尹 碩，羅雪婷，李秋梅，潘洪吉，吳 迪

(北京市植物保護(hù)站，北京 100029)

茶樹菇學(xué)名柱狀田頭菇(Agrocybeaegerita)，此真菌多野生于油茶樹枯干，故得名茶樹菇。茶樹菇不僅食用味道獨(dú)特鮮美，且蛋白質(zhì)含量高、富含多種氨基酸及B族維生素[1]，具有較高的食藥用價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊。茶樹菇栽培過程中極易受到菇蚊、菇蠅、螨蟲、雜菌等有害生物的危害，其中以菇蚊、菇蠅發(fā)生普遍且嚴(yán)重，防治不及時(shí)可極大地影響產(chǎn)量甚至絕收[2-4]。

我國(guó)登記在食用菌上的農(nóng)藥產(chǎn)品共有45個(gè)，涉及農(nóng)藥有效成分18種，食用菌：氯氟·甲維鹽(有效成分為：高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽)，蘑菇：噻菌靈，噻霉酮和咪鮮胺錳鹽，平菇：吡唑醚菌酯，代森聯(lián)，二氯異氰尿酸鈉(可溶粉劑)，三十烷醇，滅蠅胺，赤霉酸和春雷霉素，雙孢菇：呋蟲胺和吡丙醚，香菇：咪鮮胺，靈芝：多菌靈，菇房：腐霉利，百菌清和二氯異氰尿酸鈉(煙劑)。其中在食用菌上登記的僅有1 種殺蟲劑氯氟·甲維鹽乳油，很難滿足生產(chǎn)需要。

噻蟲嗪作為種第二代新煙堿類高效低毒殺蟲劑，對(duì)害蟲具有胃毒、觸殺及內(nèi)吸活性，可有效防治蚊蠅類等害蟲[5]。JMPR報(bào)告中規(guī)定噻蟲嗪的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義為噻蟲嗪和噻蟲胺[6]。噻蟲胺既是噻蟲嗪的主要代謝產(chǎn)物，也是一種登記使用的新煙堿類殺蟲劑[7-8]。我國(guó)尚未制定噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺在食用菌中的殘留測(cè)定方法及相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)噻蟲嗪及其代謝物的殘留檢測(cè)方法主要有液相色譜法[9-10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]等，對(duì)其在茶樹菇中農(nóng)藥殘留的研究尚未見報(bào)道。本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)同時(shí)針對(duì)茶樹菇和及其菌棒中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其殘留消解動(dòng)態(tài)及最終殘留進(jìn)行了研究，旨在為其科學(xué)合理使用以及制定最大殘留限量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 LC-MS 8045型三重四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；TDL-40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)；RJ-TDL-40B低速臺(tái)式離心機(jī)；DFY-500C型粉碎機(jī)；QL-901旋渦混合器。

噻蟲嗪(thiamethoxam)、噻蟲胺(clothianidin)標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心 (沈陽(yáng))；30%噻蟲嗪懸浮劑。

乙腈，色譜純；C18、PSA：40～63 μm；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉，分析純。

1.2 田間試驗(yàn)

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 試驗(yàn)小區(qū)面積5 m2，設(shè)立2個(gè)重復(fù)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)菌棒數(shù)約為400個(gè)，出菇后噴霧施藥1次；施藥劑量噻蟲嗪0.009 g a.i./m2，分別于施藥后2 h及1、2、3、5、7、10、14、21、28 d取蘑菇和菌棒樣品。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 設(shè)4個(gè)不同施藥劑量和不同施藥次數(shù)的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積5 m2，菌棒數(shù)量約400個(gè)，以噻蟲嗪有效成分0.009、0.013 5 g a.i./m2的計(jì)量施藥2～3次，施藥間隔期7 d。于末次施藥間隔3、5、7、10 d取茶樹菇和菌棒樣品。另設(shè)對(duì)照區(qū)，不施藥，采集對(duì)照樣品。

1.2.3 采樣方法 茶樹菇的采集：在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)以“對(duì)角線法”取不同位置采集12個(gè)點(diǎn)的生長(zhǎng)正常的茶樹菇樣本，總量≥1 kg，粉碎混勻后四分法縮分，裝入封口樣品容器中，于-20℃保存，待測(cè)。

菌棒的采集：在小區(qū)內(nèi)選擇對(duì)角線上6個(gè)點(diǎn)，取走整包菌棒。菌棒從出菇頂分為上(0～5 cm)，中(5～10 cm)，下(10～15 cm)三段，分別粉碎，裝入封口樣品容器中，于-20℃保存，待測(cè)。

1.3 樣品前處理方法 稱取茶樹菇樣品10 g，加入10.0 mL乙腈、3 g氯化鈉，渦旋5 min，以3 800 r/min離心5 min，取1 mL上清液，加入50 mg C18、50 mg PSA、50 mg無(wú)水MgSO4，渦旋1 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)系濾膜，待LC-MS/MS分析測(cè)定。

稱取菌棒樣品5 g，加入25.0 mL乙腈、3 g氯化鈉，渦旋5 min后提取凈化，步驟同上。

1.4 儀器分析測(cè)定條件 液相色譜條件：使用Athena C18-WP 3.0 μm×2.1 mm×50 mm，柱溫為40℃，進(jìn)樣體積1 μL。流動(dòng)相為(A)0.1%甲酸水溶液和(B)乙腈，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相比例(V/V)為A∶B =20∶80。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：300℃；DL管溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣體流速：10 L/min；加熱氣流速：10 L/min。定性定量檢測(cè)參數(shù)(表1)。

表1 噻蟲嗪和噻蟲胺主要質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證 準(zhǔn)確稱取噻蟲嗪、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g(精確至0.000 1 g)，用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰柜中避光保存。為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本文采用農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域常用的基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法進(jìn)行定量分析[16]：分別用茶樹菇、菌棒的空白提取溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L的茶樹菇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液和0.004、0.008、0.02、0.04、0.2 mg/L的菌棒基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在空白茶樹菇、菌棒樣品中添加3 個(gè)水平的噻蟲嗪、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5 次?？瞻撞铇涔綐悠分刑砑铀綖?.01、0.05、0.10 mg/kg；空白菌棒樣品中添加水平為0.02、0.10、1.00 mg/kg，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評(píng)價(jià) 由表2可知，在線性范圍內(nèi)，噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇及其菌棒中的峰面積與其質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1、2)，R2均>0.999，能夠滿足本試驗(yàn)定量分析的要求。按照添加回收的最低濃度確定方法的定量限，則噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇和菌棒樣品上的定量限(LOQ)分別為0.01和0.02 mg/kg。

表2 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇和菌棒基質(zhì)中的線性方程、決定系數(shù)及定量限

圖1 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 噻蟲嗪、噻蟲胺在菌棒基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇、菌棒中的添加回收率結(jié)果(表3)。由表3可知：噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇上平均回收率為97%～100%、98%～101%，RSD 在0.7%～2.0%之間；菌棒平均回收率在96%～102%、97%～103%，RSD 在1.4%～4.2%之間。(圖3～圖8)分別為基質(zhì)空白、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及噻蟲嗪、噻蟲胺添加回收質(zhì)譜圖，其準(zhǔn)確度、精確度符合農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)的要求[17]。

2.2 消解動(dòng)態(tài) 結(jié)果表明(表4)，噻蟲嗪在茶樹菇上消解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，消解曲線為y= 0.058 3 e-0.392x(R2=0.615 3)，(圖9)；半衰期分別為1.77d，其噻蟲嗪的代謝物噻蟲胺在茶樹菇和菌棒中殘留量均<定量限。

表3 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇和菌棒中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖4 茶樹菇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖(噻蟲嗪0.1 mg/L +噻蟲胺0.1 mg/L)

圖5 茶樹菇添加回收樣品質(zhì)譜圖(噻蟲嗪0.1 mg/L +噻蟲胺0.1 mg/L)

圖6 菌棒基質(zhì)空白溶液質(zhì)譜圖

圖7 菌棒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖(噻蟲嗪1 mg/L +噻蟲胺1 mg/L)

圖8 菌棒添加回收樣品質(zhì)譜圖(噻蟲嗪1 mg/L +噻蟲胺1 mg/L)

表4 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇、菌棒上的消解動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)(mg/kg)

圖9 噻蟲嗪在茶樹菇中的消解動(dòng)態(tài)曲線

2.3 最終殘留結(jié)果 最終殘留試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(表5)表明，30%噻蟲嗪懸浮劑以90～135 g a.i./hm2的劑量，施藥2～3次，用藥3～10 d后，噻蟲嗪在茶樹菇中的殘留量< 0.01～0.018 mg/kg，在菌棒上段殘留量< 0.02～0.129 mg/kg，在菌棒中段和下段殘留量< 0.02 mg/kg；噻蟲嗪代謝物噻蟲胺在茶樹菇及菌棒中的殘留量均< 定量限，其典型最終殘留質(zhì)譜圖(圖10、11)所示。

表5 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇、菌棒上的最終殘留數(shù)據(jù)(mg/kg)

2.4 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 噻蟲嗪的ADI值為0.08 mg/kg b.w.，噻蟲胺的ADI值為0.1 mg/kg b.w.[18]。根據(jù)噻蟲嗪和噻蟲胺在中國(guó)登記使用情況[19]以及居民人均膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查數(shù)據(jù)[20]，結(jié)合本試驗(yàn)得到的殘留試驗(yàn)結(jié)果及茶樹菇實(shí)際生長(zhǎng)情況進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，選用采收間隔期3 d時(shí)噻蟲嗪HR值 0.018 mg/kg，噻蟲胺HR值 0.01 mg/kg，進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，噻蟲嗪和噻蟲胺在所有登記作物中的長(zhǎng)期膳食攝入評(píng)估(表6、7)，計(jì)算得出：一般人群噻蟲嗪的國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)為2.90 mg，占日允許攝入量(5.04 mg)的57.6%，噻蟲胺的國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)為0.67，占日允許攝入量(6.3 mg)的10.7%，<100%，不會(huì)對(duì)一般人群健康造成不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。目前，中國(guó)和CAC均尚未制定噻蟲嗪和噻蟲胺在茶樹菇中的MRL值。根據(jù)膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果和中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品及食品中農(nóng)藥最大殘留限量制定指導(dǎo)原則，結(jié)合施藥劑量和采收間隔期(3 d)的HR值，初步建議推薦噻蟲嗪在茶樹菇上登記使用安全間隔期為3 d，MRL值可暫定為0.05 mg/kg；噻蟲胺在茶樹菇上登記使用安全間隔期為3 d，MRL值可暫定為0.05 mg/kg(具體試驗(yàn)還需相關(guān)部門進(jìn)一步驗(yàn)證)。

圖10 噻蟲嗪、噻蟲胺在茶樹菇上的最終殘留質(zhì)譜圖(135 g a.i./hm2，施藥2次，用藥5 d取樣)

圖11 噻蟲嗪、噻蟲胺在菌棒上的最終殘留質(zhì)譜圖(135 g a.i./hm2，施藥2次，用藥10 d取樣)

表6 噻蟲嗪在所有登記作物中的長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定茶樹菇及其菌棒中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留的分析方法，方法的準(zhǔn)確性和精密度均達(dá)到殘留分析要求。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，噻蟲嗪在茶樹菇中半衰期分別為1.77 d，屬于易降解農(nóng)藥。由于施藥方式為噴霧，噻蟲嗪主要在菌棒頂端照耀，隨時(shí)間推移，未見由上至下淋溶現(xiàn)象，主要集中在菌棒上段。噻蟲胺在菌棒上段、中段和下段的殘留量均<定量限。

最終殘留試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪殘留主要集中在菌棒上段，最終殘留試驗(yàn)中茶樹菇上的殘留量較菌棒中的殘留量低。目前，噻蟲嗪在我國(guó)暫未制定最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)際食品法典委員會(huì)、美國(guó)、日本和韓國(guó)也沒有相關(guān)規(guī)定；歐盟規(guī)定噻蟲嗪在真菌上MRL為0.01 mg/kg[21]，本研究以30%噻蟲嗪懸浮劑在90～135 g a.i./hm2條件下，施藥2～3次，用藥10 d后噻蟲嗪在茶樹菇中的殘留量< 0.011 mg/kg，結(jié)果與之近似。

在實(shí)際生產(chǎn)中，食用菌作為小宗作物相應(yīng)的登記產(chǎn)品較少，農(nóng)戶使用未登記農(nóng)藥意味著沒有使用準(zhǔn)則，不知該如何科學(xué)使用這些農(nóng)藥。缺乏管理依據(jù)，無(wú)法判定安全性，對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說是潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。希望有關(guān)部門及農(nóng)藥企業(yè)盡快完善我國(guó)農(nóng)藥在食用菌上的登記及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定，為促進(jìn)小宗作物合理用藥、應(yīng)對(duì)技術(shù)性貿(mào)易壁壘提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐[22]。