(xiàng)目：2021年度中原科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（224200510017）；鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程特色骨干學(xué)科群高水平成果培育項(xiàng)目；鄭州輕工業(yè)大學(xué)校第十一批校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：董彩文（1970-），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：魏濤（1980-），男，教授，博士，研究方向：食品酶技術(shù)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

蜂花粉主要是工蜂在采集花蜜和花粉時(shí)，自身攜帶的正電荷與花朵的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電場(chǎng)，從而能吸附花粉粒，再由蜜蜂唾液分泌物黏結(jié)而成的花粉團(tuán)[1-2]。蜂花粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有人類(lèi)必需氨基酸及很多活性成分，如蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、黃酮等，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3-5]。蜂花粉不僅能為人們提供營(yíng)養(yǎng)，而且具有預(yù)防腫瘤、預(yù)防前列腺炎、降血糖、血脂等特性[6-7]。

近年來(lái)，以蜂花粉作為食品添加劑的產(chǎn)品層出不窮，如蜂花粉面包、蜂花粉飲料、蜂花粉酸奶、蜂花粉啤酒等。將蜂花粉添加到食品中，既能提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又能起到調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味的作用[8]。但是，蜂花粉的細(xì)胞壁堅(jiān)硬，直接添加在食品中既影響蜂花粉內(nèi)容物的釋放，又會(huì)影響人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收[9]。因此，對(duì)花粉進(jìn)行破壁處理能夠提高花粉作為食品添加劑的效率。目前常用的蜂花粉生物破壁的方法是微生物發(fā)酵破壁，微生物發(fā)酵是處理蜂花粉的核心環(huán)節(jié)，發(fā)酵的條件、方式都會(huì)直接影響蜂花粉發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化[10]。目前大多數(shù)蜂花粉發(fā)酵工藝的探究中以蜂花粉的液態(tài)發(fā)酵為主，對(duì)蜂花粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。

磁場(chǎng)輔助微生物發(fā)酵技術(shù)成為人們?nèi)找骊P(guān)注的研究方向，研究表明弱交變磁場(chǎng)應(yīng)用于生物發(fā)酵過(guò)程中能促進(jìn)生物量及其有益代謝產(chǎn)物的積累[11-13]。低頻磁場(chǎng)輔助釀酒酵母發(fā)酵可使乙醇產(chǎn)量提高17%[14]，也可促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，使乳酸鏈球菌產(chǎn)量增加[15]。研究發(fā)現(xiàn)弱磁場(chǎng)對(duì)微生物酶的作用是確切的，其中弱磁場(chǎng)能夠影響微生物細(xì)胞酶活性和離體酶活性進(jìn)而提高微生物的發(fā)酵效率[16]，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的輔助發(fā)酵方式。目前文獻(xiàn)中尚未發(fā)現(xiàn)利用弱交變磁場(chǎng)輔助蜂花粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

因此，本研究通過(guò)弱交變磁場(chǎng)輔助植物乳桿菌用于蜂花粉的固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)過(guò)單因素考察不同因素對(duì)發(fā)酵前后花粉提取液中蛋白含量的影響，然后選擇響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件，并對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。該試驗(yàn)通過(guò)研究發(fā)酵前后蜂花粉中有益成分的變化，旨在提高花粉作為添加劑的效率，為今后生產(chǎn)蜂花粉產(chǎn)品提供部分理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

油菜蜂花粉：購(gòu)于河南省長(zhǎng)葛市；植物乳桿菌：實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑

磷酸（分析純）：天津市永大化工試劑制造廠；考馬斯亮藍(lán)試劑G-250（分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；牛血清蛋白（生物試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

磁場(chǎng)冷凍冷藏箱 英都斯特（無(wú)錫）感應(yīng)科技有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LX-C35L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZHP-250型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基的制備

MRS液態(tài)培養(yǎng)基：按照MRS液態(tài)培養(yǎng)基配方，配好后于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.4.2 菌種的培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上將凍存在甘油中的植物乳桿菌接種于10 mL MRS液態(tài)培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。吸取菌懸濁液0.1 mL，將其稀釋后涂布于MRS平板上，置于35 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后挑取單菌落到100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h。

1.4.3 蛋白含量的測(cè)定

1.4.3.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[17]

參照聶昌宏等的方法測(cè)粗蛋白，稍作修改。采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法，標(biāo)準(zhǔn)品采用牛血清蛋白，制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

1.4.3.2 花粉提取液中蛋白的制備及測(cè)定

取1 g發(fā)酵后的花粉，加入10 mL蒸餾水，置于恒溫水浴振蕩器中，35 ℃水浴振蕩1 h。取出樣品溶液8 000 r離心10 min，取0.1 mL上清液，參照1.4.3.1的操作方法測(cè)其吸光度，蛋白含量計(jì)算見(jiàn)下式：

ρ=m×vm1×v1。

式中：ρ為蛋白含量，mg/g；m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的蛋白質(zhì)量，mg；v為提取液的總體積，mL；m1為樣品鮮重，g；v1為測(cè)定時(shí)取用提取液的體積，mL。

1.4.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺(tái)上取滅菌花粉分別放入12個(gè)錐形瓶中，每瓶20 g，然后依次加入菌液2.5 mL，無(wú)菌水5 mL，攪勻，分別在31，33，35，37，39 ℃條件下培養(yǎng)8 d。每個(gè)條件處理2瓶，作為平行試驗(yàn)；空白組用MRS液體培養(yǎng)基代替菌懸濁液，其他條件與試驗(yàn)組一致。按照1.4.3.2的方法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。

1.4.4 菌液濃度對(duì)花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺(tái)上取滅菌花粉分別放入12個(gè)錐形瓶中，每瓶20 g，分別加入OD值為0.7，1.0，1.3，1.6，1.9的菌液2.5 mL，無(wú)菌水5 mL，在35 ℃條件下培養(yǎng)8 d。每個(gè)條件處理2瓶，作為平行試驗(yàn)；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法分別進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。

1.4.5 磁場(chǎng)處理時(shí)間對(duì)花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺(tái)上取滅菌花粉分別放入12個(gè)錐形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值為1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量為30%，無(wú)菌水5 mL，攪勻。接種完成后，分別在磁場(chǎng)強(qiáng)度為4 mT下處理1，2，3，4，5 h。在35.0 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至8 d。每個(gè)條件處理2瓶，作為平行試驗(yàn)；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。

1.4.6 磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)花粉提取液蛋白含量的影響

在超凈工作臺(tái)上取滅菌花粉分別放入12個(gè)錐形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值為1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量為30%，無(wú)菌水5 mL，攪勻。接種完成后分別在1，2，3，4，5 mT的磁場(chǎng)強(qiáng)度下處理4 h。在35.0 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至8 d。每個(gè)條件處理2瓶，作為平行試驗(yàn)；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。

1.4.7 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取3個(gè)對(duì)花粉蛋白生成影響較大的因素，選擇 Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果用Origin 2018進(jìn)行分析，利用Design-Expert 10軟件對(duì)工藝參數(shù)的組合進(jìn)行優(yōu)化，確定油菜蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件。利用響應(yīng)面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平行試驗(yàn)的平均值，使用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組與組之間的方差分析，在置信區(qū)間（95%）內(nèi)分析各組之間是否顯著，用相同或不同字母表示不顯著或顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)花粉提取液中蛋白含量的影響

發(fā)酵溫度是發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌參與反應(yīng)的重要因素之一，發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的黃酮有一定影響。發(fā)酵溫度與花粉提取液蛋白含量的關(guān)系見(jiàn)圖1。

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從31 ℃升至35 ℃時(shí)，蛋白含量明顯上升。當(dāng)發(fā)酵溫度從35 ℃升至39 ℃時(shí)，蛋白含量顯著下降。原因是發(fā)酵溫度影響了菌種的活性，進(jìn)而影響發(fā)酵的質(zhì)量，也可能是一些熱敏蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致蛋白含量降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他4組試驗(yàn)在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。綜上所述，初步確定35 ℃為合適的發(fā)酵溫度。

2.2 菌液濃度對(duì)花粉提取液中蛋白含量的影響

發(fā)酵液中植物乳酸菌的濃度會(huì)影響花粉發(fā)酵的結(jié)果，當(dāng)菌液濃度過(guò)低時(shí)，花粉發(fā)酵周期長(zhǎng)，花粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放不完全。當(dāng)菌液濃度過(guò)高時(shí)，又會(huì)使菌體自身過(guò)多地消耗花粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成發(fā)酵后一些營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)偏低。菌液濃度與花粉提取液蛋白含量的關(guān)系見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)菌液的OD值為0.7～1.0時(shí)，蛋白含量隨著菌液濃度的升高呈上升趨勢(shì)，菌液的OD值為1.0～1.6時(shí)，蛋白含量下降趨勢(shì)明顯，但菌液的OD值在1.6～1.9時(shí)蛋白含量又上升，原因可能是菌液過(guò)濃，菌體自身溶解釋放了部分蛋白。當(dāng)菌液的OD值為1.0時(shí)花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他組在95%的置信區(qū)間內(nèi)均有顯著性差異。因此，初步確定最佳的菌液OD值為1.0。

2.3 磁場(chǎng)處理時(shí)間對(duì)花粉提取液中蛋白含量的影響

交變磁場(chǎng)在一定條件下對(duì)微生物生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，但如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能有抑制或殺滅作用。磁場(chǎng)處理時(shí)間與花粉提取液蛋白含量的關(guān)系見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白含量呈上升趨勢(shì)，在4 h之后先上升后下降，下降不顯著；當(dāng)磁場(chǎng)處理時(shí)間為4 h時(shí)花粉提取液中的蛋白含量達(dá)到最高，并且與其他4組試驗(yàn)在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白含量降低，磁場(chǎng)處理時(shí)間延長(zhǎng)與蛋白含量下降之間的具體作用機(jī)理尚不清楚。比較廣泛研究的理論是長(zhǎng)時(shí)間的磁場(chǎng)處理改變了細(xì)胞膜、某些分子（生物大分子等）和自由基的理化性質(zhì)，對(duì)細(xì)胞造成損害[18-19]。還有一種原因可能是發(fā)酵環(huán)境中的極性大分子在交變磁場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間的作用下發(fā)生機(jī)械旋轉(zhuǎn)，內(nèi)能增加，致使發(fā)酵溫度上升（與微波加熱原理相似），熱效應(yīng)導(dǎo)致微生物活性降低進(jìn)而影響發(fā)酵質(zhì)量。綜上所述，初步確定合適的磁場(chǎng)處理時(shí)間為4 h。

2.4 磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)花粉提取液中蛋白含量的影響

磁場(chǎng)強(qiáng)度的強(qiáng)弱對(duì)微生物活性的影響具有兩面性，適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)強(qiáng)度通過(guò)影響酶的活性進(jìn)而可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成；反之則不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。磁場(chǎng)強(qiáng)度與花粉提取液蛋白含量的關(guān)系見(jiàn)圖4。

由圖4可知，蛋白含量隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增強(qiáng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為3 mT時(shí)花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他試驗(yàn)組在95%的置信區(qū)間內(nèi)差異顯著。3 mT之后蛋白含量隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增強(qiáng)而減小。作用機(jī)理尚不清楚，基于細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磁場(chǎng)作用機(jī)制，磁場(chǎng)強(qiáng)度的大小能夠通過(guò)調(diào)整細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到干擾[20]，通過(guò)影響微生物細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響微生物發(fā)酵蜂花粉的質(zhì)量。綜合考慮，初步確定合適的交變磁場(chǎng)處理強(qiáng)度為3 mT。

2.5 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的條件進(jìn)行了三因素三水平試驗(yàn)，由響應(yīng)面分析得到17組試驗(yàn)條件，每組做2次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到蛋白含量（Y）對(duì)自變量菌液OD值（A）、磁場(chǎng)強(qiáng)度（B）和磁場(chǎng)處理時(shí)間（C）的多元回歸方程：Y=9.24+0.024A+0.54B+0.63C+5.000E－003AB+0.058AC+0.080BC－0.19A2－0.47B2－0.61C2。

由表3可知，模型的F值為415.46，P值小于0.000 1，說(shuō)明此模型的回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)的P=0.085>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，該模型的模擬性較好，模型選擇合理。模型中變量B、C、A2、B2和C2對(duì)蛋白含量的影響均極顯著（P<0.000 1），說(shuō)明試驗(yàn)影響因素與響應(yīng)值不是一般的線(xiàn)性關(guān)系，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及B和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值均有很大的影響。模型中的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.995 7，預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)RPred2=0.976 1，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)與預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)差值小于0.2，說(shuō)明二者有很好的相符度。信噪比為64.34＞4，說(shuō)明本模型的試驗(yàn)結(jié)果可靠。由表3可知，對(duì)花粉提取液中蛋白含量的影響因素主次順序?yàn)椋篊（磁場(chǎng)處理時(shí)間）＞B（磁場(chǎng)強(qiáng)度）＞A（菌液OD值）。綜上所述，回歸方程為蛋白含量提供了一個(gè)合適的回歸模型。

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert軟件求解該模型，得出最佳菌液的OD值為1.0，磁場(chǎng)強(qiáng)度為3.31 mT，磁場(chǎng)處理時(shí)間為4.28 h。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)再次進(jìn)行蜂花粉固態(tài)發(fā)酵，為滿(mǎn)足實(shí)際操作，將菌液OD值調(diào)整為1.0，磁場(chǎng)強(qiáng)度調(diào)整為3.3 mT，磁場(chǎng)處理時(shí)間調(diào)整為4.28 h。在此發(fā)酵條件下花粉提取液蛋白含量理論值為9.583 mg/g。對(duì)此發(fā)酵工藝條件重復(fù)2次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終花粉提取液蛋白含量為9.534 mg/g，實(shí)際測(cè)定值與預(yù)測(cè)值相差較小，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化得到的參數(shù)可靠。

2.5.3 發(fā)酵前后蛋白含量的變化

空白組用MRS液體培養(yǎng)基代替菌懸濁液，其他條件與試驗(yàn)組一致。得到空白組花粉提取液中蛋白含量的平均值為6.614 mg/g，響應(yīng)面優(yōu)化條件下花粉提取液中蛋白含量的實(shí)際值為9.534 mg/g，較空白組提升了44.1%，這也說(shuō)明了磁場(chǎng)輔助發(fā)酵是可行的，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的發(fā)酵方式。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用弱交變磁場(chǎng)輔助優(yōu)化蜂花粉固態(tài)發(fā)酵，有利于細(xì)胞內(nèi)蛋白物質(zhì)溶出，提高了花粉提取液中蛋白的含量。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，最終確定最優(yōu)條件組合為菌液發(fā)酵溫度35 ℃、菌液OD值1.0、磁場(chǎng)處理時(shí)間4.28 h、磁場(chǎng)強(qiáng)度3.3 mT。在此條件下，發(fā)酵后花粉提取液中的蛋白含量9.534 mg/g較空白組的6.614 mg/g提高了44.1%，通過(guò)研究可知，交變磁場(chǎng)在輔助油菜蜂花粉固態(tài)發(fā)酵方面有一定的優(yōu)勢(shì)，該結(jié)果為交變磁場(chǎng)輔助微生物發(fā)酵提供了一定的參考，為蜂花粉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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