龔娟芬 劉吉丹 房夢(mèng)園 蘇蒙 李偉光 何迎春

血管性癡呆（vascular dementia，VD）指因各種腦血管損傷導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶、計(jì)算能力、定向力等認(rèn)知功能嚴(yán)重下降的臨床綜合征[1]?，F(xiàn)用于改善VD 癥狀的藥物主要是多奈哌齊、加蘭他敏和美金剛等[2]，這些藥物療效有限，還可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如嘔吐、腹瀉、頭痛和高血壓等[3]。相比于單靶點(diǎn)化學(xué)藥物，中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在VD 的治療中發(fā)揮了積極的作用[4-5]。健脾填精方由人參、天麻、白術(shù)、巴戟天、石菖蒲、黃連、菟絲子等中草藥組成，能改善輕度認(rèn)知功能障礙患者的學(xué)習(xí)記憶功能，提高患者生活質(zhì)量[6]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，健脾填精方治療VD 的機(jī)制可能與減少大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷，維持海馬的線粒體膜電位和ATP 水平，改善線粒體功能障礙等相關(guān)[7]。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是尋找疾病生物標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)的新型手段[8]，能從分子層面分析中藥復(fù)方的作用機(jī)制。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選健脾填精方干預(yù)VD小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)一步對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為健脾填精方的臨床應(yīng)用及藥物藥理研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR 雄性小鼠40 只（無(wú)特定病原體，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g），由上海市計(jì)劃生育研究所動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部提供，動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK（滬）2018-0006，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2021-0012。所有小鼠提前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)房室溫為（22±2）℃，濕度為（63±2）%，光照為明/暗=12 h/12 h，噪音＜55 dB，自由進(jìn)食和飲水。所有程序均按照浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心指南進(jìn)行，并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)IACUC-20210906-12。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 自擬健脾填精方：人參9 g，天麻9 g，白術(shù)10 g，巴戟天6 g，石菖蒲6 g，黃連3 g，菟絲子12 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定。前期研究發(fā)現(xiàn)健脾填精方最佳劑量為14.4 g/（kg·d），按照人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值換算成小鼠的治療劑量為20.160 g/（kg·d），口服劑量為10 mg/（kg·d）[9]。本研究中健脾填精方顆粒劑（含有草藥55g）用約27.3 ml 0.9%氯化鈉溶液溶解，得到終濃度為2.016 g/ml的健脾填精方溶液。

1.3 主要試劑 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒（批號(hào)：P0012）和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：P0015F）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘乙酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：I1149-5G；甲酸（批號(hào)：A117）購(gòu)自德國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈（批號(hào)：1000304008）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；C18 分析柱（批號(hào)：WAT023590）購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 40 只小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥組15 只，模型組15 只，假手術(shù)組10 只。所有小鼠均用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，中藥組和模型組小鼠采用短暫雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法建立VD 模型[10]，經(jīng)頸正中切口顯露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈10 min，然后松開(kāi)10 min，重復(fù)3次，最后取下絲線縫合傷口。假手術(shù)組小鼠僅切開(kāi)皮膚，不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后連續(xù)3 d 予肌肉注射青霉素5 000 U/d 預(yù)防感染，用碘伏消毒傷口直至愈合。術(shù)后第7 天開(kāi)始給藥，中藥組給予10 ml/（kg·d）健脾填精方溶液灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。3 組小鼠均給藥28 d。

1.4.2 Morris 水迷宮試驗(yàn) 圓形逃生平臺(tái)位于第Ⅲ象限。3 組小鼠均訓(xùn)練4 d，將小鼠放置在不同象限內(nèi)自由游泳90 s，如果90 s 內(nèi)沒(méi)有到達(dá)安全平臺(tái)，則引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s。將小鼠從第Ⅲ象限以外象限的水池壁放入水中，記錄到達(dá)逃生平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，共持續(xù)測(cè)試5 d。撤去圓形逃生平臺(tái)，將小鼠從第Ⅰ象限的水池壁放入水中，記錄1 min 內(nèi)跨越第Ⅲ象限平臺(tái)次數(shù)和在第Ⅲ象限停留的時(shí)間。

1.4.3 3 組小鼠腦組織蛋白提取及肽段制備 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，將各組小鼠迅速斷頸處死，快速取腦。每組隨機(jī)選擇3 個(gè)腦組織樣本加入適量裂解液，超聲破碎，沸水浴10 min，14 000 r/min 離心15 min，留取上清液。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度[11]。取200 μg蛋白質(zhì)溶液根據(jù)過(guò)濾輔助樣品制備程序進(jìn)行酶解，酶解后的肽段采用C18 柱脫鹽，肽段凍干后加入40 μl 0.1%甲酸溶液，進(jìn)行肽段定量。

1.4.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析 采用NanoElute 系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以100%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到分析柱（IonOpticks，澳大利亞，25 cm×75 μm，C18 填料1.6 μm）分離，流速300 nl/min，持續(xù)90 min。進(jìn)行液相梯度分離：0～75 min，B 液線性梯度為2%～22%；75～80 min，B 液線性梯度為22%～37%；80～85 min，B 液線性梯度為37%～80%；85～90 min，B 液為80%。經(jīng)色譜分離后的樣品用TimsTOF Pro 質(zhì)譜儀的平行累積連續(xù)碎裂技術(shù)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4.5 蛋白質(zhì)鑒定和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 收集TimsTof pro高分辨率質(zhì)譜儀質(zhì)譜數(shù)據(jù)，肽段離子得分＞60 分表示結(jié)果可信。7～20 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽段被認(rèn)為符合胰蛋白酶解和高能碎裂的規(guī)律。大部分蛋白對(duì)應(yīng)兩個(gè)以上肽段，表示蛋白質(zhì)定量結(jié)果可信。將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Maxquant 軟件（版本號(hào)1.6.17.0），采用非標(biāo)記定量（label free quantitation，LFQ）算法[12]對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，以差異倍數(shù)＞1.200 或＜0.833、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白。

1.4.6 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 通過(guò)http://www.bioinformatics.com.cn/在線軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析。運(yùn)用http://geneontology.org/進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析。通過(guò)http://www.kegg.jp/進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用Levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析，方差不齊采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及Morris 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果 手術(shù)時(shí)，中藥組和模型組各有3 只小鼠死亡；給藥期間中藥組和模型組各有2 只小鼠死亡。手術(shù)結(jié)束后，除假手術(shù)組，其他兩組小鼠均出現(xiàn)精神倦怠、納食減少和行動(dòng)緩慢等現(xiàn)象。隨試驗(yàn)進(jìn)行，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短；第2～5 天，與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.01）。試驗(yàn)第6 天，與假手術(shù)組相比，模型組和中藥組跨越平臺(tái)次數(shù)和停留在第Ⅲ象限的時(shí)間均顯著減少（均P＜0.01）；與模型組相比，中藥組1 min 內(nèi)跨越第Ⅲ象限平臺(tái)次數(shù)和在第Ⅲ象限停留的時(shí)間均顯著增加（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2 差異蛋白的鑒定結(jié)果 質(zhì)譜分析共得到蛋白質(zhì)二級(jí)譜圖數(shù)841 588 個(gè)，有效譜圖數(shù)393 081 個(gè)；鑒定到的肽段總數(shù)52 206 條，特異性肽段數(shù)50 097 條，鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)5 236個(gè)。蛋白質(zhì)肽段長(zhǎng)度多為8～19 kD，處于合理范圍內(nèi)，約70%的肽段得分＞60分，大部分蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)1個(gè)以上的特異性肽段，說(shuō)明結(jié)果精確可信。

2.3 差異蛋白的表達(dá)情況 3 組共篩選出152 個(gè)差異蛋白，其中模型組與中藥組間65 個(gè)，包括表達(dá)上調(diào)蛋白39 個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白26 個(gè)；模型組與假手術(shù)組間53個(gè)，包括表達(dá)上調(diào)蛋白32 個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白21 個(gè)。聚類分析結(jié)果顯示，在模型組中上調(diào)或下調(diào)的蛋白，在假手術(shù)組、中藥組中表達(dá)相反，可見(jiàn)差異表達(dá)的蛋白可以有效地區(qū)分各組，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

圖1 差異蛋白表達(dá)的聚類熱圖

2.4 GO 富集分析 模型組和中藥組間的差異蛋白主要涉及血漿脂蛋白的清除、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、突觸膜粘附、神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、氮化合物代謝等生物過(guò)程；差異蛋白主要位于胞內(nèi)體、質(zhì)膜外側(cè)、突觸前膜等位置，與膽固醇結(jié)合、蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、酶活性等分子功能相關(guān)，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

圖2 GO 富集分析（A：生物過(guò)程分析；B：細(xì)胞組分分析；C：分子功能分析）

2.5 KEGG 富集分析和PPI 分析 KEGG 富集分析結(jié)果顯示，模型組和中藥組間的差異蛋白涉及維生素消化和吸收、丙酮酸代謝、谷氨酸突觸、代謝通路、神經(jīng)退行性變通路等信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。將模型組與中藥組之間的差異蛋白導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)中共有55個(gè)節(jié)點(diǎn)，128條邊。主要差異蛋白質(zhì)有參與谷氨酸突觸信號(hào)通路的代謝性谷氨酸受體2（metabotropic glutamate receptor 2，Grm2），與氧化磷酸化相關(guān)的細(xì)胞色素c 氧化酶亞基7C（cytochrome c oxidase subunit 7C，Cox7C），調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的蛋白偶聯(lián)鋅反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Slc30a1（proton-coupled zinc antiporter Slc30a1，Slc30a1）也在其中，見(jiàn)圖4。使用Cytoscape 3.9.1 軟件的cytoHubba 插件可篩選出關(guān)鍵蛋白，關(guān)鍵蛋白為差異表達(dá)基因集合中具有最強(qiáng)調(diào)控作用的基因，見(jiàn)圖5。

圖3 KEGG 通路富集結(jié)果（A：通路分類圖；B：KEGG 富集點(diǎn)線圖）

圖5 關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

VD 是一種復(fù)雜的腦部疾病，腦血管損傷導(dǎo)致腦灌注減少可能是VD 的潛在機(jī)制。研究認(rèn)為，腦灌注減少時(shí)，氧氣和能量供應(yīng)減少，直接導(dǎo)致線粒體功能障礙和離子失衡，之后神經(jīng)興奮性毒性、氧化應(yīng)激等分子機(jī)制被激活[13]。Olloquequi 等[14]認(rèn)為，興奮性谷氨酸受體過(guò)度激活引起神經(jīng)元功能障礙或死亡，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于興奮性毒性狀態(tài)，這可能與VD 的發(fā)病相關(guān)。差異蛋白Grm2 可降低由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的興奮性毒性，減少神經(jīng)元死亡，改善認(rèn)知功能[15]。健脾填精方減輕興奮性毒性的作用機(jī)制可能與活性成分人參皂苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮性毒性而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)和增強(qiáng)認(rèn)知的作用[16]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可通過(guò)抑制半胱天冬酶信號(hào)通路，減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

缺氧條件下，線粒體功能障礙可引發(fā)能量代謝異常，活性氧與抗氧化劑之間的平衡被打破，自由基增多，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，這可能是VD 發(fā)病的原因之一[18]。差異蛋白Cox7C 能夠促進(jìn)ATP 合成，減少線粒體功能障礙的發(fā)生，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。健脾填精方減輕氧化應(yīng)激的作用機(jī)制可能與活性成分白術(shù)內(nèi)酯、巴戟天低聚糖有關(guān)。白術(shù)內(nèi)酯可減少活性氧形成，減輕氧化損傷，增加記憶相關(guān)蛋白，如突觸素I 和蛋白激酶C 的表達(dá)，從而改善記憶能力[20]。Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天低聚糖可抑制癡呆模型大鼠海馬CA1 腦區(qū)、皮質(zhì)和前腦基底核神經(jīng)元細(xì)胞減少，增強(qiáng)抗氧化能力并防止自由基損傷，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組小鼠腦組織中Grm2、Cox7C 表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明健脾填精方可能通過(guò)減輕神經(jīng)系統(tǒng)興奮性毒性、抗氧化應(yīng)激和減輕線粒體功能障礙從而發(fā)揮改善VD 的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化可能是VD 發(fā)生的原因之一，鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶可溶性亞基α-3（guanylate cyclase soluble subunit alpha-3，Gucy1a3）能防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[22-23]。Gucy1a3 編碼可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的α1 亞基，可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶復(fù)合體是一氧化氮受體，可催化環(huán)狀鳥(niǎo)苷3'，5'-單磷酸酯（Guanosine-3'，5'-cyclic monophosphate，cGMP）的形成，cGMP 可調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、松弛血管平滑肌細(xì)胞和抑制血小板聚集等生理過(guò)程[24]。健脾填精方中的黃連素是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，可改善動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷[25]。經(jīng)健脾填精方干預(yù)的小鼠腦組織中Gucy1a3 表達(dá)上調(diào)，而模型組小鼠腦組織中Gucy1a3 的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明健脾填精方可能通過(guò)上調(diào)Gucy1a3 的表達(dá)，發(fā)揮防治VD 的作用。

腦缺血時(shí)，突觸活動(dòng)增強(qiáng)引起鋅離子（Zn2+）釋放增加，細(xì)胞內(nèi)高水平的Zn2+可對(duì)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞快速死亡[26]。差異蛋白Slc30a1 參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的過(guò)程。Slc30a1 是Zn2+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)增多可降低神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平，使其免受Zn2+中毒的影響，維持Zn2+穩(wěn)態(tài)，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡[27]。天麻的主要生物活性成分天麻素可以抑制Zn2+誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受Zn2+的毒性影響和氧化應(yīng)激損傷[28]。經(jīng)健脾填精方治療的VD 小鼠腦組織Slc30a1 水平明顯增加，證實(shí)了健脾填精方可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)，保護(hù)神經(jīng)元。

除人參皂苷、白術(shù)內(nèi)酯、巴戟天低聚糖類、黃連素、天麻素等活性成分外，健脾填精方中還可能存在其他活性成分，但是否對(duì)改善VD 有利還需進(jìn)一步證實(shí)?？傊?，健脾填精方對(duì)小鼠腦組織蛋白的影響可能涉及Grm2、Cox7C、Gucy1a3、Slc30a1 等關(guān)鍵蛋白，通過(guò)減輕興奮性毒性、抗氧化應(yīng)激、減輕線粒體功能障礙、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)等途徑，起到改善VD 的作用。